ферменты. Ферментные препараты. 1 разработка технологии процесса получения ферментных препаратов для лечения и профилактики болезней человека
 Скачать 20.78 Kb.
|
|
В 1836 году Шван выделил из желудочного сока вещество способное расщеплять и растворять белки и этим веществом оказался пепсин. Ферменты микробного, животного, растительного происхождения используются в медицинской практике как биопрепараты с целью диагностики, лечения и профилактики различных болезней человека, особенно они эффективны при терапии последовательности заболеваний обусловленных отсутствием или недостатком того или иного фермента в организме. Задачей биотехнологии ферментов является: 1) разработка технологии процесса получения ферментных препаратов для лечения и профилактики болезней человека; 2) разработка тест - систем аналитических методов которые основаны на каталитической активности и стерео избирательности ферментов. Ферменты - это вещества белкового происхождения катализирующие практически все процессы в живом организме, они отвечают практически за все процессы происходящие в организме,обеспечивают энергией и являются строительным материалом, создают и разрушают сигнальные молекулы необходимые для жизненных процессов и защищает организм от чужеродных веществ, кроме этого ферменты перезаписывают и размножают наследственную информацию ( учасьвует в синтезе ДНК и РНК), участвует в реализации этой информации в синтезе самих себя и других белков, ферменты в организме синтезируются на рибосомах, функционируют внутри клеток либо секретируют во внешнюю среду( экзоферменты). Многие эндоферменты в клетках находятся в свободном состоянии, когда другие связаны со сложными высокоорганизованными структурами. Ферментативный набор клетки типичен и характерен для вида и генетически детерминирован, также различают конститутивные( жизненно важные), которые присутствуют всегда в определенном количестве, а также индуцибельные, канцетрация которых зависит от наличия субстрата. Для некоторых ферментов (энзимов) время активной деятельности не превышает 20 минут и позже они заменяются, а другие ферменты остаются активными в течение нескольких недель, прежде чем они будут расщеплены и удалены из организма. Если сравнить с катализаторами химическими, то ферменты наиболее эффективны и более избирательны по сравнению с ними. Технология получения ферментных препаратов: 1) технология микробиологического синтеза - эта технология включает 3 основных этапа: 1) ферментация, наработка биомассы микроорганизмов, продуцирующих фермент, участвует в ферментации, укомплектован несколькими биореакторами ( ёмкость 100 - 2000 литров) процесс проводят в асептических условиях, периодическая ферментация, аэрация и гомогенизация культуральной среды,в таких случаях оптимальное использование биореактора с регулятором диферентального давления и теплового расходомера кислороду. Здесь более важному являются температура и содержание кислорода в культуральной среде. Для этого в оборудовании используется специальная мембрана для контроля содержания кислорода в растворе. Газообразный кислород растворяется в жидкости и поступает в специальные емкости, уровень содержания кислорода в растворе зависит от разницы давления между камерой с газообразным кислородом и раствором. Эта разница регулируется специальной установкой, то есть имеет место не просто аэрация или ассигнации, а тонкая регуляция этого процесса, иначе будет весь процесс нарушаться. 2) Предварительная очистка ферментов с использованием сепараторов, ультрацентрифуг, нутч - фильтров, установкой для мембранной фильтрации или другого оборудования для отделения клеток от культуральной жидкости, а также внеклеточных продуктов; 3) Тонкая очистка фермента с использованием вакуум - выпарных установках, экстрактора, ионнообменных колоннах или другой аппаратуры для полной очистки белка до гомогенной массы ферментов, например такими методами получают пурин - нуклеотид фосфорилаза, пуридин фосфорилаза и тимидин фосфорилаза, путем клонирования гена, кодирующий эти ферменты в составе плазмидных векторов E.coli, они могут быть использованы как противовирусные, противоопухолевые. Препараты в виде модифицированных нуклеотидов - Виразол, Кладригин, Щелочная фосфотаза=》данном случае это продуцент рекомбинатный штамм E.coli; Химозин =》который выделен из эукариотического организма и внедрён в прокариот ( продуцент E.coli ); Ацеталактат декарбоксилаза =》 продуцент рекомбинатного штамма Bacillus subtilis. Вторая технология - технология выделения ферментов из органов и тканей млекопитающих. Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо тщательное измельчения с помощью гомогенизации исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур, которые несут в себе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при этом уделяют проведению всех операций в условиях, исключают денатурацию белков, так она всегда связана с потерей ферментативной активности, этому способствует присутствие защитных добавок, в частности меркаптосодержащих соединений, например Цистеин, Глутатион, меркапто этанол и так далее. При этом 2 шнуркодирки на всех этапах выделения фермента низкую температуру, так как при высокой они теряют биологическую активность. Типичная экстракция глицерина в которой сохраняется нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, который состоит в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше - 10°С тканей или вытяжек из них содержащих ферменты. Для более тонкой очистки ферментов используется ионнообменная хроматография, метод молекулярных сил, электрофорез и изоэлектрофокусирование. Данная технология применима при выделении пепсина, хемопепсина, рибонуклеазы, гиалуронидазы, тимолина, цитохрома - ц, панкреатина и др ферментов животного происхождения. Производство пакреатина. На мясоперерабатывающих предприятиях у здоровых животных изымать поджелудочной железы и хранятся при температуре - 20°С, впоследствии сырье сырье доставляется на фармацевтические предприятия. Замороженные железы измельчаются и суспендируются в растворе бикарбоната натрия с изопропиловым спиртом для предотвращения потери ферментативной активности. Далее проводят гидролиз путем перемешивания суспензии в специальных гидролизных камерах в течении нескольких часов, при этом нерастворимые компоненты, волокна или другая часть отделяется от суспензии фильтрацией. Стадия преципитации осуществляется при высокой канцетрации изопропилового спирта, далее панкреатин после осаждения высушивают в вакууме для удаления остановкой влаги. После сушки идёт гранулирование - покрытие оболочкой и фасовка. Этот препарат назначается при экзокринной недостаточности поджелудочной железы и обеспечивает достаточное количество активного фермента в проксимальном отделе 12ПК. Входящий в состав панкреатина ферменты липаза, амилаза и прогноза обеспечивают переваривание белков, углеводов, что способствует их более полному всасывания в тонком кишечнике. Технология выделения ферментного комплекса из растительных клеток. В начале из гомогенизированной биомассы растительной ткани путём экстракции центрифугированием гельфильтрации выделяют стабильный ферментсодержащий белковый комплекс, здесь экстракцию проводят водно - спиртовым раствором с последующей фильтрацией,где алкоголизированного экстракта отбора наиболее активных фракций. Далее отделяютя балластные вещества с получением растворимой фракцией ферментов. И далее проводят хроматографию на сильфодельсе и элюцитрат, таким образом полученные фракции объединяют и лиофилизируют. Ферментные препараты проверяют на биологическую активность, содержание белка и иммунотоксичность. Иммобилизованные ферментные препараты. Это препарат Дальцекс- трипсин - иммобилизованный на модифицированной целлюлозе. Далее Протеокс - т - это трипсин и лизоцим иммобилизованные на благовпитывающей прокладке в виде нетканного постопрошивного полотна и защитного слоя из полиэтиленовой плёнки. Применяется в качестве от травматических повязок. Стрептокиназа - иммобилизованный на полисахаридной водорастворимой матрице, фермент с пролонгированным фибринолитическим действием. Иммобилизация - это физическое разделение его объектов и растворителя, то есть биообъект закреплён на нерастворимом носителе, а субстрат и продукты свободно обмениваются между биообъектом и растворителем. Биообъект может работать в таком случае многократно (недели, месяцы). Другими словами перевод фермента в нерастворимое состояние с сохранением каталитической активности. Преимущества иммобилизованных объектов: 1)многократность использования ферментов и дивых клеток в наиболее продуктивной фазе; 2)снижение количества отходов производства 3) повышение качества целевого продукта, более простое выделение целевого продукта 4) биотехнологический процесс становится более стандартным, более предсказуемым 5)устойчивость к внешним воздействием. Для получения иммобилизованных ферментов используют следующие методы: 1)ковалентное присоединение молекул ферментов водонерастворимому носителю в качестве которого используют как органические полимеры, так и неорганические материалы, например к природным можно отнести целлюлозу, хитин, агароза, ткани, бумага и далее 2) захват фермента в сетку геля или полимера 3)ковалентная сшивка молекул фермента друг с другом или с инэртными белками при помощи би- или полифункционального реагента 4)адсорбция ферментов на водонерастворимых носителях 5) микрокапсулирование - захват из слоя фермента, полупроницаемые капсулы с размером 5 - 300 микро. В результате этого иммобилизованные ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов, их можно удалять из реакционный смеси - отделять от субстрата и продуктов ферментативной реакции простой фильтрацией. Также появляется возможность перехода в новых периодические ферментативных процессов на непрерывный режим, используя колонны или проточные аппараты с иммобилизованными ферментами. В данном случае отпадает стадия выделения, очистки, которая обходится производству значительно дороже затратной. Также ферментные микроорганизмы находятся в своём естественном окружении. Синтетические ферменты. Лизопротеазы, лизоцим, цитохром - ц и другие. В качестве матрицы для синтеза синтетических ферментов используется полимеры - циклодекстрины и металлопоизводные стероидов. Они не содержат аминокислотных остатков, поэтому менее подвержены действию температуры, рН, ионные силы, чем ферменты природные. Поэтому трудно ожидать, что они получат широкое распространения в виду сложностей и дороговизны методов синтеза. Методы получения новых ферментов: 1) Модификация свойств индивидуальных ферментов с целью получения повышения их активности. Для этого существуют химические, физико - химические и биологические методы модификации. Среди биологических методов особенно многообещающими являются методы белковой инженерии, которая основана на знание зависимости между аминокислотной последовательностью, трёхмерной структурой и каталитической активностью ферментов. Эти методы позволяют успешно модифицировать фермент путем замены определенных аминокислот, структура молекул при этом путём внесения случайных изменений в аминокислотную последовательность, существующих природных ферментов с последующей селекцией in vitro, которая приводит к изменению из субстратной специфичности, избирательности взаимодействия. Увеличение стабильности ферментов температуре и экстримальным значениям рН достигается путем замены среди сдвиженной критично структуре ферментов аминокислотных остатков, которые дополнительно приводят к образованию нековалентных гидрофобных связей. Цепляя солевым хвостиком или ковалентных дисульфидных связей, повышающих общую стабильность глобулы молекул ферментов. Далее повышение стабильности ферментов к протеолизу осуществляется либо удалением сайта узнавания протеаз, либо путем увеличения степени гликолизирования через введения в них аминокислот. 2)Получение новых рекомбинатных ферментов с заданными свойствами. 1) Рибазин получает in vitro методом матричной РНК дисплеем, для этого создаётся библиотека комплементарной ДНК, с них транскрибируется соответствующая молекула матричной РНК, которая затем транслируется с образованием матричной РНК белковых гибридных молекул. Далее проверяется на наличие каталитической активности. 2) Акзимы получают in vivo на лабораторных животных путем иммунной селекции. Здесь проводят генетические перестройки и создаются огромные количества каталитических антител. Акзим связывается с молекулой субстрата, с её пространственной структурой, могут катализировать соответствующую ферментативную реакцию. Акзимы обычно способны увеличить скорость химических реакций в 104 - 106 раз, но для определеных ферментов это весьма скромный показатель. 3) Разработка медицинских нанотехнологий с использованием ферментов. 4) Скрин новых микроорганизмов - продуцентных ферментов. Перспективное направление применения ферментов. В патогенезе сахарного диабета в развитии нечувствительных клеток к инсулину существенную роль играет фермент Диацилглицеролкиназа - дельта, он является ключевым звеном в ферментативных реакциях, передачи инсулинового сигнала и энергетического ( липидного ) обмена. При его недостатке клетки слабо реагируют на инсулин и естественно нарушается усвоение глюкозы и липиды остаются не окисленными, их в большем количестве откладывается в белой жировой ткани. Сам фермент глюкозозависимый, то есть чем больше глюкозы в крови, тем меньше вырабатывается ферментов. |