колок (микра 10. 1. Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней бактериоий, бактериологический, биолог, серол, аллерг и собственно иммунный. Их достоинства и недостатки
 Скачать 0.7 Mb.
|
|
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ в исследуемом материале обнаруживают нуклеотидные последовательности ДНК возбудителя. К ним относятся метод ДНК-гибридизации и полимеразная цепная реакция. Метод ДНК- г и б р и д и з а ц и и основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК возбудителя достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют ДНК-зонды. Это лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомого возбудителя. Зонд метят либо радиоактивным изотопом, либо ферментом. В последнем случае для регистрации включения ДНК-зонда в ДНК бактерий, содержащуюся в исследуемом материале, к пробе добавляют субстрат, соответствующий использованному ферменту. Положительная реакция субстрат-фермент проявляется в изменении окраски субстрата и свидетельствует о соответствии ДНК-зонда ДНК возбудителя, находящейся в исследуемом материале. Чувствительность метода уступает ПЦР (103 микроорганизмов в пробе), что ограничивает его применение как диагностического теста, тем более что аналогичную чувствительность имеют иммунологические методы, выявляющие микробные антигены. По л и ме р а з н а я ц е п н а я р е а к ц и я (ПЦР) представляет собой метод направленной амплификации (воспроизведения) ДНК, позволяющий найти в исследуемом клиническом материале небольшие участки генетической информации любого организма и многократно размножить их. Для реализации ПЦР создают набор праймеров - фрагментов ДНК, являющихся маркером данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшийся двунитевой стартовый участок воспроизводится с помощью фермента Taq-полимеразы, входящей в набор для ПЦР. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и т. д. Это и есть цепная реакция. В течение нескольких часов происходит 30-40 циклов амплификации. В результате амплификации количество копий специфической нуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в 106-108 раз, что обеспечивает высокую чувствительность метода. Преимущества молекулярно-генетических методов диагностики состоят в их высокой специфичности и чувствительности. Они позволяют обнаруживать в исследуемом материале единичные клетки возбудителя. ПЦР имеет три технологические стадии: ❖ выделение и экстракция ДНК (пробоподготовка); ❖ амплификация; ❖ регистрация результатов амплификации. Вторая стадия ПЦР — циклическая амплификация — протекает поэтапно при определённой температуре реакционной смеси. Образовавшиеся в каждом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов, при этом число копий ДНК нарастает в геометрической прогрессии (2n, где n — число прошедших циклов амплификации). Описанные процессы протекают в термоциклере — программируемом термостате, по заданной программе осуществляющем смену температур согласно числу циклов шплификации. Схема цикла полимеразной цепной реакции: 1 — нативная двухцепочечная ДНК; 2 — денатурация ДНК при температуре 94 °С; 3 — гибридизация (присоединение праймеров при температуре 55⁰ С); 4 — синтез комплементарной цепи ДНК при температуре 72 ⁰С, образование двухцепочечной ДНК. Визуализацию результатов ПЦР осуществляют электрофоретическим разделением продуктов реакции в агарозном геле или методом гибридизации ампликонов с комплементарным к определяемой последовательности олигонуклеотидным зондом, меченным флюоресцентной, ферментной или другой меткой. Принципиально новое направление развития регистрационных систем — использование оптических биосенсоров, позволяющих определять в ходе гибридизации в реальном режиме времени пикограммовые количества фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на поверхности оптической кюветы. Достоинства ПЦР: - высокая чувствительность метода, позволяющая определять 10-1000 клеток впробе; - высокая специфичность — в исследуемом материале выявляют уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК; - универсальность процедуры выявления различных возбудителей, что даёт возможность диагностировать несколько возбудителей в одной биопробе; - высокая скорость анализа — унифицированная обработка биоматериала и детекция продуктов реакции, а также автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 ч; - возможность проводить количественный анализ и определять число копий специфических последовательностей нуклеотидов в пробе, контролируя таким образом вирусемию или бактериемию (например, вирусную нагрузку при вирусных гепатитах или ВИЧ-инфекции); - возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. ПЦР можно эффективно использовать для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, её использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Метод ПЦР имеет свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Высокая чувствительность ПЦР создаёт опасность получения ложноположительных результатов за счёт минимальных загрязнений ДНК окружающей среды лабораторий, регулярно выполняющих однотипные исследования. Это формирует строгие требования к режиму проведения анализа. 3.Условно-патогенные микроорганизмы, их общая характеристика. Условия возникновения гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Методы микробиологической диагностики. Условно-патогенные микроорганизмы – это большая группа микроорганизмов, которые в норме никаких заболеваний у человека не вызывают. Патогенное действие их на организм человека они оказывают при проникновении во внутреннюю среду организма в большом количестве или резком снижении иммунобиологической резистентности, или заноса их вдругую экологическую нишу. Большинство видов условно-патогенных микробов являются нормальными обитателями кожи и слизистых оболочек тела человека, составляя его нормальную микрофлору, не оказывая на организм человека патогенного влияния. В последние годы в этиологии гнойно-воспалительных заболеваний значительно возрос удельный вес заболеваний вызываемых условно-патогенными грамотрицательными микроорганизмами, в особенности синегнойной палочкой, капсульной палочкой, протеями и кишечной палочкой. Условия, способствующие реализации патогенного потенциала условно-патогенными бактериями: • Снижение уровня иммунной защиты • Смена биотопа • Увеличение количества (концентрации) микроорганизмов в биотопе Исходя из данных условий, условно-патогенные микроорганизмы, как правило, являются причиной госпитальных инфекций, входящих в структуру внутрибольничных инфекций. Особенностью бактериологического исследования патологического материала, содержащего нормальную микрофлору (молоко, моча, мокрота) при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных условно-патогенными бактериями, является использование количественных методик. Данные методики разработаны для всех видов патологического материала и позволяют учитывать количество (концентрацию) выделенных микроорганизмов. Концентрация условно-патогенных микроорганизмов в патологическом материале позволяет рассматривать их в роли возбудителя. 4.Синегнойная палочка, классификация ее свойства, факторы патогенности, токсины и ферменты. Заболевания, вызываемые синегнойной палочкой, лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и терапия, рациональная антибиотикотерапия. Род pseudomonas Условно патогенная флора, палочка, имеет слегка изогнутую форму имеет жгутики, пили, спор не образует, способность образовывать капсулоподобную оболочку, хорошо растет на простых питательных средах на твердых колонии сине-зеленоо цвета на жидких серо- серебристого.строгий аэроб, сахоролитически малоактивна хорошо выражена протеолитическая способность. АНТИГЕНЫ: ОБЛАДАЕТ: О и Н антигенами по О антигену разделена на серовары. ПАТОГЕННОСТЬ: вирулентность обеспечена гликопротеидной капсулоподобной оболочкой белками наружной клеточной стенки которые участвуют в адгезии. ЭКЗОТОКСИН А-термальный белок угнетает иммуногенез. МЕМБРАНОТОКСИНЫ-гемолизин 1, гемолизин 2 приводят к гемолизу эритроцитов. ЛЕЙКОЦЕДИН-лизирует лейкоциты. Продуцирует нейроминидазу. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГОСТИКА: бактериологический ЛЕЧЕНИЕ: вакцины нет антибиотики последних поколений гентомицин тобобромицин 5.Клебсиеллы, классификация, их характеристика, факторы патогенности. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика. Специфическая терапия (фаго- и иммунотерапия). РОДklebsiella-pneumonia, enterobacter МОРФОЛОГИЯ-короткиеграмм-палочкимощнаякапсуланеподвижны. Образуютслизистыеколонии, растетнаплотныхпитательныхсредах, кровяномогаре, возможенгемолиз, вжидкихпитательныхсредахтеряюткапсулу. СахоролитическиесвойстваферментатируютмногиеуглеводысобразованиемкислотыигазаPNEUMONIA-лишеныжгутиковНЕсинтезируюторнитиндекарбоксилазу. АНТИГЕНЫ- ОиКкапсульныеполисахориды. ПАТТОГЕНЕЗ- вирулентностьобусловленаадгезиейсвязаннойскапсульнымполисахоридомпилямиибелкомнаружноймембраныэндотоксины. ВызываютпневмониюОКЗ. ДИАГНОСТИКА-микроскопический , выделениечистойкультуры. ЛЕЧЕНИЕ- вакцинынетцефалоспорины 3гопоколения. 6.Протеи, классификация, их общая характеристика, факторы патогенности, виды. Этиологическая роль при гнойно-воспалительных заболеваниях. Лабораторная диагностика, специфическая фаго- и иммунотерапия. P. VULGARISP.MIRABILIS Условно патогенная флора, прямые грамм-палочки могут встречаться кокки имеют жгутики пили и микрокапсулу растут на основных питательных средах в виде плёнки факультативные анаэробы обладают окислительными и бродильными свойствами. АНТИГЕНЫ - обладают Н и О антигенами. ПАТОГЕННОСТЬ - вирулентность связана с микрокапсулой , пилями белками наружной мембраны клеточной стенки вызывают пищевые токсикоинфекции и гнойно-воспалительные процессы разной локализации. Протеолитические и сахоролитические своиства. ДИАГНОСТИКА- бактериологический метод. ЛЕЧЕНИЕ- специфическая отсутствует. ЛЕЧЕНИЕ ЦЕФАЛОСПАРИНЫ 2-3 ПОКОЛЕНИЯ. 7.Эшерихии, классификация, их общая характеристика, факторы патогенности, роль в патологии человека. Лабораторная диагностика. Специфическая терапия, рациональная антибиотикотерапия. E.COLI условно патогенная, кишечная палочка, основной представитель нормальной флоры. МОРФОЛОГИЯ - S или R формы колоний факультативный анаэроб хорошо растет на обычных питательных средах при слабл щелочной реакции и оптимальной температуре 37 кишечная палочка обладает наиболее высокой ферментативной активностью. АНТИГЕНЫ- о антиген соматический, поверхностный или капсульный. К- антиген, Н-антиген у жгутиковых О антиген основной определяющий группу эшерихий. ПАТОГЕНЕЗ -1 возбудители эндогенных инфекций-гнойно воспалительные процессы.2-возбудители острых кишечных инфекций-эширихиозы. ДИАГНОСТИКА - бактериологический(Основной - бактериологичнский метод, при котором используется количественный посев и учет микроорганизмов в патологическом материале, обязательна повторность выделения возбудителя, установление вероятных источников и факторов передачи инфекции. Серологический метод, где учитывается нарастание титра антител к аутоштамму возбудителя.) ЛЕЧЕНИЕ- специфической профилактики нет, у детей грудного возраста давать молочнокислый бактерии (бифидумбактерин) у взрослых пенициллины цефалоспорины-все препараты действующие на клеточную стенку грамм-. 8.Стафилококки, классификация, факторы патогенности. Заболевания, вызываемые стафилококками, эпидемиология, микробиологическая диагностика, специфическая профилактика и терапия. Стафилококки Отдел Firmicutes, семейство Micrococcaceae, род Staphylococcus. 3 вида: S. aureus, S. epidermidis и S. saprophyticus. Все виды стафилококков представляют собой округлые клетки диаметром 0,5—1 мкм. В мазке располагаются обычно несимметричными гроздьями («гроздья винограда»), но встречаются одиночные клетки, пары клеток. Грамположительны. Спор не образуют, жгутиков не имеют. У некоторых штаммов можно обнаружить капсулу. Могут образовывать L-формы. Клеточная стенка содержит большое количество пептидогликана, связанных с ним тейхоевых кислот, протеин А. К факторам патогенности стафилококков относятся фер-менты коагулаза, гиалуронидаза, фибринолизин, ДНК-аза, леци-товителлаза и др. Коагулаза -- бактериальная протеиназа, свер-тывающая плазму крови животных. Наличие коагулазы является одним из наиболее важных и постоянных критериев патогенности стафилококков. Патогенные стафилококки синтезируют и секретируют высокоактивные экзотоксины и ферменты. Среди экзотоксинов выделяют четыре типа гемотоксинов (стафилолизи-нов), лейкоцидин и энтеротоксины. К гемотоксинам относятся альфа-, бета-, гамма- и дельта-гемо-лизины. Альфа-гемолизин вызывает лизис эритроцитов овец, свиней, собак, обладает болезни - группа весьма различных заболеваний, обусловленная стафилококками. Основные проявления стафилококковой инфекции - гнойные заболевания кожи и подкожной клетчатки, стафилококковый сепсис, синдром токсического шока, пневмонии, ангины, энтероколит, отравление стафилококковым энтеротоксином и поражение центральной нервной системы. Иммунитет после перенесенной инфекции нестоек и, в общем-то, несущественен, так как при встрече с новым подвидом стафилококка, производящим другие токсины, все предыдущие иммунные «приобретения» значимой защитной роли не несут. Эпидемиология. Эпидермальный и другие коагулазоотрицательные стафилококки являются частью нормальной микрофлоры кожных покровов, слизистых оболочек и нижнего отдела кишечника. Здоровое носительство золотистого стафилококка в нижних носовых ходах наблюдается у 70-90% обследованных, у некоторых из них (20%) носительство может продолжаться длительное время. Носительство чаще наблюдается у медицинского персонала. В отдельных случаях стафилококковое заболевание может возникнуть за счет эндогенной инфекции, при ослаблении защитных сил макроорганизма или при дисбактериозе. Так, при лечении антибиотиками широкого спектра действия возможны тяжелые стафилококковые энтероколиты. Возможна передача инфекции с инструментами, перевязочным материалом, предметами ухода, а также пищевыми продуктами. Лечение стафилококковых инфекций обычно проводят антибиотиками и сульфаниламидными препаратами. В последние годы от больных часто выделяют стафилококки, резистентные к большинству химиотерапевтических препаратов. В таких случаях для лечения используют антитоксическую противостафилококковую плазму или иммуноглобулин, полученные из крови доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином. Для активной иммунизации (плановых хирургических больных, беременных женщин) может быть использован адсорбированный стафилококковый анатоксин. Микробиологическая диагностика бактериологическая диагностика, то есть выделение чистой культуры и идентификацияю. Материал от больных и бактерионосителей засевают немедленно или не позднее 3-4 ч после взятия при условии хранения его на холоде. делают посевы на кровяной агар и элективные для стафилококков среды или молочно-желтково-солевой агар. Чашки с посевами инкубируют при 37 ° С в течение 48 часов. На второй день производят высев из сахарного бульона на указанные элективные среды, исследуют массивность роста и характер колоний после посевов других материалов. На кровяном агаре стафилококки образуют непрозрачные, слегка выпуклые колонии средних размеров с гладкой, блестящей, словно полированной поверхностью, четко очерченным краем, маслянистой консистенции. Бактериоскопический. Из патологического материала готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Прямая микроскопия позволяет дать только предварительный ответ. Одновременно сеют материал в чашки с кровяным, молочно-солевым и желточно-солевым агаром. Выявляют летальные свойства культуры на кроликах и проводят дерматонекротическую пробу. Специфическая профилактика: 1) получен препарат из экзотоксина - анатоксин, его используют для вакцинации беременных женщин, у них возникает антитоксический иммунитет, который передается через плаценту ребенку. 2) стафилококковый ?-глобулин - получают из крови доноров, иммунизированных анатоксином, создают пассивный иммунитет (используют так и для лечения). 3) стафилококковая аутовакцина - получают из штаммов staph, выделенных от больных. Используют при хронических инфекциях для активации иммунитета. 4) лечить носителей и больных. 5) разделение гнойного и чистого отделений в больнице 6) прививают рожениц анатоксином, который трансплацентарно передаётся плоду. 9.Проблема госпитальной стафилококковой инфекции в педиатрии. Значение носительства стафилококков у работников в детских учреждениях. Принципы санации носителей. Методы эпидемиологического анализа госпитальных стафилококковых инфекций. Особое-проблема – профилактика стафилококковых заболеваний у новорожденных. В профилактику включается иммунизация рожениц анатоксином, а также проведение количественного и качественного анализа обсемененности молока рожениц. Наиболее опасноны насители инфекции, слизистых верхних дыхательных путей, с кожными поражениями. 10.Стрептококки, их классификация (Ленсфильд). Общая характеристика стрептококков, факторы патогенности. Роль стрептококков группы А и В в патологии человека. Микробиологическая диагностика стрептококковых заболеваний. |