Вирусология, антология. 1. биопрепараты их применение при вирусных заболеваниях и принципы изготовления
 Скачать 450.05 Kb.
|
|
1.биопрепараты их применение при вирусных заболеваниях и принципы изготовления Биопрепараты – средства биол. происхождения, применяемые для диагностики и профилактики инфекц. и инвазионных болезней, лечения животных и повышения их продуктивности. Различают: лечебные (специфич. гипериммунные сыворотки и гамма–глобулины), профилактич. (вакцины, анатоксины), диагностич. (аллергены, антигены, диагностич. сыворотки, бактериофаги), стимулирующие средства (сыворотка крови животных, СЖК, препарат АСД, препарат витамина В12 и др.). В ряде случаев лечебные Б. п. применяют в профилактич. целях, а стимулирующие средства – для лечения. Некоторые вет. Б. п, используются в мед. практике. В Советском Союзе Б. п. готовили на специализированных биокомбинатах, биофабриках Гл. управления биол. пром–сти, а также во мн. Научно–исследовательских институтах и вет. лабораториях по единой для каждого препарата методике. Контроль за изготовлением и выпуском Б. п. осуществляет ВГНКИ.- Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов. Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофизических, физико-химических процессов, и состоит из большого числа разнотипного оборудования, связанного между собой материальными, энергетическими потоками и образующих технологические линии. Характер этих связей может быть весьма разнообразным: продукты и полупродукты, вырабатываемые в одних аппаратах, поступают в следующие по ходу процесса аппараты; сырье и энергия распределяются между различными потребителями. Приготовление противовирусных вакцин:- приготовление культуры клеток;- культивирование клеток; - культивирование вируса;- выделение и концентрирование вируса;- очистка вируса;- сорбирование;- инактивация вируса; КЛАССИФИКАЦИЯ БИОПРЕПАРАТОВ I. Биопрепараты, использующиеся in vivo: Антигенные (вакцины /в т.ч. анатоксины/, аллергены, лизаты микробов для кожных проб), создающие активный иммунитет. Специфические АТ появляются в кровотоке примерно через 10 дней у здорового животного (у животных с иммунодифецитами – позже). Антитело–содержащие (антисыворотки, гамма–глобулины, молозивные АТ, иммунное молоко), создающие за счет готовых АТ пассивный иммунитет. Однако «примеси» данных биопрепаратов и ксеногенные (лошадиные и пр.) АТ запускают активный «вредоносный» иммунитет. Поэтому использование желательно в течение 1 недели после первой инъекции. Антисыворотки вводят только по показаниям. Иммунокорректоры – животного происхождения (цитомедины, интерлейкины, интерфероны, факторы роста, гормоны /глюкокортикоиды и др). – растительного происхождения (аллергены, лектины) – микробного происхождения (БЦЖ, продигиозан, антибиотики) – химические иммунокорректоры II. Биопрепараты, использующиеся in vitro Диагностикумы (для РНГА) антигенов микробов (самих клеток, лизатов, или очищенных Антигенов), использующиеся в серологических реакциях. Иммунодиагностикумы – это часто взвесь известных убитых микробов. Для инактивации используют высокую температуру, химические вещества (формалин, спирт, ацетон, фенол), ультразвук, ультрафиолетовые и рентгеновские лучи. При выделении из клеток различных Антигенов используют методы разрушения, экстракции, обработку ферментами и различными детергентами, центрифугирование. Антигены, в т.ч. анатоксины /токсины/ для проведения РП, РН (для постановки контроля в серологии). Диагностические антисыворотки. Для удаления из антисывороток группоспецифических антител в сыворотку последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят групповые антигены (метод Кастеллани). Таким образом получают адсорбированные сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микробов. МАТ (мышиные антитела) для ИФА, иммуноблоттинга, ИФМ и пр. серологических реакций. 2.Современная классификация вирусов Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты, имеющие собственный геном, структурные белки и ферменты, способные репродуцироваться только в чувствительных к ним клетках животных, растений, бактериях. В силу своих особенностей вирусы выделены в отдельныqпорядокViridales. Порядок делится на семейства, которые подразделяются на подсемейства и роды. Вид– совокупность вирусов, имеющих почти идентичные геном (ДНК или РНК), свойства и способность вызывать определенный патологический процесс. Названия семейства имеют окончаниеviridae, подсемейство –virinae, рода –virus. Признаки, используемые для классификации вирусов: 1) тип нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК; 2) их структура (однонитевая, двунитевая, линейная, кольцевая, фрагментированная, нефрагментированная с повторяющимися и инвертированными последовательностями); 3) структура, размеры, тип симметрии, число капсомеров; 4) наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида); 5) антигенная структура; 6) феномены генетических взаимодействий; 7) круг восприимчивых хозяев; 8) географическое распространение; 9) внутриядерная или цитоплазматическая локализация; 10) чувствительность к эфиру и детергентам; 11) путь передачи инфекции.  3.Врожденный иммунитете ( естественный,видовой) Иммуните́т — способность организма поддерживать свою биологическую индивидуальность путём распознавания и удаления чужеродных веществ и клеток. Врождённый иммунитет — способность организма обезвреживать чужеродный и потенциально опасный биоматериал (микроорганизмы, трансплантат, токсины, опухолевые клетки, клетки, инфицированные вирусом), существующая изначально, до первого попадания этого биоматериала в организм.  4.Методы культивирования вирусов. Культивирование вирусов представляет собой их выращивание в искусственных условиях. Для этого культиваторы заражают животных, либо ткани и клетки. Проводят в целях диагностики, при проведении экспериментов, с целью изготовления противовирусных вакцин. Культивирование вируса впервые было совершено Гальтье в 1879 году. Он культивировал вирус бешенства, заразив мозг кролика вирусом бешенства, полученным у больной собаки. Методы культивирования. 1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация_(обнаружение)'>Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека. 2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация: а) по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА). Недостатки метода: а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах; б) невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и других соединений. 3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток. 5. Характеристика сем.поксвирусов В семейство Poxviridae, входят в роды Orthopoxvirus, Род Orthopoxvirus включает вирусы осповакцины и натуральной оспы, род Parapoxvirus – вирусы «узелков доярок» (псевдооспы рогатого скота), род Molluscipoxvirus – вирус контагиозного моллюска, род Yatapoxvirus – вирусы оспы обезьян. Культивирование. Вирус культивируется в куриных эмбрионах, на хорионаллантоисной оболочке которых образуются белые вирусные бляшки; в первичных и перевиваемых культурах клеток, где дает характерно ЦПД в виде очаговой дегенерации клеточного пласта. Индикация вируса проводится в реакции гемагглютинации и гемадсорбции. Устойчивость Поксвирусы выдерживают высушивание и сохраняют жизнеспособность в пат.материале в течение многих месяцев при комнатной температуре, в 50% растворе этанола инактивируются в течение 1 часа, в 50% растворе глицерина при 4°С сохраняются в течение нескольких лет, 1% фенол или 0,2% формальдегид при комнатной температуре инактивирует их только через 2 часа, 5% хлорамин – в течение 2 часов. Источником инфекции являются больные люди в течение всего периода болезни. Инфекция передается воздушно – капельным и контактным путем.. Патогенез и клиника. Входные ворота – слизистая оболочка верхних дыхательных путей. Дерматропное действие вируса связано с его способностью проникать из крови в эпидермис, вызывать пролиферацию шиповидных клеток и дегенерацию клеток мальпигиева слоя. Инкубационный период при натуральной оспе длится 8-18 дней, заболевание начинается остро, возникают головные боли, лихорадка, мышечные боли. Через 2-4 дня на слизистой оболочке полости рта и коже появляется характерная сыпь. В своем развитии сыпь проходит стадии папулы, пустулы, а затем образуется рубец. Все элементы сыпи появляются одновременно и локализуются на лице и конечностях. С появлением сыпи температура снижается, а затем повышается, когда образуются пустулы. От момента появления сыпи до отпадения корочек проходит около трех недель. При классическом тяжелом течении болезни летальность достигает 40%, при легкой форме заболевания летальность не превышает 2%. 6. Сущность РСК и её применение в диагностике Если в исследуемой сыворотке есть специфические антитела, то при добавлении известного антигена образуется комплекс Ат+Аг, который адсорбирует на своей поверхности свободный комплемент. В результате чего образуется комплекс Ат+Аг+комплемент. При добавлении гемолитической системы, гемолиз эритроцитов не происходит, при этом в пробирке красная мутная жидкость, эритроциты находятся во взвешенном состоянии. Такая реакция положительная, следовательно животное больное. Если в исследуемой сыворотке нет специфич. антител, то при добавлении антигена комплекса Аг+Ат не образуется и комплемент остаётся свободным. При добавлении гемолитической системы, происходит гемолиз эритроцитов, в пробирке красная прозрачная жидкость. Реакция отрицательная, следовательно животное здорово. 7. Типы вируса ящура и их диагностика Ящур – остро протекающая высоко контагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени. Болезнь регистрируется во всех странах мира. Имеется большое количество типов вируса, 7 из которых вызывают заболевание. Они сходны по биологическим свойствам, но отличаются по антигенам, которые обозначают: О, А, С, САТ-1, САТ-2, САТ-3, Азия-1. Каждый тип имеет определенное число вариантов: тип А имеет 32 варианта, О - 13, С - 5, САТ-1 - 7, САТ-2 - 3, САТ-3 - 4, Азия-1 - 2. Типы и подтипы вируса различаются иммунологически: каждый из них может вызывать заболевание животного, иммунного к другим типам и вариантам вируса Для определения типов выделенного вируса ящура при диагностике используют реакцию связывания комплемента (РСК) по 100%-ному гемолизу эритроцитов барана. 6 компонентов (1 - вируссодержащийй материал (афты и их содержимое), 2 - стандартные моноспецифические сыворотки, 3 - сыворотка крови морских свинок, 4 - гемолизин(специфич.антитело на эритроциты барана), 5 - эритроциты барана, 6 - гипоспецифические ящурные антигены в удвоенных титрах для контроля 8. Классификация культуры клеток и её применение. техника получения культур клеток 1. Первично-трипсинизированная культура клеток клетки, полученные из органов или тканей эмбриона, путем разрушения соединительно-тканных мостиков между клетками под действием ферментов (трипсин, панкреатин) с последующим выращиванием в питательной среде in vitro. Используют эмбриональные органы (почки, легкие), т.к. они обладают высокой скоростью роста. 2. Перевиваемые культуры клеток — это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (пассаж). Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. 3. Диплоидные культуры клеток - клетки содержат диплоидный набор хромосом и выдерживают до 50-ти пассажей в течение 8-10 месяцев. 4. Суспензионные культуры клеток – это клетки, полученные из органов и тканей, находящихся в питательной среде во взвешенном состоянии при постоянном перемешивании. 5. Органные культуры клеток готовят из органов и тканей путем измельчения их до минимальных размеров (приблизительно 3 мм). Находятся в питательной среде во взвешенном состоянии. Приготовление культур клеток. Для приготовления первично- трипсинизированной культуры из кожно-мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов используют 10 суточные куриные эмбрионы. Сначала их овоскопируют, отбирают яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженными сосудами. Ha скорлупе отмечают границы воздушной камеры и расположение зародыша. Скорлупу над воздушной камерой протирают йодированным спиртом. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2-3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают подскорлупную И хорионаллантоисную оболочки и за шейку извлекают эмбрион в стерильную чашку Петри. У эмбриона удаляют голову, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожно-мышечный мешок переносят в стерильную банку и измельчают ножницами на кусочки 3-4 мм. Измельченную ткань 2-3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,25%-ный раствор трипсина (в соотношении 1:3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку. Трипсинизацию проводят дробно, т.е. через каждые 3-5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на в холод (4°C) для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. После полного истощения кусочков тканей все полученные порции суспензии клеток в растворе трипсина центрифугируют при 600 об/мин 2-3 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37°C) питательной среде. После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток, для определения посевной дозы в камере Горяева После подсчета клетки разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от 700 тыс. до 1 млн клеток (для куриных фибробластов). В пробирки с питательной средой заливают по 2 мл взвеси клеток. Пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 37 °C. Пробирки помещают под углом. Обычно сплошной монослой куриные фибробласты образуют через 24-48 ч. Культуры клеток куриных фибробластов используют при работе с вирусом болезни Ауески, оспы птиц, ньюкаслской болезни, гриппа птиц и др.. 9. Гуморальные факторы противовирусного иммунитета Иммунную защиту макроорганизма при вирусных инфекциях осуществляет противовирусный иммунитет. Его особенности обусловлены двумя формами: внеклеточной и внутриклеточной. Основными факторами, являются специфические антитела, Т-киллеры, интерферон и сывороточные ингибиторы вирусных частиц. Специфические противовирусные антитела способны взаимодействовать только с внеклеточным вирусом, внутриклеточные структуры прижизненно для них недоступны. Антитела нейтрализуют вирусную частицу, препятствуя ее адсорбции на клетке-мишени, инфицированию и генерализации процесса, и обеспечивают иммунный фагоцитоз «маркированных» вирусных частиц. Специфические антитела также связывают вирусные белки и нуклеиновые кислоты, которые попадают в межклеточную среду и секреты после разрушения зараженных вирусами клеток. Гуморальные факторы неспецифической защиты. Многочисленны, содержатся в крови и других жидкостях организма человека, вырабатываются Т-лимфоцитами и макрофагами. К ним относят: Комплемент - неспецифическая ферментная система крови, состоящая из 9 различных протеиновых фракций, адсорбирующихся в процессе каскадного присоединения на комплексе антиген + антитело и оказывающих лизирующее действие на связанные антителами клеточные антигены Лизоцим - белок, содержащийся в слюне, крови, слезной и тканевой жидкости, активен в отношении грамположительных бактерий, т.к. нарушает синтез муреина в клеточной стенке. в-лизины - освобождаются из лейкоцитов и более активны по отношению к грамотрицательным бактериям лейкины - протеолитические ферменты, освобождающиеся при разрушении лейкоцитов и нарушающие целостность поверхностных белков микробных клеток интерферон - б и в, продуцируются соответственно мононуклеарными фагоцитами и фибробластами и обладают противовирусной активностью пропердин - комплекс белков, обладающих противовирусной, антибактериальной активностью в присутствии солей магния, вызывая лизис микроорганизмов и усиливая фагоцитарную реакцию и воспалительный процесс эритрин - обладает ингибирующим действием на коринебактерии дифтерии и высвобождается при разрушении эритроцитов нормальные антитела - обнаруживаются в крови новорожденных в очень низких титрах, обладают цитофильным действием, уровень их возрастает под действием микроорганизма как пускового сигнала. 10. Вирус инфекционного трансмиссивного гастроэнтерита свиней |