Матричные биосинтезы. 1. Структурная организация нуклеиновых кислот. Строение днк. Строение рнк и ее типы. Химические связи, участвующие в формировании их структуры. Функции нуклеиновых кислот. Особенности организации генов у прокариот, эукариот и вирусов
 Скачать 35.09 Kb.
|
|
1. Структурная организация нуклеиновых кислот. Строение ДНК. Строение РНК и ее типы. Химические связи, участвующие в формировании их структуры. Функции нуклеиновых кислот. Особенности организации генов у прокариот, эукариот и вирусов. РНК (рибонуклеиновые кислоты) — нуклеиновые кислоты, линейные полимеры нуклеотидов, в состав которых входят остаток ортофосфорной кислоты(3), рибоза (в отличие от ДНК, содержащей дезоксирибозу) и азотистые основания — аденин, цитозин, гуанин и урацил (в отличие от ДНК, содержащей вместо урацила тимин). В составе нуклеиновых кислот мононуклеотиды связаны 3’,5’-диэфирными связями между рибозами соседних мононуклеотидов через остаток фосфорной кислоты Функции нуклеиновых кислот - ДНК: /хранение генетической информации/ - РНК:/хранение генетической информации у некоторых вирусов/ /реализация генетической информации: и-РНК (м-РНК) - информационная (матричная), тРНК (транспортная), р-РНК (рибосомальная)/ Информационная или матричная РНК (мРНК). Рибосомная РНК (рРНК) - самая широко представленная РНК клетки (примерно 85% всех РНК). Транспортная РНК (тРНК) переносит определенные аминокислоты к месту синтеза белка на рибосоме и связывает мРНК и рРНК для синтеза белка. У прокариот ген имеет непрерывную структуру, т. е. представляет собой часть молекулы ДНК. У эукариот ген состоит из чередующихся участков: экзонов и интронов Вирусы имеют одну молекулу ДНК или РНК, заключенную в белковую оболочку (капсид - Капсид защищает генетический материал (ДНК или РНК) вируса от различных повреждений. На начальных стадиях заражения клетки капсид прикрепляется к клеточной мембране, разрывает ее и внедряет в клетку генетический материал вируса. Вирусы имеют различные размеры и форму). вирусы содержат только ДНК или РНК. На этом основании все вирусы делят на ДНК- содержащие и РНК-содержащие 2. Виды переноса генетической информации. Центральная догма молекулярной биологии. Биологическая роль комплементарности азотистых оснований. Виды переноса генетической информации. =/ДНК → ДНК – репликация =/ДНК → иРНК, рРНК, тРНК – транскрипция/ =/РНК → белок – трансляция/ =/РНК → ДНК обратная транскрипция Биологическое значение комплементарности – обеспечение передачи генетической информации по матричному типу /Дочерний полинуклеотид комплементарен материнской полинуклеотидной цепочке/ Центральная догма молекулярной биологии — обобщающее наблюдаемое в природе правило реализации генетической информации: информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении. 3. Репликация ДНК. Ферменты. Строение репликативной вилки: лидирующие и отстающие цепи, фрагменты Оказаки. Механизм и биологическое значение. Репликация ДНК – удвоение ДНК, происходящее в ядре в S-фазу клеточного цикла, предшествуя делению клетки Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы, которые образуются в живых клетках и обладают способностью активировать различные химические соединения На лидирующей цепи синтез ДНК происходит непрерывно. На отстающей цепи синтез ДНК возобновляется много раз, по мере раскручивания спирали, что приводит к появлению множества коротких фрагментов, называемых «фрагментами Оказаки». ДНК-лигаза соединяет фрагменты Оказаки в единую молекулу ДНК. Полуконсервативный механизм репликации ДНК. Каждая цепь двойной спирали выступает в качестве матрицы для синтеза новой, комплементарной цепи. В результате чего получаются две молекулы ДНК, каждая из которых содержит одну исходную и одну новую цепи. 4. Теломеры хромосом, теломераза. Понятие о репликативной старости клетки. Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности нуклеотидов ДНК (TTAGGG у позвоночных) к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках. В каждой нити ДНК на 5'- конце имеются особые участки, содержащие частые повторы (ГГГТТА)- элемент теломера /Эти участки не несут информации о структуре белка, они являются стоп-сигналами при репликации/ Репликация заканчивается когда доходит до стоп-сигнала. Эти участки ДНК не копируются и не достраиваются, поэтому каждая репликация сопровождается укорочением теломеры /существует критическая длина теломеры, при которой клетка утрачивает способность к репликации – репликативная старость/ Репликативное старение лежит в основе старения организма. В средним клетка проходит 50-60 репликаций, у долгожителей больше. В эмбриональных и других быстроделящихся клетках есть фермент – теломераза, которая в процессе репликации может достраивать теломеру, увеличивая число репликаций //Если вводить в клетку теломеразу, открывается возможность продление жизни клетки Например, введение стволовых клеток – обновление тканей, предупреждение старения/// 5. Повреждения ДНК: спонтанные и индуцированные. Процессы репарации ДНК и их возможные последствия. Мутации. Виды мутаций. Роль мутаций в эволюции и возникновении наследуемых заболеваний. Повреждение структуры ДНК Ошибки при репликации, то есть встраивание некомплементарных оснований тут же исправляются репаративными системами. В репаративную систему входят: - белки-ферменты узнающие ошибку - белки- ферменты разрезающие в этом месте цепочку - ДНК-полимеразы достраивающие нить - ДНК-лигазы (сшивающие нить) завершающие репарацию Нарушения комплементарности цепей ДНК могут происходить спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов, например в результате ошибок репликации, дезаминирования нуклеотидов, депуринизации. Индуцированные повреждения ДНК между репликациями могут возникать под действием УФ, рентгеновского излучения, химических агентов и свободных радикалов /При таких повреждениях репаративные системы могут быть не состоятельны, изменения ДНК сохраняются – образуются мутации/ Мутации (от лат. mutatio - изменение), внезапные (скачкообразные) естественные или вызванные искусственно наследуемые изменения генетического материала (генома), приводящие к изменению тех или иных признаков организма. Виды мутаций - Генные, Хромосомные Геномные, Цитоплазматические Соматические /мутации являются материалом для естественного отбора// мутации в ДНК половых клеток вызывают наследственные заболевания/ ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ- это лечение болезней путем введения пациенту здоровых ГЕНОВ вместо недостающих или поврежденных. Здоровый ген вводят в какой-нибудь вирус (обычно переносчик легко поддающейся лечению инфекции) так, чтобы он был непосредственно нацелен на поврежденные клетки. 6. Регуляция клеточного цикла и репликации. Роль циклинов и белка Р53. Регуляция репликации. Длительность фаз клеточного цикла различна у различных типов клеток (более 200 видов) клетка проходит четыре фазы жизненного цикла: G1-фазу начального роста, S-фазу удвоения молекул ДНК (репликации, см. рис. 239), G2-фазу роста и М-фазу клеточного деления при этом некоторые клетки не могут перейти в S-фазу (репликации) (нейроны, миоциты) Основным фактором, который включает, замедляет, восстанавливает репликацию в S-фазу клеточного цикла, а также регулирует прохождение клеток по другим фазам клеточного цикла является повреждение ДНК и мутации. В каждой фазе клеточного цикла осуществляется контроль структуры ДНК и если в ней находятся ошибки – прохождение клетки по клеточному циклу затормаживается, а если ошибка не исправляется – цикл останавливается. Главную роль в регуляции клеточного цикла и репликации играет белок р53. /синтезируется во многих клетках с гена р53 ^является «молекулярным полицейским», который улавливает, узнает ошибки в первичной структуре ДНК/ При обнаружении ошибок, белок р53 предпринимает следующие действия: - активирует ферменты репаративной системы - разрушает циклины, отдаляя время репликации - если ошибки не устранены – запускается апопптоз (в любой из фаз клеточного цикла) р53 запускает синтез каспаз и ДНКаз, которые разрушают белки и ДНК, что приводит к смерти клетки (физиологической) /р53 активирует биосинтез белков семейства bax (активаторы каспаз)/р53 активирует биосинтез белка fаs/аро1 –трансмембранный гликопротеид, который появляется в мембране клетки при запускании апоптоза (в норме его нет) и выполняет рецепторную роль для макрофагов, с целью фагоцитоза /р53 ингибирует биосинтез белка bcl-2 (ингибитор каспаз)./Но сам ген кодирующий белок р53 может мутировать: утрачивается контроль за структурой ДНК, - апоптоз не включается, - происходит без контрольное деление клеток с поврежденной ДНК, - такие нарушения лежат в основе развития рака 7. Апоптоз. Физиологическая роль. Основные понятия о механизмах апоптоза, роль белка Р53. Последствия мутаций в гене р53. Биохимические основы противоопухолевой терапии, значение лабораторного определения маркеров апоптоза. Апоптоз – процесс естественной смерти клетки, морфологически проявляется прогрессирующей фрагментацией клеточных компонентов, включая ДНК Происходит гидролитический распад белков под действием протеаз, называемых каспазами и распад ДНК с помощью ДНКаз [Эти ферменты не находятся в лизосомах, в отличии процессов, происходящих при некрозе, где работают лизосомальные ферменты] Апоптоз –физиологический процесс, активирующийся не только у мутагенных клеток, но также активируется у высокоспециализированных клеток /Например у клеток, формирующих иммунный ответ организма, при воспалении, после устранения патогена, у лейкоцитов активируется аппоптоз. Но сам ген кодирующий белок р53 может мутировать: - утрачивается контроль за структурой ДНК - апоптоз не включается - происходит без контрольное деление клеток с поврежденной ДНК - такие нарушения лежат в основе развития рака Стратегия противоопухолевой терапии – активация апоптоза опухолевых клеток. Это достигается путем радиоактивного облучения, химического воздействия (химиотерапия) В настоящее время в клинико-диагностических лабораториях можно оценить экспрессию генов в опухолевых клетках методом люминесцентной микроскопии, с целью оценки эффективности противоопухолевой терапии : - р53, - fаs/аро1, - bcl-2 Если терапия корректна, то в опухолевых клетках повышается экспрессия генов р53 и fаs/аро1 и супрессируется ген bcl-2 8. Транскрипция. Основные элементы транскриптона. Компоненты, необходимые для транскрипции. Механизм транскрипции, биологическое значение. Виды РНК. Транскрипция – перенос генетической информации от ДНК к мРНК /переписывание генетической информации в виде последовательности дезокрибонуклеотидов в последовательность рибонуклеотидов Биологическое значение – синтез мРНК, которая выполняет роль матрицы для синтеза полипептида (белка) [При транскрипции переписывается не весь геном, а лишь некоторый участок ДНК, называемый геном] Транскриптон - участок матричной ДНК, с которой происходит процесс переписывания, то есть транскрипция /Состоит из нескольких участков Промотор – участок ДНК, к которому присоединяется фермент РНК-полимераза Оператор - участок ДНК, к которому присоединяются различные белки, регулирующие скорость транскрипции Терминатор - стоп сигнал, завершающий транскрипцию. 3 этапа транскрипции: - инициация, элонгация, терминация Инициация транскрипции /Распознается большая бороздка ДНК = РНК-полимераза находит промотор в ДНК и взаимодействует с ним = ДНК на этом участке начинает плавиться (расплетаются нити ДНК) = Промотор содержит пары А-Т, поэтому плавится достаточно легко. Элонгация транскрипции (синтез РНК) /для элонгации необходимо: рибонуклеотиды, служащие субстратом и источником энергии для этого процесса; фермент ДНК-зависимая РНК- полимераза; в процессе элонгации мононуклеотиды во вновь синтезированной цепи РНК строго комплементарны мононуклеотидам матричной ДНК/ Терминация транскрипции /достижение РНК-полимеразы стоп-сигнала и отсоединение синтезированной РНК Созревание и процессинг мРНК - При синтезе мРНК транскрибируется ДНК, в которую входят участки информационные и ненесущие информации, причем их до 90% - После транскрипции участки РНК ненесущие информацию, называемые интронами вырезаются - Остаются только информативные участки РНК - Из ядра в цитоплазму выходит созревшая РНК. Перенос информации с ДНК на РНК. 9. Посттранскрипционные модификации мРНК, тРНК, рРНК. (?!) Этапы процессинга пре - мРНК эукариот Кэпирование модификация 5’конца; Полиаденилирование - модификация3’-конца Сплайсинг удаление интронов и соединение экзонов Процессинг пре-тРНК. Определённые азотистые основания нукпеотидов тРНК в ходе процессинга метилируются под действием РНК-метилазы и превращаются, например, в 7-метилгуанозин и 2-метилгуанозин (минорные основания). В молекуле тРНК содержатся и другие необычные основания - псевдоуридин, дигидроуридин, которые также модифицируются во время процессинга. В результате процессинга из молекулы предшественника 45S рРНК образуются три типа рРНК: 18S, входящая в состав малой субъединицы рибосом, а также 28S и 5,8S, локализующиеся в большой субъединице. Все три рРНК образуются в равных количествах, так как они происходят из одного и того же первичного транскрипта. 5S рРНК большой субъединицы рибосом транскрибируется отдельно от первичного транскрипта 45S рРНК. Рибосомальные РНК, образованные в ходе посттранскрипционных модификаций, связываются со специфическими белками, и образуется рибосома. 10. Генетический код. Свойства генетического кода, биологическое значение. Генетический код – запись информации о первичной структуре белка (последовательности АК) в форме последовательности рибонуклеотидов в м-РНК. Свойства генетического кода 1)Специфичность – каждой аминокислоте соответствует триплет нуклеотидов 2)Триплетность – кодон состоит из 3-х нуклеотидов 3)Вырожденность – одной аминокислоте соответствует несколько кодонов 4)Непрерывность – между кодонами нет нуклеотидов, разделяющих их 5)Неперекрываемость - каждый нуклеотид входит в состав лишь одного кодона 6)Универсальность – у всех живых организмов одни и те же кодоны несут информацию об одних и тех же аминокислотах 7)Коллинеарность – соответствие линейной последовательности нуклеотидов в м-РНК линейной последовательности аминокислот в белке 11. Трансляция. Компоненты, необходимые для трансляции. Механизм трансляции. Роль транспортной РНК. Понятие о полисоме. Трансляция — это процесс синтеза белка, который происходит на рибосомах с участием мРНК в качестве матрицы. Трансляция происходит на рибосомах, внутриклеточных белоксинтезирующих органеллах, и включает 5 ключевых элементов: матрица – матричная РНК, растущая цепь – полипептид, субстрат для синтеза – 20 протеиногенных аминокислот, источник энергии – ГТФ, рибосомальные белки, рРНК и белковые факторы. Механизмы трансляции прокариот и эукариот существенно отличаются, поэтому многие вещества, подавляющие прокариотическую трансляцию, в значительно меньшей степени действуют на трансляцию высших организмов, что позволяет использовать их в медицинской практике как антибактериальные средства безопасные для организма млекопитающих. Процесс трансляции разделяют на 1. инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза. 2. элонгацию — собственно синтез белка. 3. терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта. Транспортная РНК (тРНК) выполняет две функции: транспортную т.е. осуществляет транспорт активированных аминокислот к месту синтеза белка и адапторную, т.е. определяет место аминокислоты в первичной структуре строящегося белка. Полисома это несколько рибосом, одновременно транслирующих одну молекулу иРНК. Концентрируются полисомы в местах, где нужен быстрый синтез большого количества белка. Это и есть их главная биологическая роль. 12. Фолдинг белков. Посттрансляционные модификации белков и аминокислот. Фолдинг – сворачивание пептидной цепи в правильную трехмерную структуру. Молекулы, ускоряющие фолдинг, называются катализаторами фолдинга. Молекулы, служащие для изменения формы белка, — шаперонами фолдинга. При нарушении функции шаперонов и отсутствии фолдинга в клетке формируются белковые отложения – развивается амилоидоз. Насчитывают около 15 вариантов амилоидоза. Посттрансляционной модификацией белков называют изменение первичной структуры полипептидной цепи после завершения или во время ее синтеза рибосомами: т.е. это химические превращения, изменяющие ковалентную структуру полипептидной цепи. К основным реакциям процессинга относятся: 1. Удаление с N-конца метионина или даже нескольких аминокислот специфичными аминопептидазами. 2. Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина. 3. Частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ. 4. Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам белковой цепи: фосфорной кислоты, карбоксильной группы, метильной группы, гидроксильной группы, йода Функциональное значение посттрансляционной модификации 1. Увеличенивают разнообразие белковых молекул (структурное и функциональное); Обеспечивают : 1. Правильную сборку белков; 2. Регуляцию активности белков; 3. Передачу сигнала и др. 13. Регуляция экспрессии генов у прокариот. Оперон. Индукция lac-оперона. Репрессия Thr- (Нis-) –оперона. Экспрессия генов — это реализация заложенной в них информации, то есть синтез РНК и белков. Практически полностью осуществляется на уровне транскрипции Единицей транскрипции генов у прокариот является оперон Оперон – это функциональная единица, которая находится в геноме прокариот и включает в себя цистроны (единицы транскрипции), которые кодируют последовательно работающие белки одним или несколькими промоторами. Оперон позволяет эффективно регулировать транскрипцию генов. Оперон включает в себя: - промотор – участок присоединения РНК-полимеразы - оператор – участок присоединения белка-регулятора - терминатор – участок окончания синтеза генов оперона - ген-регулятор – кодирует белок регулятор Негативная регуляция – связывание регуляторного белка с оператором репрессирует работу оперона Позитивная регуляция – связывание регуляторного белка с оператором активирует оперон Кроме того известны вещества – индукторы и репрессоры, которые также могут влиять на регуляторный белок (репрессировать или стимулировать) Механизм индукции Lac-оперона • В отсутствии индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором, что препятствует связыванию РНКполимеразы с промотором, транскрипция структурных генов не происходит. • При появлении в среде индуктора он присоединяется к белку-репрессору и уменьшает его сродство к оператору. • РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены. Механизм репрессии синтеза ферментов, участвующих в образовании гистидина • При отсутствии в среде гистидина белокрепрессор неактивен и не связывается к оператору. • РНК-полимераза связывается к промотору, транскрибирует гены, происходит синтез ферментов, необходимых для образования гистидина. • При добавлении в среду гистидина (корепрессор), он связывается к белкурепрессору, повышая его сродство к оператору. • Комплекс репрессор-корепрессор присоединяется к оператору, прекращается транскрипция генов. 14. Регуляция экспрессии генов у эукариот. Механизмы регуляции. Разделение ДНК на эухроматин и гетерохроматин. Изменение количества генов. Генетическая рекомбинация. Регуляция транскрипции. Альтернативный сплайсинг. Редактирование мРНК (апобелки). Регуляция трансляции. Неспецифическая регуляция экспрессии Контроль на уровне стабилизации м-РНК – избирательная стабилизация определенных типов м-РНК в цитоплазме, которые не подвергаются распаду после трансляции Контроль на уровне трансляции – отбор определенных м-РНК для трансляции на рибосомах Контроль на уровне пострансляционной модификации белка. Механизмы регуляции: ранскрипционная регуляция включает в себя механизмы предотвращающие синтез мРНК: Организация и статус хроматина • Модификации гистонов • ДНК-метилирование Транскрипционные факторы • Энхансеры • Сайленсеры • Инсуляторы. Посттранскрипционная регуляция включает в себя механизмы контролирующие или регулирующие мРНК после синтеза. • Альтернативный сплайсинг • Скорость транспорта мРНК через ядерную мемрану • Время жизни мРНК. Трансляционная регуляция включает в себя механизмы предотвращающие синтез белка. • Как правило, очень часто речь идет о белковых факторах необходимых для трансляции • Предотвращение рибосом от связывания с мРНК • Факторы инициации трансляции. Посттрансляционная регуляция включает в себя механизмы действующие на белок после его синтеза. • Активация белков, Деградация белков. Эухроматин – основная часть митотических хромосом, в которой локализована большая часть функциональных генов. Эухроматин претерпевает обычный цикл компактизации-декомпактизации во время митоза. Гетерохроматин – участки хромосом, находящиеся в конденсированном (упакованном) состоянии в течение всего клеточного цикла. Таким образом, гетерохроматиновые участки в генетическом отношении являются практически неактивными. Различают конститутивный (истинный, постоянный) и факультативный (временный) гетерохроматин. Амплификация (или увеличение числа) генов используется организмом в том случае, когда возникает необходимость увеличить синтез определённого генного продукта. Многие гены, кодирующие белки или РНК, необходимые организму в больших количествах (например, гистоны, рРНК, тРНК), постоянно присутствуют в амплифицированном соетрянии. К числу генов, для которых обнаружена амплификация, относят ген металлотионеина. Утрата генетического материала - довольно редкий способ регуляции. Наиболее яркий пример потери всех генов за счёт разрушения ядра - процесс созревания эритроцитов. Нестабильны амплифицированные гены, двойные хромосомы. Они, как правило, исчезают в последующих генерациях. Утрата генетического материала происходит в процессе созревания лимфоцитов и образования плазматических клеток разных клонов, синтезирующих секретируемые формы иммуноглобулинов. Генетическая рекомбинация — взаимодействие между двумя различными геномами, которое приводит к образованию рекомбинаций ДНК и формированию дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей. Типы генетических рекомбинации: гомологичная — в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии; сайт-специфическая — происходит только в определенных участках генома и не требует высокой степени гомологии ДНК (напр., включение плазмиды в хромосому бактерии). Регуляция транскрипции у прокариот: Оперон, конституитивные гены, индуцибельные гены, ген-регулятор, ген-оператор. Предложены две схемы регуляции скорости транскрипции: по механизму индукции (лактозный оперон) и по механизму репресии (триптофановый оперон). Регуляция транскрипции у эукариот Амплификация, Энхансеры, Сайленсеры, Перестройка генов, Процессинг мРНК, Изменение стабильности мРНК Альтернативный Вариант сплайсинга матричных РНК, при котором в ходе экспрессии гена на основе одного и того же первичного транскрипта происходит образование нескольких зрелых мРНК. Отдельные экзоны транскрипта при определённых условиях могут быть как включены в зрелую мРНК, так и пропущены. Пример: Создание антител, Гены нейрексинов, гены кальцитонина. Первичная структура мРНК изменяется(«редактируется») после транскрипции. Последовательность нуклеотидов в таких генах одинакова, а транскрибируемая в разных тканях мРНК различается в результате появления в молекуле замен, вставок или выпадений нуклеотидов. Апобелки (апопротеины) – специфические транспортные белки, ответственные за формирование липидов, их превращение в кровеносном русле и в клетках. Существует три основных способа регуляции трансляции. 1. Позитивная регуляция на основе сродства мРНК к инициирующей рибосоме и факторам инициации (дискриминация мРНК). 2. Негативная регуляция с помощью белков-репрессоров, которые, связываясь с мРНК, блокируют инициацию (трансляционная репрессия). Этими двумя способами регулируются индивидуальные мРНК, т. е. трансляция каждой мРНК может специфически контролироваться независимо от других мРНК клетки. 3. Тотальная регуляция трансляции всей совокупности мРНК клетки посредством модификации факторов инициации. 15. Ингибиторы матричных биосинтезов. - соединения, вызывающие нарушение процесса синтеза ДНК, РНК или белка Вирусы, токсины При заражении, вирусы в эукариотических клетках прекращают синтез нуклеиновых кислот, белков. Энергетические ресурсы и ферментные системы клетки используются для воспроизведения вирусных частиц (вирус оспы, полимиелита, гриппа и др.) Токсин бледной поганки Amanita phalloides - α-аманитин. Энтеротоксин возбудителя дифтерии В медицине ингибиторы матричных биосинтезов используются для лечения инфекционных заболеваний, опухолевых процессов. Ингибиторы репликации противоопухолевые препараты Ингибиторы транскрипции и трансляции антибактериальные препараты Интерфероны - Обладают высоким неспецифическим противовирусным агентом 16. Идентификация специфических последовательностей ДНК полимеразной цепной реакцией. Этапы ПЦР. Значение для медицины. Один цикл полимеризации включает 3 этапа: плавление: на этой стадии реакционную смесь нагревают до температуры 90-97 °С. Исследуемая двуцепочечная ДНК денатурирует и переходит в однонитевую форму; гибридизация или отжиг ДНК с праймерами. В результате снижения температуры до 50-60 °С происходит комплементарное связывание праймеров с цепями матричной ДНК и образование двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК; элонгация, удлинение нитей ДНК, комплементарных матричной ДНК, катализирует Taq-полимераза в направлении от 5'- к 3'-концу. Значение: Анализ содержания ГМО в продуктах питания; Установление отцовства; Криминалистика: «Генетические отпечатки пальцев»; В медицине: Диагностика наследственных заболеваний; Диагностика инфекционных заболеваний; Контроль эффективности лечения; Персонализированная медицина. Прикладное применение ПЦР. 17. Этапы технологии рекомбинантных ДНК. Значение для медицины получения клонируемых генов и рекомбинантных белков. Технология создания и использования рекомбинантных ДНК включает следующие основные этапы: 1) получение целевого гена; 2) соединение этого гена с вектором (получение рекомбинантной ДНК); 3) введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина; 4) отбор клеток, содержащих целевой ген; клонирование гена. Рекомбинантные белки, синтезированные в системах экспрессии S. сегеvisiае, применяют в качестве вакцин и лекарственных препаратов Придавать новые свойства существующим белкам, создавать уникальные ферменты возможно, производя специфические изменения с помощью плазмид или ПЦР. Клонированные гены позволяют получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. 18. Механизмы генетической изменчивости. А. Мутагенез: Мутации также делятся на генные, геномные и хромосомные. Генные, или точечные, мутации бывают в основном 3 видов: замены, при которых одно азотистое основание в ДНК замещается на другое; вставки, обеспечивающие внедрение в молекулу ДНК одного или нескольких дополнительных нуклеотидов; делеции (или выпадения) одного или нескольких нуклеотидов, при которых происходит укорочение молекулы ДНК. Б. Организация генома человека. В. Полиморфизм белков. Г. Наследственные болезни. Транспозоны — участки ДНК, удаляемые из одного локуса хромосомы и встраиваемые в другой локус той же или другой хромосомы. Ретротранспозоны не покидают исходного положения в молекуле ДНК, но могут копироваться, и копии встраиваются, подобно транспозонам, в новый участок. Включаясь в гены или участки около генов, они могут вызывать мутации и изменять их экспрессию. 19. Использование ДНК-технологий в медицине. ДНК-ТЕХНОЛОГИИ В МЕДИЦИНЕ: Генная инженерия Генотерапия Культивирование органов и тканей Клонирование Получение лекарственных препаратов: Вакцины (против вируса гепатита В) Белки(инсулин, гормон роста, фактор VIII и др.) Генодиагностика Терапия Карта генома человека. С/х, криминалистика, палеонталогии, ДНК-генеалогии человека. Задачи Задача 2.4.1 В препаратах ДНК, выделенных из двух неидентифицированных видов бактерий, молярное содержание аденина 32 и 17 % от общего содержания оснований. Какие относительные количества тимина, гуанина и цитозина вы предполагаете найти в этих двух препаратах ДНК? Одна из этих бактерий является термофильной. Какая из ДНК принадлежит именно этой бактерии? На чем основывается ваш ответ? Решение: Согласно правилу Чаргаффа (соотношение пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК равно) Аденин + Гуанин = Tимин + Цитозин, кроме этого Аденин комплементарен Tимину, а Гуанин комплементарен Цитозину, причем между Аденином и Тимином образуется две водородной связи, а между Цитозином и Гуанином три. Первый вид бактерий: количество Аденина = 32%, соответственно и количество комплементарного Тимина = 32%, количество Гуанина можно рассчитать, приняв общее количество всех азотистых оснований за 100%. Количество Гуанина = 100% - 64% / 2 = 18%, и следовательно количество комплементарного Цитозина тоже = 18%. Рассчитываем количество азотистых оснований у второго вида бактерий аналогично. Аденина = 17% , Тимина = 17%, Гуанина = 100% - 34% / 2 = 33%, и следовательно Цитозина тоже = 33%. Термофильной является вторая бактерия, потому что комплементарных пар Тимин-Цитозин больше, по сравнению с последовательностью ДНК первой бактерии, так как между ними образуется три водородных связи, следовательно, атомы азота и водорода связаны прочнее. Задача 2 Напишите нуклеотидную последовательность одной цепи двухцепочечной ДНК, другая цепь которой имеет последовательность 5’-ATGCCGTATGCATTC-3’. Напишите последовательность РНК-транскрипта для обеих этих цепей. 2. Одна цепь ДНК 5’-TACGGCATACGTAAG-3’. РНК-транскрипт к 1-й ДНК цепи: 5’-UACGGCAUACGUAAG-3’, ко 2-й ДНК цепи 5’-AUGCCGUAUGCAUUC-3’. |