153. Комплекс Гольжди. Строение. Функция. Комплекс Гольджи
 Скачать 0.78 Mb.
|
|
268. Принцип метода секвенирования ДНК. . Секвенирование ДНК - определение аминокислотной или нуклеотидной последовательности ДНК. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов При секвенировании по Сенгеру происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице. Раствор с праймером распределяют по четырём пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырёх 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырёх пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. 269. Структура генома. Геном клетки человека состоит из следующих участков: 1. Уникальных генов (Это гены представленные в геноме в одном экземпляре. К таким генам относятся некоторые структурные и регуляторные гены.). 2. Семейств генов (Набор генов, возникший от некоего гена-предка путем дупликации и последующих изменений. В семейство могут входить три типа генов: 1)функционирующий ген или его копии, 2)нефункционирующие копии – псевдогены и 3)функционирующие мутантные гены. 3.Регуляторных зон (Эти зоны ДНК постоянно присутствуют в геноме человека. К ним относятся терминатор, трейлерные и лидирующие последовательности нуклеотидов, промотор, модуляторы и т.д. Все эти участки регулируют транскрипцию и другие генетические процессы.) 4. Повторяющихся участков ДНК, которые несут какую-либо функцию, т.е. участвуют в каких-любо генетических процессах (транскрипции, тансляции, репликации, репарации, процессинге и т.д.). 5. Повторяющихся участков ДНК, у которых в настоящее время достоверно не выявлено какой-либо функции. Однако предполагают, что эти участки могут участвовать в процессах упаковки ДНК . 6. Транспозонов (сегменты ДНК обладающие способностью перемещаться в другие геномные локусы, иногда существенно изменяя экспрессию соседних генов.) . 270) Комплементарная, клонированная, рекомбинантная ДНК. Клонирование ДНК. -Ферменты рестриктаз, способных разрезать двойную спираль ДНК по специфической последовательности из 4-8 нуклеоти на фрагменты строго определённого размера, вызывают ступенчатые разрывы, в результате чего на концах фрагментов ДНК образуются короткие одноцепочечные «липкие хвосты», которые могут комплиментарно связываться с подобными «липкими хвостами», образовавшимися под действием того же фермента. Благодоря «липким хвостам» можно присоединить фрагмент ДНК, содержащий гены человека, к ДНК вируса. Если полученную рекомбинантную молекулу ДНК ввести в бактериальную клетку, то за счёт репликационной активности вируса за короткое время можно получить (клонировать) миллионы молекул вирусной ДНК, содержащей гены человека. Методы клонирования позволяют получать интересующую ДНК в достаточном количестве для последующего анализа. Комплементарная ДНК — это ДНК, синтезированная на матрице зрелой мРНК в реакции, катализируемой РНК-зависимой ДНК-полимеразой. -В процессе синтеза белка ДНК транскрибируется в мРНК, и мРНК далее транслируется в белки. Одним из различий между прокариотами и эукариотами является то, что гены эукариот могут содержать интроны — некодирующие последовательности, которые вырезаются из незрелой мРНК в процессе сплайсинга. Гены прокариот не имеют интронов, поэтому прокариотические мРНК не подвергаются сплайсингу. Рекомбинантная ДНК — искусственно созданная последовательность ДНК, части которой могут быть синтезированы химическим путём, с помощью полимеразной цепной реакции или клонированы из ДНК различных организмов. -Рекомбинантные ДНК могут быть трансформированы в клетки живых организмов в составе плазмид или вирусных векторов. 271) Полиморфные гены. Полиморфизм — способность некоторых организмов существовать в состояниях с различной внутренней структурой или в разных внешних формах. Полиморфизм может быть обусловлен внутривидовыми генетическими различиями. -Так же возможен полиморфизм, при котором организмы с практически идентичным геномом в зависимости от внешних условий приобретают различные фенотипические формы. Однонуклеотидный полиморфизм — отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид в геноме (или в другой сравниваемой последовательности) представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом. Используется в качестве генетического маркера. 272) Тандемные повторы генома человека. Тандемные повторы – это нуклеотидные пары, которые могут встречаться с разной частотой. В зависимости от размера они подразделяются на 3 класса: -Сателлитная ДНК, в которых количество повторяющихся пар нуклеотидов от 100 до нескольких сотен, а у высокоповторяющихся сателлитов до более чем 1 миллиона нуклеотидов. -Минисателлиты. Встречаются более чем в 1000 местах генома человека. Находятся в конце хромосом (в теломерах). Число повторяющихся пар нуклеотидов от 7 до 100. Могут быть использованы как маркеры в популяционно-генетических исследованиях. -Микросателлиты. Число повторяющихся пар нуклеотидов от 1 до 6. Могут быть использованы как маркеры в популяционно-генетических исследованиях. 273. Дифференциальное окрашивание хромосом. Дифференциальное окрашивание хромосом - метод окрашивания хромосом специальными красителями, которые выявляют определенные диски или области хромосомы. Диски придают хромосомам характерный вид, и это позволяет с большей точностью идентифицировать индивидуальные хромосомы. Наиболее часто используемым является метод с окраской хромосом красителем Гимза. Препараты хромосом при этом способе окраски сначала обрабатывают трипсином, который удаляет белки, содержащиеся в хромосоме. Затем на препарат наносят краситель Гимза, который выявляет в хромосомах характерный для каждой из них рисунок из светлых и темных сегментов. Обычно на гаплоидный набор можно насчитать до 400 сегментов. Подсчитано, что каждый сегмент содержит в среднем около 8 млн. п.н. Если хромосомы перед окраской Гимза сначала нагревают, то рисунок полос сохраняется, но их цвет меняется на противоположный, т.е. темные полосы становятся светлыми, и наоборот. Этот метод окраски хромосом называется обратным бэндингом, или R-методом. Если до применения красителя Гимза препарат хромосом сначала обрабатывают кислотой, а затем щелочью, то окрашиваются преимущественно центромеры и другие районы, богатые гетерохроматином, содержащие высокоповторяющиеся последовательности ДНК (С-окраска). Q-окраска хромосом выявляется с помощью флюоресцентной микроскопии хромосом, которые могут быть окрашены разными флюорохромами. Из последних чаще всего используют производные акридина: акрихин и акрихин-иприт. Разработаны также высокоразрешающие методы дифференциальной окраски хромосом на стадии прометафазы клеточного деления. Они позволяют выявлять до 800 поперечных полос на гаплоидный набор хромосом. 274. Методы цитогенетики. 1.Флуоресцентная гибридизация in situ, или метод FISH — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях. Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике, в диагностике онкологических заболеваний, в ретроспективной биологической дозиметрии. 2. Сравнительная геномная гибридизация (СГГ) — это применение метода FISH для широкого скрининга генома с целью выявить различия в числе копий любых нуклеотидных последовательностей ДНК у пациента. СГГ была разработана для генетических исследований в сфере онкологии (первичные солидные опухоли), но в настоящее время применяется для определения локализации избыточного генетического материала или зон выпадения участков хромосом при предполагаемых хромосомных аномалиях. Этот метод молекулярно-генетической диагностики заключается в смешивании и одновременной гибридизации равных количеств меченной различными красителями тестируемой ДНК (например, меченной зеленым флюоресцирующим красителем) и нормальной референтной ДНК (например, красный флюоресцирующий краситель) с нормальными нитями в метафазе. В результате получают определенное соотношение зеленой и красной флюоресценции. При этом зоны амплификации тестируемой ДНК (многократного копирования) выявляются как зоны избыточной концентрации зеленого красителя, зоны выпадения — как красные участки, отражающие дефицит тестируемой ДНК, а при равном соотношении тестируемой и нормальной ДНК имеются области желтого цвета. Таким образом, СГГ позволяет получить карту нуклеотидных последовательностей ДНК в геноме. К преимуществам данного метода молекулярно-генетической диагностики относится возможность его применения к любой ткани. Метод не может выявить сбалансированные хромосомные аномалии, при которых количество копий ДНК не меняется. Разрешающая способность метода не позволяет идентифицировать хромосомные копии размером меньше 10 Мб, а также изменения числа копий, если выпадение участков хромосом или избыточный хромосомный материал содержатся менее чем в 50% анализируемых клеток . 3. Спектральное кариотипирование и многоцветная FISH Ограничение возможностей СГГ при выявлении сбалансированных хромосомных перестроек восполняется с помощью многоцветного окрашивания всех хромосом при однократной гибридизации. Спектральное кариотипирование и многоцветная FISH (M-FISH) — взаимосвязанные методы молекулярно-генетического анализа, которые способны идентифицировать сбалансированные хромосомные перестройки. При обоих методах молекулярно-генетической диагностики каждая из хромосом в метафазе маркируется специфическим цветом, что позволяет одновременно визуализировать всю совокупность хромосом. 24 маркированных хромосомных зонда и 5 флюорохромов применяются в комбинации, что приводит к созданию комбинаторной схемы, в которой каждая из 22 аутосом, а также X- и Y-хромосомы окрашены в разные цвета. M-FISH требует применения специфических комплектов фильтров для каждого из 5 флюорохромов; при спектральном кариотипировании применяются спектроскопия и интерферометр для оценки паттернов флюоресцентной эмиссии. Эти методы позволяют выявить сложные хромосомные перестройки, мелкие транслокации и маркированные хромосомы. Недостатки методов включают невозможность идентифицировать мелкие интрахромосомные делеции или дупликации, а также перицентрические или парацентрические инверсии. 4. Полимеразная цепная реакция Хотя при некоторых заболеваниях большая часть мутаций возникает в результате крупных делеций ДНК, которые выявляются с помощью саузерн-блоттинга, большинство аномалий генов, лежащих в основе многих заболеваний, представляют собой точечные мутации. После обнаружения точечной мутации можно синтезировать конструкции ДНК (праймеры), покрывающие короткий участок, пораженный мутацией. Получение достаточного количества копий измененной ДНК может быть сложно, но ПЦР предоставляет множественные копии специфических фрагментов ДНК. При ПЦР амплификация ДНК осуществляется путем повторных тепловых циклов. ПЦР произвела революцию в диагностике мутаций. Это высокочувствительный, стандартизированный и автоматический метод молекулярно-генетической диагностики, который можно проводить на малом количестве образцов. Метод относительно недорог, в течение нескольких часов можно получить миллиарды копий специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. 5. Прямое секвенирование ДНК Автоматизированное секвенирование ДНК стало стандартным методом молекулярно-генетической диагностики во многих клинических лабораториях молекулярной генетики и способствовало значительному прогрессу «Проекта генома человека». Секвенирование ДНК особенно полезно в случаях небольших генов и в ситуациях, когда точная мутация у членов данной семьи неизвестна. Все выявленные изменения в структуре гена должны быть тщательно проанализированы, чтобы понять, лежат ли они в основе заболевания или относятся к нормальному полиморфизму. 6. Саузерн-блоттинг — это первый метод молекулярно-генетической диагностики на молекулярном уровне. Сейчас он в значительной степени вытеснен методами, основанными на ПЦР, и прямым секвенированием ДНК. С помощью саузерн-блоттинга выделяют геномную ДНК пациента и разрезают ее на мелкие фрагменты с помощью рестриктаз (ферменты бактерий, которые расщепляют ДНК в строго специфических сайтах). Полученные фрагменты разделяют по размеру с использованием электрофореза в агарозном геле, переносят с помощью блоттинга на стабильный нейлоновый фильтр, фиксируют на фильтре, проводят гибридизацию с радиоактивно меченным ДНК-зондом, после чего проводят радиоавтографию. Данный метод молекулярно-генетической диагностики позволяет выявлять мутации, если они изменяют длину фрагмента ДНК (сайт рестрикции), что изменяет результирующую картину ферментного расщепления. Саузерн-блоттинг по-прежнему наиболее часто применяется для выявления сцепления гена со специфическим врожденным полиморфизмом ДНК. Можно также проследить распространение гена у других членов семьи, даже если специфический молекулярный дефект, ассоциированный с наследственным заболеванием, не может быть идентифицирован. При нозерн-блоттинге анализируются структура и количество мРНК, продуцированной специфическим геном. Расщепление РНК рестрикционными ферментами невозможно. Длина транскриптов различных РНК зависит от размера и количества экзонов в гене. Таким образом, мутации, которые изменяют количество или длину экзонов, можно определять в результате выявляемых изменений РНК при нозерн-блоттинге. Методика идентична саузерн-блоттингу, за тем исключением, что исследуется общая РНК клеток или очищенная мРНК, а не расщепленная рестриктазами ДНК. Вестерн-блоттинг дает информацию о размере и количестве мутантных белков в клеточных экстрактах, полученных от пациентов со специфическими генетическими заболеваниями. Белки из клеточных экстрактов разделяют по размеру с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на мембрану. Затем мембрану инкубируют со специфическими антителами к белкам. Вторичные антитела (направленные против первых антител), меченные флюоресцирующим красителем Этот метод молекулярно-генетической диагностики применяется для определения наличия или отсутствия, а также размера мышечного белка дистрофина у пациентов с Х-сцепленной мышечной дистрофией. 7. Методы ДНК-анализа Молекулярные цитогенетические методы повышают диагностические возможности для выявления хромосомных делеций или дупликаций (содержащих десятки или сотни генов). Другие методы ДНК-анализа позволяют выявить изменения в отдельных генах. Проведение ДНК-анализа возможно в связи с тем, что ДНК — это относительно стабильная молекула, которая может быть изолирована из любых ядросодержащих клеток и сохранена для дальнейших исследований. Наиболее часто ДНК выделяют из лейкоцитов; другие ткани, применяющиеся для этого, включают амниотические клетки и ворсины хориона (при пренатальной диагностике), клетки, полученные из мазка со слизистой оболочки щеки, и фибробласты, полученные при биопсии кожи. При заборе этих тканей, как правило, удается выделить достаточное количество ДНК. Современные методы молекулярно-генетической диагностики, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют амплификацию ДНК, полученной всего из одной или нескольких цепей. 275. Что такое полиморфизм генов? Полиморфизм - это локальные изменения в нуклеотидной последовательности ДНК в пределах генома у индивидуумов в популяции. Эти изменения могут встречаться, как внутри смысловых (внутри экзонов), так и вне смысловых (например, в интронах и др.) нуклеотидных последовательностях ДНК. Так ген CCR5 у подавляющего числа людей имеет строго определённую последовательность нуклеотидов. В Европе таких людей около 92%. Но, примерно, у 9% населения в этом гене имеется мутация (выпало несколько нуклеотидов), которая привела к укорочению гена. Люди с укороченным геном не болеют иммунодефицитом человека (СПИД) 276. Что такое полиморфизм генов? ДНК полиморфизмы - различные наследуемые вариации в структуре ДНК. ДНК-полиморфизмы – это вариабельные участки в последовательности ДНК, которые встречаются в популяции с частотой не менее 1%, и в подавляющем большинстве случаев обладают нейтральным эффектом. Существуют также полиморфизмы, способные повлиять на степень экспрессии генов, активность функциональных продуктов (белков, РНК) и структуру белков. 277. Хромосомные заболевания человека, связанные с аутосомами. Хромосомные болезни — наследственные заболевания, обусловленные изменением числа или структуры хромосом. К хромосомным относятся болезни, обусловленные геномными мутациями или структурными изменениями отдельных хромосом. Хромосомные болезни возникают в результате мутаций в половых клетках одного из родителей. Из поколения в поколение передаются не более 3—5 % из них. Хромосомными нарушениями обусловлены примерно 50 % спонтанных абортов и 7 % всех мёртворождений. Все хромосомные болезни принято делить на две группы: аномалии числа хромосом и нарушения структуры хромосом. Болезни, обусловленные нарушением числа хромосом • синдром Дауна — трисомия по 21 хромосоме, к признакам относятся: слабоумие, задержка роста, характерная внешность, изменения дерматоглифики; • синдром Патау — трисомия по 13 хромосоме, характеризуется множественными пороками развития, идиотией, часто — полидактилия, нарушения строения половых органов, глухота; практически все больные не доживают до одного года; • синдром Эдвардса — трисомия по 18 хромосоме, нижняя челюсть и ротовое отверстие маленькие, глазные щели узкие и короткие, ушные раковины деформированы; 60% детей умирают в возрасте до 3-х месяцев, до года доживают лишь 10%, основной причиной служит остановка дыхания и нарушение работы сердца. Болезни, причиной которых является полиплоидия • триплоидии, тетраплоидии и т. д.; причина — нарушение процесса мейоза вследствие мутации, в результате чего дочерняя половая клетка получает вместо гаплоидного (23) диплоидный (46) набор хромосом, то есть 69 хромосом (у мужчин кариотип 69, XYY, у женщин — 69, XXX); почти всегда летальны до рождения. Нарушения структуры хромосом. • Транслокации — обменные перестройки между негомологичными хромосомами. • Делеции — потери участка хромосомы. Например, синдром кошачьего крика связан с делецией короткого плеча 5-й хромосомы. Признаком его служит необычный плач детей, напоминающий мяуканье или крик кошки. Это связано с патологией гортани или голосовых связок. Наиболее типичным, помимо «кошачьего крика», является умственное и физическое недоразвитие, микроцефалия (аномально уменьшенная голова). • Инверсии — повороты участка хромосомы на 180 градусов. • Дупликации — удвоения участка хромосомы. • Изохромосомия — хромосомы с повторяющимся генетическим материалом в обоих плечах. • Возникновение кольцевых хромосом — соединение двух концевых делеций в обоих плечах хромосомы. |