|
|
324_Микробиология Воробьев Я.Г. Радиоиммунный анализ(риа) Выполнил студент 324 группы лф
Радиоиммунный анализ(РИА) Выполнил студент 324 группы л/ф Воробьев Я.Г Радиоиммунный анализ - Метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами.
- Данный метод был разработан Розалин Сасмен Ялоу и Соломоном Берсоном в 50-х годах ХХ века, а широкое признание приобрел в 80-е годы. Радиоиммуному анализу до сих пор нет 100% альтернативы, поскольку исследование обладает очень высокой чувствительностью и специфичностью. Еще одно преимущество метода, о котором говорят специалисты, - это возможность автоматизации и стандартизации, а также получение ответов в цифровом выражении.
Где применяют Ученые, открывшие радиоиммунный анализ, с его помощью изучали клиренс инсулина у больных диабетом, поэтому первоначально его применяли для измерения концентрации инсулина в плазме крови. Однако чем больше последующие поколения ученых изучали РИА, тем он становился популярнее и востребованнее. Спектр применения РИА: - измерения концентрации самых разных гормонов и негормональных веществ;
- диагностируют заболевания эндокринной и сердечно-сосудистой систем;
- определения маркеров опухолей и контроля эффективности лечения при онкологических диагнозах;
- для установления причин бесплодия у женщин и мужчин;
- выявляют «невидимые» для других методов нарушения развития плода;
- определяют концентрацию в крови ферментов, иммуноглобулинов и лекарственных веществ.
Проведение(РИА) - 1. Готовят серии из 10 стандартных разведений немеченого антигена Ф1 в 1 мл разводящего буфера от 20 пг/мл до 20 нг/мл.
- 2. В двойной ряд пластиковых пробирок разливают по 100 мкл стандартных растворов немеченого антигена каждого разведения.
- 3. Вносят по 100 мкл субстрата, который предполагается исследовать в РИА, но заведомо не содержащего антигена Ф1 и антител к нему. Кроме того, готовят двойной ряд пробирок, содержащих свободный от антигена Ф1 субстрат без стандартного антигена Ф1; одна пара этих пробирок служит в качестве «холостой пробы» (BLAN), а другая — в качестве «нулевого стандарта» пробы с максимальным связыванием меченого антигена (REFR), а в остальные дублированные пробирки разливают по 100 мкл исследуемого материала.
- 4. В каждую пробирку приливают по 100 мкл иммунной сыворотки к антигену Ф1 в рабочем разведении. В «холостые пробы» (BLAN) вместо иммунной сыворотки добавляют по 100 мкл буфера.
- 5. Пробирки инкубируют в течение 18 ч при 4 °С (1-я инкубация).
- 6. В каждую пробирку добавляют по 20 мкл раствора меченого антигена Ф1, разбавленного разводящим буфером точно так же, как при построении кривой разведения сыворотки. Для определения общей радиоактивности одну пару пробирок заполняют только раствором, содержащим меченый антиген (ТОТА).
- 7. Инкубируют в течение 6 ч при 37 °С (2-я инкубация).
- 8. Во все пробирки (за исключением ТОТА) добавляют по 100 мкл 20%-й суспензии стафилококков и проводят дальнейшую обработку (см. построение кривой разведения сыворотки).
- 9. Просчитывают радиоактивность осадка во всех пробах за 60…120 с.
- 10. Вычисляют среднее значение счетности из каждых двух параллельных проб.
- 11. Из средней величины счетности проб со стандартными разведениями немеченого антигена REFR и проб с исследуемыми образцами высчитывают среднюю величину счетности контроля BLAN.
- 12. Вычисляют иммунологическую активность меченого антигена аналогично методу, описанному ранее. Для этого величину счетности делят на величину счетности ТОТА. Если эта величина приближается к величине стандартной калибровочной, то это свидетельствует о правильности проведения анализа.
- 13. По результатам, полученным при исследовании стандартов, строят график, откладывая по оси ординат процент связанной метки, а по оси абсцисс — логарифм концентрации стандартного антигена. При этом за 100 % принимают пробы с наибольшим связыванием (REFR).
- 14. Рассчитывают количество антигена Ф1 в исследуемых образцах.
- Результаты исследования неизвестного образца сравнивают со стандартной калибровочной кривой и путем экстраполяции вычисляют количество искомого антигена, содержащегося в пробе.
Есть ли перспективы у метода? - Сотрудники Квинслендского института медицинских исследований предложили методику, с помощью которой можно узнать, насколько эффективно проходит лечение рака. Специалисты утверждают, что в перспективе еще одной широкой областью применения метода в ближайшее время станет определение вирусов. Активно ведутся исследования в этом направлении, дающие первые обнадеживающие результаты.
Спасибо за внимание! |
|
|
Скачать 111.12 Kb.