Микробиология. ответы по микре. 1. Какие различают формы бактерий Опишите
 Скачать 140.53 Kb.
|
|
42. Оценка результатов первичного посева по культуральным признакам. Это 2 этап идентификации ЧК. Морфология микробных колоний является наиболее информационным культуральным признаком. Колонии различают: по величине (крупные – 4-5мм, средние – 2-4мм, малые – 1-2мм и мельчайшие - <1мм), по форме (круглые, розеткообразные, листовидные, амебовидные, складчатые, ризоидные и т.д.), по цвету – цвет колонии зависит от пигмента (белый, желтый, красный, сине-зеленый, зеленый, сиреневый и пр.), по прозрачности (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные), по консистенции (сухие, сочные, слизистые, пастообразные), по поверхности колонии (гладкая, морщинистая, исчерченная, плоская, выпуклая, вдавленная, блестящая, матовая), по краю колонии (ровный, волнистый, бахромчатый, зазубренный), по структуре колонии (аморфная, зернистая, волокнистая). Многие виды бактерий также в процессе роста на питательной среде выделяют продукты метаболизма, обладающие определенным запахом. В жидких питательных средах могут образовываться пленки и осадок в процессе жизнедеятельности бактерий. Для оценки результатов первичного посева исследуемого материала, чашки с посевом осматривают и изучают морфологию выросших колоний, затем готовят мазки и окрашивают по Граму и микроскопируют. Материал из изолированной колонии пересеивают в отдельные пробирки со скошенным агаром/другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засеивают штрихом на скошенную поверхность агара. 43. Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред «пестрого ряда». Классический метод идентификации микробов по биохимическим признакам заключается в посеве ЧК на дифференциально-диагностических средах, содержащих определенные субстраты, с целью оценки способности МО ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследование занимает не менее суток. Применяют: оценку сахаролитической активности бактерий (способность сбраживать углеводы и многоатомные спирты с образованием кислоты и газа или только кислоты) с помощью посева на среду Гисса – короткий и длинный «пестрый» ряд. Короткий «пестрый» ряд включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза). Длинный «пестрый» - наряду с перечисленными вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиоза, рамноза и пр.) и спиртами (глицирин и пр.). Для оценки способности ферментации углеводов в среду добавляют индикатор (реактив Андреды и пр.), позволяющий выявлять образование кислых продуктов расщепления (органических кислот) и поплавок – для обнаружения выделения газа. ЧК исследуемого МО засеивают петлей в среду пестрого ряда, посевы инкубируют при температуре 37С в течение 18-24ч. Если бактерии ферментируют углероды до образования кислых продуктов, то наблюдается изменение цвета среды, при разложении до кислоты и газообразных продуктов наряду с измененным цветом появляется пузырек газа в поплавке; если используют среду с полужидким агаром, то образование газа регистрируют по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. 44. Определение протеолетических ферментов при идентификации бактерий. Для определения протеолитической ферментации (разложение белка) проводят посев уколом в столбик 10-20% желатина и пептонную воду. Инкубируют при 20-22С в течение нескольких дней. При наличии ферментации желатин разжижается бактериями. В посевах в пептонную воду определяют продолжительность расщепления аминокислот после инкубирования в течение 2-3сут при 37С путем постановки реакций на аммиак, индол и сероводород. Реакция на аммиак: узкую полоску лакмусной бумаги укрепляют над пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой, посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака. Реакция на индол способом Эсмарха: в пробирку с культурой бактерий добавляют 2-3мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эсмарха в присутствии индола (С8H7N), наблюдается розовое окрашивание. При осторожном наслаивании – розовое кольцо. Реакция на сероводород: в пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтрованной бумаги, смоченной сульфатом железа. При выделении сероводорода образуется нерастворимый сульфид железа, окрашивающий бумагу в черный цвет. 45. Получение изолированных колоний путем механического разобщения микробов при посеве. Материал из изолированной колонии каждого типа пересеивают в отдельные пробирки со скошенным агаром/другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засеивают штрихом на скошенную поверхность агара. Для выделения и накопления ЧК выбирают колонии только тех бактерий, которые присутствуют в исследуемом материале. 46. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузным методом. Данный метод определения чувствительности основан на способности антибактериального препарата диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост МО, посеянных на поверхности агара. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста МО вокруг дисков. Результат учитывается по величине диаметра, измеренной в мм. Важна толщина агара (4мм); диаметр чашки Петри-90мм, если вносится 20мл агара, диаметр чашки Петри 100мм, если вносится 25мл агара, диаметр 150мм, если вносится 60мл. Чашку следует располагать на строго горизонтальной поверхности. После заполнения чашки, отстаивают при комнатной температуре для застывания. Перед инкубацией необходимо отследить отсутствие конденсата. Для определения чувствительности стоит использовать только стандартные качественные диски. Для инокуляции приготовленных чашек с агаром используют 2 способа: 1) использование стерильных влажных тампонов; 2) инокулюм наносят пипеткой на поверхность чашки Петри. После окончательной инкубации чашку помещают кверху дном на темную матовую поверхность, чтобы свет падал под <45°. Для определения зон задержки роста пользуются штангоциркулем, оббращают внимание только на зону полного подавления видимого роста. 47.Микробное число воды, как его определяют? Микробное число воды – количество микроорганизмов в 1 мл. Для его определения берут пробу: из крана набирают 500мл в стерильные колбы с ватной пробкой, кран предварительно стерилизуют горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10мин спускают воду и только потом берут пробы. Воду из водоемов берут с глубины 10-15 см. Пробы исследуют не позднее 2ч с момента взятия. Если невозможно, то хранят не более 6ч при температуре +1, +5С в холодильнике. Водопроводную воду засеивают в объеме 1мл, из открытых водоемов – 1, 0,1, 0,01мл. Пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10-12мл расплавленного агара, перемешивая тщательно с водой. Посевы инкубируют в течение 1-2сут при температуре 37С. Воду из водоема засеивают одновременно в 2е чашки Петри, одна из которых инкубируется при температуре 37С сут, а другая при температуре 20С – 2е сут. 48. Опишите сущность реакции агглютинации. Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфическое антигену антитело, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование глыбок, комочков, хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок – агглютинат, жидкость над ним просветляется. Характер агглютинации зависит от антигенного строения микробной клетки (т.е. антигена). Если антигеном является неподвижная взвесь бактерий, имеющих только соматические О-антигены, то образуется мелкозернистый осадок. Если антигеном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики, и в агглютинации участвует еще и жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат. В вет. Практике РА используют для выявления бруцеллеза, листериоза, вибриоза, сальмонеллеза, лептоспироза и др. 49. Опишите принцип действия серологических реакций. В основе всех серологических исследований лежит специфическая реакция между АГ и АТ. В серологических реакциях, применяемых для диагностических целей, один из компонентов должен быть известен, по которому ввиду специфичности определяют наличие другого компонента. Например, если взять заведомо известный АГ (сапной, бруцеллезный и пр.) и с ним исследовать сыворотки крови от животных, то положительный результат реакции с данным АГ указывает на наличие в сыворотке соответствующего АТ, что говорит о том, что животное больно. И наоборот, при наличие специфической сыворотки (гипериммунная сибиреязвенная, колибактериозная и др.) определяют видовую принадлежность возбудителя боблезни. 50. Постановка РА пробирочным методом. Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции производят соответствующие степени разведения сывороток. Для этого берут ряд пробирок, куда предварительно внесен физраствор в объеме 1 мл. В первую пробирку вносят 1мл сыворотки крови и получают разведение 1:1, из нее отбирают 1мл и вносят во 2ю и получают разведение 1:2, затем в третью, получая 1:3 и т.д. из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки. Затем во все пробирки добавляют по 2 капли стандартного АГ или приготовленной бактериальной взвеси(10млрд в 1мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4-6ч при 37С, а затем при комнатной температуре 14-16ч. Для контроля АГ в 1мл физ.раствора добавляют 2 капли антигена для исключения самоагглютинации. Учет РА осуществляется невооруженным глазом или с помощью агглютиноскопа, начиная с контрольных пробирок. Результат выражают количеством крестов: ++++ - полное просветление жидкости, образовавшийся агглютинат имеет вид перевернутого зонтика, при встряхивании образует глыбки, хлопья, жидкость прозрачная остается (положительная степень проявления агглютинации); +++ - неполное просветление жидкости, агглютинат в виде зонтика, при встряхивании образуются более мелкие глыбки, комочки (положительная степень проявления агглютинации); ++ - неполное просветление жидкости, агглютинат в виде зонтика, при встряхивании разбивается на хлопья разной величины, жидкость мутная (сомнительная степень проявления агглютинации); + - наличие небольшого характерного осадка в виде «пуговки», жидкость над ним мутная. При встряхивании осадок разбивается, жидкость мутнеет больше (отрицательный результат); - - вся жидкость мутная, на дне пробирки небольшой осадок АГ с ровными краями в виде «пуговки», при встряхивании разбивается в равномерную муть (отрицательный результат). 51. Постановка кольцевой пробы с молоком. В основном используют при обследовании КРС на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинационные пробирки набирают 2-3мл свежего цельного молока и добавляют АГ (окрашенный гематоксилином) по 0,2мл (2 капли). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания молока, выдерживают в водяной бане (или термостате) при 37С в течение 45-60мин. При наличии в молоке АТ образуется комплекс АГ-АТ, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается. Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего молока в пробирке и слегка желтоватым слоем сливок. 52. Постановка реакции кольцепреципитации. Данная реакция основана на том, что при соединении растворимого АГ (преципитиногена) со специфическими АТ (преципитинами), находящимися в соответствующей сыворотке, образуется осадок – преципитат. Для диагностики сибирской язвы используют реакцию кольцепреципитации по Асколи. Для постановки реакции кольцепрепицитации нужна специфическая преципитирующая сыворотка биофабричного производства. АТ в РП служит фильтрат живой или убитой нагреванием микробной культуры или экстракт из исследуемого материала. Экстрагирование производят либо кипячением, либо длительным (18-24ч) воздействием физ.раствора NaCl при комнатной температуре. Экстракт фильтруют через асбестовую вату до полной прозрачности. В узкие пробирки Уленгута дм 4мм пастеровской пипеткой вносят 0,3-0,4мл сыворотки. Одновременно ставят в 6 пробирках контрольные реакции. АГ осторожно добавляют (наслаивают) по стенке пробирки, не касаясь пипеткой сыворотки. Пробирку держат вертикально. Для того, чтобы предотвратить смешивание компонентов, пипетку с сывороткой опускают на дно пробирки и осторожно выпускают сыворотку в том же объеме, что и АГ. При положительном результате на границе 2х жидкостей почти сразу/в течение 1-2мин образуется резко ограниченное беловатое кольцо/диск – преципитат. 53.Опишите сущность реакции нейтрализации. Используют для определения видовой принадлежности бактерийных токсинов в исследуемом материале и для установления активности антитоксических сывороток. В пробирки с равным количеством АГ добавляют равный объем убывающего количества (убывающей концентрации) специфической гипериммунной антитоксической сыворотки; пробирки перемещают в термостат на 1-2ч. Затем из каждой пробирки смесь токсин-антитоксин вводят лабораторным животным (по 2 жив. На каждую смесь). Животные, которым ввели смесь, где прошла нейтрализации токсина, остаются живыми. Наименьшее количество сыворотки, нейтрализовавшее токсин, принимается за единицу активности антитоксической сыворотки (АЕ). Реакцию нейтрализации используют в вирусологии. 55. Опишите строение механической части микроскопа. Механическая система микроскопа предназначена для размещения образцов (предметный столик), управления оптикой (фокусировочный механизм, револьверное устройство, окулярная трубка) и соединения всех элементов оптического прибора (штатив, основание). Предметный столик – механическая часть микроскопа, на которую кладут образцы для исследований. На нем могут быть установлены препаратодержатели или препаратоводитель. В первом случае «лапки» столика надежно фиксируют микропрепарат на одном месте, во втором – специальные линейки позволяют измерять образцы и перемещать образец по предметному столику. Фокусировочный механизм предназначен для настройки резкости изображения. С его помощью объектив микроскопа можно отдалять от предметного столика или приближать к нему. Шаг фокусировки зависит от уровня оптического прибора: в любительских он больше, в профессиональных – меньше. За смену увеличений отвечает револьверное устройство. В него устанавливаются объективы разной кратности, что позволяет регулировать мощность оптики прямо во время наблюдений. Остальные элементы механики в большей степени предназначены для удержания и соединения в одно целое всей конструкции.  56. Приготовление нативных препаратов для прижизненного изучения МО. 1) Метод «висячей» капли: препарат готовят на покровном стекле, в центр кторого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна/края. Для микроскопии вначале используют объектив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и исследуют препарат. Определяют подвижность бактерий. 2) Метод «раздавленной» капли: на поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала/суспензию бактерий и покрывают покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. 58. Какие пороки молока могут быть при развитии различных МО? 1) горький вкус – обеспечивают гнилостные и мезофильные аэробные бактерии; 2) прогорклый вкус – связан с разложением жира флюорисцирующими и психрофильными бактериями, некоторыми видами кишечных бактерий, клостридий и дрожжей; 3) несоответствующий вкус и запах (навозный, гнилостный, затхлый) – итог развития разнообразных МО; 4) бродящее молоко – результат жизнедеятельности различных бактерий, но чаще клостридий; 5) тягучее, слизистое молоко – размножение особых слизнеобразующих бактерий, чаще всего бацилл; 6) красный цвет – придает обильное размножение чудесной палочки, продуцирующей красный пигмент; 7) синий/голубой/желтый цвет – продукт жизнедеятельности бактерий, продуцирующий соответствующего цвета пигмент; 8) травянистый вкус – придают размножившиеся мицелиальные и безмицелиальные грибы; 9) привкус свеклы – придают флюорисцирующие бактерии; 10) привкус мыла – результат жизнедеятельности гнилостных, пептонизирующих или аммикообразующих бактерий; 11) капустный запах – интенсивное обсеменение молока бактериями кишечной группы и псевдомонад; 12) запах масляной кислоты – результат размножения клостридий. 59. Пастеризация и стерилизация молока, для чего и как проводят? Пастеризация – обеззараживание молока осуществляется при температуре 63-95С. В зависимости от микробной контаминации и цели использования молока применяют следующие режимы пастеризации: 1) длительная – позволяет сохранить все основные свойства молока, 63-65С, 30 минут; 2) кратковременная – 72-74С, 15-20сек; 3) моментальная – 85-87С без выдержки. Пастеризация в более высоких температурах бывает в случае обнаружения туберкулеза на ферме, а также при дальнейшем использовании молока для получения молочнокислых продуктов. Стерилизация – обеззараживание молока и молочных продуктов при температуре свыше 100С. При стерилизации погибают споровые и бесспоровые бактерии. Может осуществляться при температуре 120-140С в течение 2-10сек, длительная – при 115С в течение 15-20мин. 60. Сущность ИФА Это метод выявления АГ с помощью соответствующих им АТ, конъюгирующих с ферментом-меткой (пироксидаза хрена, щелочная фофотаза). После соединения АГ с меченной ферментом сывороткой, в смесь добавляют субстрат хромоген. Он расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции. Интенсивность окраски прямопропорциональна количеству связавшихся молекул АГ и АТ. В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста, анализ обозначается как ИФА, РИА и т.д. Если реакция проводилась с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный. Компоненты добавляют в лунки планшета путем внесения меченных АГ или АТ. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления компонента, из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты. При определении АТ в лунки планшета с сорбированным АГ последовательно добавляют сыворотку крови больного, далее – антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и субстрат хромогена. Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1) стадия узнавания тестируемого АГ специфичным к нему АТ, что ведет к образованию иммунного комплекса; 2) стадия формирования связи конъюгата с ИК или со свободными местами связывания; 3) стадия превращения ферментной метки в регистрационный сигнал. |