клиническая лабораторная диагностика туберкулеза. Туберкулез. 4. Исследование мокроты
 Скачать 38.46 Kb.
|
|
Содержание 1.Введение………………………………………………………………………………...3 2.Общеклинические анализы………………………………………………………....…4 3. Изменения биохимических показателей крови……………………………………..5 4.Исследование мокроты……………………………………………………………......6 5.Прямая бактериоскопия……………………………………………………………....8 6.Люминесцентная бактериоскопия……………………………………….…………..10 7.Метод флотации…………………………………………………………………….…11 8.Иммуноферментный анализ………………………………………………………….11 9.Бактериологическое исследование……………………………………………..……13 10.Бронхоальвеолярный лаваж…………………………………………………………14 11.Список литературы…………………………………………………………………..15 1.Введение Методы лабораторной диагностики туберкулеза весьма разнообразны как по характеру производимых исследований, так и по тому патологическому материалу, который подвергается исследованию. Кроме общепринятых исследований, используемых в практике при различных заболеваниях, в клинике туберкулеза применяются специальные лабораторные методы, связанные со спецификой этого заболевания. Получаемые результаты оказывают помощь клиницистам в дифференциальной диагностике процессов различной локализации, способствуют раннему выявлению туберкулеза, учитываются при выборе тех или иных методов лечения и определения его эффективности; в ряде случаев они имеют прогностическое значение, а так же помогают в оценке эпидемиологической ситуации. В настоящее время, когда организационно-методические и научно- исследовательские мероприятия направлены на снижение заболеваемости туберкулезом, роль лабораторных исследований значительно возросла. Перед работниками лабораторий поставлены задачи расширять возможности диагностики и определить для клиницистов значение различных исследований в современных условиях полихимиотерапии. Одним из основных направлений в лабораторной диагностике туберкулеза является установление факта бактериовыделения, либо подтверждение его прекращения (абациллирования). Поэтому, методике выявления возбудителя в различном патологическом материале должно уделяться большое внимание. Правильное суждение о динамике бактериовыделения, стойкости достигнутого в процессе лечения абациллирования важно для правильного планирования организации противотуберкулезной службы и осуществления противотуберкулезных мероприятий как на стационарном, так и на амбулаторном этапе. В клинике туберкулеза представляет интерес изучение различных свойств выделенных культур, их лекарственная чувствительность, ферментативная активность, вирулентность, типовая принадлежность. Это имеет значение для выбора наиболее рационального метода лечения и для прогноза заболевания. Работники бактериологических лабораторий должны быть знакомы с методами дифференциации атипичных микобактерий. Туберкулезу нередко сопутствуют неспецифические заболевания легких, что диктует необходимость широкого изучения неспецифической микрофлоры и грибковых инвазий. Эти исследования являются неотъемлемой частью всего комплекса дифференциальной диагностики туберкулеза. При туберкулезе имеется определенная специфика гематологических исследований. Результаты, получаемые при различных анализах крови, позволяют судить об активности процесса, об аллергической настроенности организма больного, они имеют определенное прогностическое значение. Дифференциально-диагностические возможности в настоящее время значительно увеличились благодаря разработке методов, позволяющих получать пунктаты из различных органов, для последующего цитологического 3 исследования, появлению ПЦР-диагностики, внедрению автоматизированных систем бактериологической диагностики микроорганизмов (Bactec MGIT). Выполнение современных методов исследования различного патологического материала требует высокой эрудиции лабораторных работников, а правильное толкование получаемых результатов – знакомства клиницистов с основными методами лабораторных исследований. 2.ОБЩЕКЛИНИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ При обследовании больных туберкулезом должны производиться следующие гематологические исследования: скорость оседания эритроцитов, определение количества эритроцитов и гемоглобина, подсчет общего количества лейкоцитов в счетной камере и их процентного состава в мазках крови. При наличии анемии рекомендуется определять количество ретикулоцитов для суждения о регенерационной способности костного мозга, в дифференциально- диагностических случаях – количество тромбоцитов . Специалисты клинической лабораторной диагностики должны учитывать возможность возникновения своеобразных реакций кроветворных органов при туберкулезе и изменения картины крови при лечении антибактериальными препаратами. Для решения вопроса об активности туберкулезного процесса могут быть применены: определение гематологических сдвигов при проведении пробы Коха, исследование фагоцитарной активности лейкоцитов крови и их сенсибилизация к туберкулину и некоторым другим антигенам. Сдвиги в гемограмме. Туберкулезная инфекция не является сильным раздражителем кроветворной системы, и это обуславливает отсутствие специфической для туберкулеза картины крови, и развитие преимущественно незначительных сдвигов в гемограмме. Изменения гематологических показателей находятся в зависимости от характера процесса, тяжести течения, реактивности организма, состояния его защитных сил. При этом гемограмма больше отражает фазу процесса, чем его клиническую форму. Это положение относится в основном к фазе инфильтрации. Даже у больных с распространенными деструктивными формами туберкулеза, при достаточных компенсаторных возможностях и отсутствии свежих воспалительных изменений, картина крови может быть нормальной. При обострении туберкулезного процесса наиболее постоянными гематологическими изменениями являются палочкоядерный сдвиг (влево) нейтрофилов и ускорение СОЭ. Сдвиг влево в большинстве случаев бывает небольшим. Общее количество лейкоцитов у большинства пациентов находится в пределах нормы, при остром и тяжелом течении туберкулеза имеют место лейкоцитоз, чаще не превышающий 15 х 10-9 /л, и более резкий сдвиг влево. Повышение количества лейкоцитов, нередко с появлением в крови молодых форм нейтрофильного ряда – метамиелоцитов и миелоцитов, имеет место при 5 присоединении неспецифических воспалительных процессов, что должно быть отдиференцировано в клинике. У больных туберкулезом в группе лимфоцитов крови преобладают узкопламенные формы. В фазу вспышки туберкулезного процесса нередко наблюдается снижение числа лимфоцитов. Выраженная лимфопения свидетельствует о тяжести процесса. Высокие цифры лимфоцитов отмечаются при стабилизации очаговых изменений в легких. На количестве лимфоцитов сказывается также методика подсчета лейкоцитарной формулы: лимфоциты, находящиеся в большем числе в центральных отделах мазка, при подсчете через весь мазок определяются, соответственно, в большем проценте, чем при счете по его краю. Эозинофилы при обострении процесса могут, как оставаться в пределах нормы (2-4%), так и уменьшается (до 0,5%) или переставать определяться. Последнее, является неблагоприятным показателем. Выраженная эозинофилия связана с аллергическими явлениями, которые часто являются следствием приема антибактериальных препаратов. Не следует забывать о возможности развития летучих эозинофильных инфильтратов (аллергическая пневмония). Моноцитоз в клинике туберкулеза бывает связан с формированием новых бугорков в органах. Стойкое, длительно держащееся повышение количества моноцитов (предел нормы 4-8%) имеет место при первичном туберкулезе, что обусловлено характерным для него гематогенным распространением возбудителя по органам, а также (в меньшей степени) при гематогенно-диссеминированных процессах. При тяжелом, осложненном течении первичного туберкулеза и, реже, при вторичных формах наблюдается монопения (2-3%), свидетельствующая об угнетении ретикуло-гистиоцитарной системы. В последующем, наряду с нормализацией показателей гемограммы, может наблюдаться моноцитоз, который должен расцениваться как благоприятный признак, отражающий восстановление функции ретикуло-гистиоцитарной системы. Отражаемые лейкоцитарной формулой процентные соотношения отдельных групп клеток коррелируют с их абсолютными величинами лишь при нормальном общем количестве лейкоцитов. При значительном увеличении или уменьшении общего числа лейкоцитов крови следует уточнять, за счет какой группы клеток это происходит, т.е. учитывать не только относительные, но и абсолютные числа. Со стороны красной крови у больных туберкулезом чаще определяется небольшое снижение гемоглобина и значительно реже снижение количества эритроцитов, т.е. имеет место уменьшение насыщения эритроцитов гемоглобином. Выраженная анемия может возникнуть при внелегочных поражениях с наличием казеозных изменений, в частности при первичном туберкулезе с поражением лимфатических узлов, туберкулезе кишечника, диссеминированных процессах с вовлечением органов кроветворения (селезенка, костный мозг), при некоторых осложнениях, как, например, амилоидозе внутренних органов . Ретикулоциты – молодые, не вполне созревшие эритроциты. У большинства больных туберкулезом их количество находятся в пределах нормы. При обычной окраске мазка в цитоплазме нейтрофилов может выявляться в виде крупных зерен токсическая (токсогенная) зернистость. Увеличение количества тромбоцитов наряду с повышением уровня серотонина в крови наблюдается у больных с хроническими распространенными формами туберкулеза легких в период обострения. Выраженное нарастание количества тромбоцитов отмечается у больных туберкулезом при осложнениях нагноительными процессами различной локализации и этиологии, а также амилоидозом. 3.ИЗМЕНЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ Среди различных биохимических систем организма системе белков принадлежит, несомненно, первостепенная роль.Поэтому анализ изменений организма при туберкулезе мы начнем с нее. 1. Уменьшение содержания альбумина и возрастание уровня альфа-1 и альфа-2 глобулинов – такая диспротеинемия обусловливается усилием биосинтеза белков острой фазы (альфа-1 и альфа-2 глобулинов, составляющих группу гликопротеинов) и подавлением, вследствие интоксикации, компенсаторной продукции альбумина гепатоцитами. Наблюдается чаще всего при остром воспалительном процессе, сепсисе, начальной стадии пневмонии, туберкулезе легких с преобладанием процессов инфиильтрации и экссудации. 2. Умеренное снижение выраженности фракций альбумина и значительное увеличение уровня α2 (нередко α1) и -глобулина. Последняя фракция белков усиленно синтезируется клеточными элементами системы фагоцитирующих мононуклеаров. Содержание бета-глобулинов и общего белка не изменяется. Характерно уменьшение показателя А/(α2+-глобулины) ниже 2,2. Наблюдается при синдроме хронического воспаления (холецистит, цистит, пиелит, поздняя стадия пневмоний, хронические формы туберкулеза легких). 3. Значительное уменьшение содержания альбумина, повышение концентрации α2 и β-глобулинов (за счет α2-микроглобулинемии или увеличения уровня липопротеинов очень низкой плотности – ЛПОНП) при умеренном снижении уровня -глобулинов (иммуноглобулинов G и А). Этот тип изменений свойственен нефротическому симптомокомплексу, терминальной стадии туберкулеза легких. Альбумино/глобулиновое соотношение (А/Г коэффициент составляющий в норме 1,2-1,8) снижается: - при хронических диффузных поражениях печени - пневмонии - плевриты - туберкулез - воспалительные процессы различной локализации - злокачественные новообразования - амилоидоз Коэффициент А/(суммарная фракция α1 и α2 глобулинов) составляет в норме 3,9-6,1, является весьма информативным и адекватным тестом оценки активности воспалительного процесса. При умеренных, выраженных и резких изменениях воспалительного характера в бронхолегочной системе величина этого соотношения уменьшается соответственно до значений: 3,8-2,8; 2,7-2,0; ниже 2,0.8 Важно определение С-реактивного белка в случае скрыто протекающего активного воспалительного процесса, не сопровождающегося характерными клиническими и другими проявлениями. Во многих случаях,появление положительной пробы на С-реактивный белок служит первым сигналом вспышки туберкулезного процесса или экзацербации старых очагов, когда обычными лабораторными методами исследования еще не улавливаются патологические изменения. Результаты определения С-реактивного белка зависят от длительности и эффективности проводимой противотуберкулезной терапии. Положительная проба на С- реактивный белок ослабевает, а затем становится отрицательной, если пациент получает длительное и достаточно эффективное лечение. Но у пациентов, которым лечение не назначалось или оно было малоэффективным, реакция на С- реактивный белок нередко положительная в течение нескольких лет. Кроме того, стойкая положительная проба на С-реактивный белок у пациента, несмотря на длительное противотуберкулезное лечение, может свидетельствовать о вторичном заболева6нии, которое маскируется туберкулезом легких. Активность изоферментов ЛДГ (лактатдегидрогеназы) в легочной ткани человека может увеличиваться при пневмониях и других заболеваниях. Значительное увеличение активности щелочной фосфатазы наблюдается при заболеваниях костной ткани (сопровождающихся ростом костной ткани): - метастазы в костную ткань - туберкулез костей и суставов 4.ИССЛЕДОВАНИЕ МОКРОТЫ Исследование мокроты помогает установить характер патологического процесса в органах дыхания, а в ряде случаев определить его этиологию. Мокрота – патологическое отделяемое органов дыхания. Мокрота: - это выделения из дыхательных путей , которые образуются при воспалительных процессах в дыхательной системе, и выделяются при достаточном кашлевом толчке - всегда патологический материал - всегда заразный материал.Мокроту для исследования лучше брать утреннюю, свежую, по возможности до еды и после туалета полости рта (чистка зубов и полоскание кипяченой водой). Собирают в чистую, с пробками посуду, доставляют в лабораторию и исследуют в тот же день. Макроскопическое исследование оценивают: - цвет - количество - запах - консистенцию - характер - форма (по Базарновой) - реакцию (рН как правило щелочная, кислой становится при разложении и от примесей желудочного сока, что помогает дифференцировать кровохарканье от кровотечения из ЖКТ). Цвет – преобладание одного из компонентов мокроты придает ей соответствующий оттенок, зависит от характера мокроты и ее примесей, от вдыхаемых частиц, окрашивающих мокроту. Сероватый, желтоватый, зеленоватый цвет мокроты зависит от содержания и количества гноя (элементы «белой» крови – нейтрофилы, лимфоциты). Ржавый, красный, коричневый цвет – от примеси крови и продуктов ее распада. Серый и черный цвет придают мокроте уголь и пыль, белый – мучная пыль. Вдыхаемая пыль, содержащая красители, может окрашивать мокроту в другие цвета. Количество – зависит от характера патологического процесса. Большое количество указывает на наличие у пациента полостных образований (абсцесс, бронхоэктазы, туберкулез с деструкцией легочной ткани, гангрена, крупозная пневмония). Запах (специфический) – появляется при распаде ткани (онко, гангрена, бронхоэктазы. Характер мокроты – мокрота как правило неоднородна. Содержание в мокроте слизи, гноя, крови, серозной жидкости, фибрина определяет ее характер. Он может быть: - слизистый - слизисто-гнойный - слизисто-гнойно-кровянистый - серозный - серозно-гнойный11 - кровянисто-слизистый и др. доминирующий фактор ставится на последнее место Консистенция – зависит от состава мокроты - жидкая – от наличия серозной жидкости - полужидкая – от присутствия серозной жидкости в слизисто-гнойной мокроте - клейкая – при большом содержании фибрина - вязкая – при наличии слизи, муцина. Особое внимание необходимо обратить на наличие патологических примесей. Исследование гнойных комочков мокроты особенно информативно для выявления микобактерий туберкулеза. В гнойной мокроте при неспецифических процессах могут определяться плотные, гнойные образования – пробки Дитриха. При кавернозном туберкулезе легких могут обнаруживаться плотные беловатые образования - линзы Коха – рисовидные зерна, состоящие из микобактерий туберкулеза и казеозных масс. Могут обнаруживаться мелкие желтоватые зернышки (манная крупа) – актиномицеты (друзы) – при актиномикозе. При туберкулезе могут определяться белесоватые дорожки – тетрада Эрлиха (распад петрификатов, очагов Гона) состоящая из: 1. микобактерий туберкулеза 2. извести 3. холестерина 4. эластических волокон.При исследовании патологических примесей можем обнаружить пленки (при разрыве эхинококкового пузыря). Включения, патологические элементы, паразиты в мокроте обнаруживают при рассмотрении ее в чашке Петри на белом фоне или черном фоне, при этом полезно пользоваться лупой. Исследование мокроты на наличие микобактерий туберкулеза Прямая бактериоскопия Люминесцентная бактериоскопия Культуральный метод – посев на среды. Биологический метод – заражение лабораторных животных. ИФА ПЦР Биочипы 5.Прямая бактериоскопия Бактериоскопический метод диагностики туберкулеза – исследование мазка после обработки и окраски по методу Циля-Нильсена. Микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет. Преимущество этого метода заключается в быстроте получения результата, однако возможности его ограничены, в частности, известно, что положительный результат – обнаружение МБТ в мазке –15 может быть получен только при значительном содержании микробных тел в мокроте: от 50 тыс. микробных клеток в 1 мл Бактериоскопическому исследованию подвергается самый разнообразный материал: мокрота, промывные воды бронхов, желудка, экссудат, отделяемое ран, свищей, моча, ликвор, менструальная кровь и др. Наиболее часто исследуется мокрота. Бактериоскопический метод диагностики туберкулеза легких – простой и экономичный, быстрый, выполнимый в любом медицинском учреждении, позволяющий при положительном результате мазка мокроты подтвердить диагноз туберкулеза. Недостатком метода можно считать его низкую чувствительность. Для повышения чувствительности метода используют методики обогащения материала (флотация, седиментация) и окраску люминисцентными красителями. Препарат готовят из гнойных частиц мокроты, которые выбирают из нескольких мест. Отобранные частицы тщательно растирают между двумя предметными стеклами до гомогенной массы. Высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем. Мазки из жидкого содержимого (БАС, промывные воды, моча, экссудаты и т.д.) готовят из осадка материала, обработанного кислотой, после центрифугирования. При этом избегают следующих ошибок: - Изготовление слишком толстых препаратов (трудно искать МБТ) - Фиксирование плохо высушенных мазков (получается плохая окраска) - Недостаточная фиксация (наблюдается сползание препарата) - Длительная фиксация над пламенем (обугливание мокроты, что сильно отражается на качестве мазка) Препарат после окраски микроскопируют с иммерсионной системой при 1000- кратном увеличении. Методика окраски:После фиксации мазка в пламени горелки, он обрабатывается карболовым раствором фуксина. Под действием входящего в его состав фенола (карболовая кислота) облегчается проникновение в дальнейшем анилинового красителя в микробную клетку, стенка которой «защищена» от проникновения обычных красителей слоем липидов и миколовых кислот. Затем обесцвечивают некислотоустойчивые микроорганизмы 5% раствором серной кислоты или 3% солянокислым спиртом. Микобактерии стойко удерживают краситель и остаются окрашенными в красный цвет. Обесцвеченные структуры докрашивают мителеновым синим. Микобактерии обнаруживаются в препарате в виде тонких, прямых или слегка изогнутых палочек, красного или малинового цвета на синем фоне. Иногда они располагаются в препарате в виде римской цифры V, часто скоплениями. Иногда в их структуре определяются более интенсивные зерна (зернистые формы). В связи с приемом противотуберкулезных препаратов, изменяющих морфологию микобактерий, могут обнаруживаться их ветвистые формы, бледноокрашенные палочки (частично утратившие кислотоустойчивость), осколки. Исследования бактериоскопическим методом может выполняться в следующих учреждениях: - НИИ медицинского профиля - Областная, городская и районная больница - Взрослая и детская поликлиника - Участковая больница - Сельская врачебная амбулатория - Психиатрическая и наркологическая больница и диспансер - Санаторий - ИТ учреждения Люминесцентная бактериоскопия Основана на различии свечения микроскопируемого объекта в ультрафиолетовом или коротковолновом спектре света. Окраска производится флюорохромами – органическими красителями (аурамин, родамин). МБТ под действием УФ-лучей в темном поле люминисцентного микроскопа светятся в виде золотистого цвета палочек. Высокая контрастность микроскопической картины позволяет проводить исследование под меньшим увеличением (400-крат), увеличивая площадь одномоментно просматриваемого поля зрения, сокращая время, затрачиваемое на поиск единичных микобактерий, просмотр всего мазка. Этот метод особенно подходит для исследования олигобациллярного материала. Информативность бактериоскопии с применением флюорохромов по данным различных авторов может повышаться на 15 – 30%. Данный метод не применим для бактериоскопии мочи, в связи с наличием в ней большого количества микобактерий – сапрофитов. Метод флотации. Метод основан на том, что после встряхивания водной суспензии легких углеводородов (ксилол, толуол, бензин и т.д.) и МБТ, а затем ее отстаивании, последние, адсорбируясь на поверхности пузырьков углеводорода, всплывают. Образовавшееся на поверхности раствора флотационное кольцо содержит МБТ в большем количестве, чем остальная часть раствора и служит материалом для приготовления мазка. Информативность бактериоскопии с применением флотационного метода может повышаться на 10%. Методика (метод Поттенджера): - свежевыделенную мокроту (не более 10-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку18 - приливают двойное количество 0,5% раствора едкой щелочи, смесь энергично встряхивают 10-15 мин. - приливают 1 мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 10 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты, снова встряхивают 10-15 мин. - доливают дистиллированную воду в таком количестве, чтобы уровень жидкости поднялся до горлышка бутылки. - оставляют стоять на 40-50 мин - образовавшийся верхний беловатый слой снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно подогретые до 60 градусов (стекла для подогревания можно положить на металлический поднос и покрыть им водяную баню). Каждую последующую каплю наносят на предыдущую, подсушенную. - препарат фиксируют, красят по Цилю-Нельсену и микроскопируют. Метод седиментации Основан на осаждении МБТ из раствора при добавлении хлороформа и центрифугировании. Из полученного осадка готовят мазок, окрашивают по Цилю- Нельсену и микроскопируют. Бактериологический метод Бактериологический (культуральный) метод имеет ряд преимуществ перед микроскопическим и другими методами. Основное преимущество состоит в возможности обнаружения скудного количества жизнеспособных МБТ в клиническом материале: положительные результаты получают при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако ему свойственны и недостатки, обусловленные длительностью сроков появления видимых колоний микобактерий туберкулеза. В тоже время возможность получения чистой культуры возбудителя, которая может быть подробно исследована, позволяет решать вопросы изучения ее лекарственной чувствительности, вирулентности и других биологических свойств (типовой принадлежности) . Для нормального развития МБТ требуются специальные питательные среды, содержащие углерод, азот, водород, кислород, фосфор, магний, калий, а также железо, хлор, натрий, серу. Кроме того, для полноценного развития МБТ, как и других микроорганизмов, необходимо наличие факторов роста, которые в минимальных количествах улучшает рост бактерий на средах. Факторы роста не входят в состав ферментных систем клетки, но используются для их построения. Известны факторы роста, родственные по своей природе витаминам группы В, ряд аминокислот, органических кислот и липидов. Все эти факторы содержаться в разных количествах в питательных средах – яичных, кровяных, картофельных. Следует отметить, что потребности микробов в ростовых веществах весьма вариабельны и существенно зависят от условий культивирования. Имеющиеся в 19 литературе сведения по этому вопросу немногочисленны и зачастую противоречивы. В популяции МБТ обычно встречаются быстро и медленно растущие, персистирующие и лекарственно-устойчивые штаммы микобактерий. В зависимости от преобладания тех или иных штаммов МБТ с разными свойствами, меняется скорость и характер их роста на питательных средах, а при снижении жизнеспособности МБТ их рост на среде может не только замедлиться, но даже и не появиться. Первичные культуры микобактерий, выделенные из патологического материала, особенно чувствительны к отсутствию факторов роста. По-видимому, при вегетировании в тканях организма они теряют способность самостоятельно синтезировать такие вещества. Следовательно, для таких культур необходимы полноценные питательные среды,По составу среды можно разделить на 3 группы: 1. среды, содержащие глицерин; 2. белковые среды (сывороточные, яичные); 3. синтетические (безбелковые) среды. 4. смешанные среды, которые являются более полноценными. По консистенции среды делят на твёрдые, полужидкие и жидкие. Для культивирования и дифференциации микобактерий туберкулёза используется большое количество разнообразных по составу и консистенции питательных сред. Питательные среды, используемые для получения культур микобактерий можно разделить на три группы Диагноз туберкулеза у пациента подтверждается на основании лабораторного исследования при обнаружении в диагностическом МБТ при параллельных микроскопических и культуральных исследованиях. Именно поэтому исследования в микробиологических лабораториях противотуберкулезной службы, помимо микроскопии мазков из клинического материала, должны обязательно включать культуральные исследования, направленные на идентификацию кислотоустойчивых микобактерий и определение их принадлежности к виду M. tuberculosis или к другим видам нетуберкулезных микобактерий, а также определение чувствительности микобактерий к лекарственным препаратам. Бактериологический метод является более чувствительным и достоверным, он позволяет выявить МБТ, если их содержится около 100 в 1 мл. материала. Важным преимуществом этого метода является возможность выделения возбудителя и изучение его видовой принадлежности, вирулентности, лекарственной чувствительности. Его недостатками можно считать: 1. сложность – выполним только в специализированной бактериологической лаборатории. 2. высокую стоимость исследования. 3. длительность исследования может составить 20-90 дней, в зависимости от типа роста микобактерии. МБТ – очень требовательные гетеротрофы, нуждающиеся в глутаминовой и особенно аспарагиновой кислоте и глицерине (источнике углеводов) Стимулятором роста является лецитин, содержащийся в больших количествах в яичном желтке. 6.Люминесцентная бактериоскопия Основана на различии свечения микроскопируемого объекта в ультрафиолетовом или коротковолновом спектре света. Окраска производится флюорохромами – органическими красителями (аурамин, родамин). МБТ под действием УФ-лучей в темном поле люминисцентного микроскопа светятся в виде золотистого цвета палочек. Высокая контрастность микроскопической картины позволяет проводить исследование под меньшим увеличением (400-крат), увеличивая площадь одномоментно просматриваемого поля зрения, сокращая время, затрачиваемое на поиск единичных микобактерий, просмотр всего мазка. Этот метод особенно подходит для исследования олигобациллярного материала. Информативность бактериоскопии с применением флюорохромов по данным различных авторов может повышаться на 15 – 30%. Данный метод не применим для бактериоскопии мочи, в связи с наличием в ней большого количества микобактерий – сапрофитов. 7.Метод флотации. Метод основан на том, что после встряхивания водной суспензии легких углеводородов (ксилол, толуол, бензин и т.д.) и МБТ, а затем ее отстаивании, последние, адсорбируясь на поверхности пузырьков углеводорода, всплывают. Образовавшееся на поверхности раствора флотационное кольцо содержит МБТ в большем количестве, чем остальная часть раствора и служит материалом для приготовления мазка. Информативность бактериоскопии с применением флотационного метода может повышаться на 10%. Методика (метод Поттенджера): - свежевыделенную мокроту (не более 10-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку18 - приливают двойное количество 0,5% раствора едкой щелочи, смесь энергично встряхивают 10-15 мин. - приливают 1 мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 10 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты, снова встряхивают 10-15 мин. - доливают дистиллированную воду в таком количестве, чтобы уровень жидкости поднялся до горлышка бутылки. - оставляют стоять на 40-50 мин - образовавшийся верхний беловатый слой снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно подогретые до 60 градусов (стекла для подогревания можно положить на металлический поднос и покрыть им водяную баню). Каждую последующую каплю наносят на предыдущую, подсушенную. - препарат фиксируют, красят по Цилю-Нельсену и микроскопируют. Метод седиментации Основан на осаждении МБТ из раствора при добавлении хлороформа и центрифугировании. Из полученного осадка готовят мазок, окрашивают по Цилю- Нельсену и микроскопируют. 8.Иммуноферментный анализ. ИФА получил широкое распространение в диагностике различных инфекционных заболеваний в связи с высокой чувствительностью и специфичностью анализа, высокой производительностью, простотой проведения анализа и регистрации результатов, возможностью использования микроколичества диагностического материала и автоматизации процесса. ИФА используют для определения, как антител, так и антигенов в биологических жидкостях. В 1976 году ИФА был впервые применен для серодиагностики туберкулеза, использовав в качестве антигена фильтрат M. tuberculosis H37RV. При использовании ИФА специфические антитела выявляются у 80% больных активным туберкулезом, в том числе и костно-суставным. Однако образование антител меняется в зависимости от активности туберкулезного процесса, распространенности и давности заболевания, а также в процессе лечения. Несмотря на значительное число публикаций, посвященных применению методов ИФА для серодиагностики туберкулеза, проблема диагностики не является решенной, поскольку чувствительность анализа колеблется от 68 до 92%, а специфичность - от 86 до 97%, то есть число ложноположительных реакций среди здоровых или лиц с нетуберкулезными заболеваниями колеблется от 3 до 14%. Недостаточная специфичность анализа связана с наличием общих антигенов между МБТ и другими непатогенными микобактериями. 9.ПЦР-диагностика В настоящее время все большее внимание уделяется лабораторному методу исследования, основанному на использовании полимеразной цепной реакции. Благодаря применению ПЦР-технологии удается выявить и воспроизвести миллионы копий того участка ДНК, который принадлежит болезнетворному агенту, например, внедрившемуся в организм человека возбудителю туберкулеза, т.е. осуществить анализ на генетическом уровне. Если «ключевая последовательность» ДНК микобактерии известна, то способом искусственного синтеза можно получить органическое вещество (праймер) с комплиментарной последовательностью азотистых оснований, обеспечивающих способность прикрепляться к одной из нитей ДНК миеобактерии в строго определенном месте. Такой «праймер» – копия небольшого (соответствующего 20-30 азотистым основаниям) участка ДНК – является своеобразным «стартовым блоком» , с которого под влиянием ДНК-полимеразы происходит удлинение цепи, комплиментарной азотистым основаниям нити материнской ДНК. Для удлинения цепи используются азотистые основания (мононуклеотиды) и другие компоненты, вводимые в реакционную смесь. Если свойственная праймеру последовательность азотистых оснований характерна только для микобактерий, находящихся в организме человека, то, несмотря на огромное количество присущего человеку генетического материала и малое количество ДНК микобактерий («иголка в стоге сена»), будет создан отрезок комплиментарной цепи, характерный только для болезнетворного агента. Для обнаружения, например, палочки Коха достаточно, чтобы в пробе содержался участок ДНК возбудителя с двумястами парами оснований. Происходит как бы отыскивание иголки в стоге сена («иголка»-это участок ДНК микобактерии, а «стог сена» - сотни миллиардов азотистых оснований нити ДНК клетки). Новообразовавшаяся цепь наполовину состоит из нативной (оригинальной) нити ДНК и наполовину – из новообразованной, комплиментарной (обе нити составляют половинки «лестницы» ДНК). Исключительное значение метод ПЦР играет в подтверждении туберкулезной этиологии при плевритах, менингитах, туберкулезе мочеполовой системы, туберкулезе лимфоузлов, поскольку результативность бактериологической диагностики в выше указанных случаях крайне низкая. Если «ключевая последовательность» ДНК микобактерии известна, то способом искусственного синтеза можно получить органическое вещество (праймер) с комплиментарной последовательностью азотистых оснований, обеспечивающих способность прикрепляться к одной из нитей ДНК в строго определенном месте.Такой «праймер» – копия небольшого (соответствующего 20-30 азотистым основаниям) участка ДНК – является своеобразным «стартовым блоком», с которого под влиянием ДНК-полимеразы происходит удлинение цепи, комплиментарной азотистым основаниям нити материнской ДНК . Если свойственная праймеру последовательность азотистых оснований характерна только для микобактерий, находящихся в организме человека, то, несмотря на огромное количество присущего человеку генетического материала и малое количество ДНК микобактерий («иголка в стоге сена»), будет создан отрезок комплиментарной цепи, характерный только для болезнетворного агента. Исключительное значение метод ПЦР играет в подтверждении туберкулезной этиологии при плевритах, менингитах, туберкулезе мочеполовой системы, туберкулезе лимфоузлов, поскольку результативность бактериологической диагностики в выше указанных случаях крайне низкая. Большую проблему в ПЦР-диагностике составляют ложноположительные реакции, связанные с контаминацией материала во время забора, доставки в лабораторию и непосредственно во время выполнения исследования. МБТ – повсеместно распространенный патоген, в норме присутствующий в определенных количествах в организме большинства людей после первичного инфицирования. Во вдыхаемом нами воздухе присутствуют как живые МБТ, так и огромное количество их фрагментов и обломков молекул ДНК. В подобных условиях риск контаминации забираемого материала резко возрастает, а количество ложноположительных реакций по данным некоторых авторов может составлять от 1 до 50%. Единственной возможностью исключения появления ложноположительных реакций при выполнении молекулярно-биологических исследований является стандартизация преаналитического (использование одноразовой лабораторной посуды, РНК и ДНК освобожденной, соблюдение правил асептики и антисептики при взятии биологического материала) и аналитического (соблюдение технологии выполнения молекулярно- биологического исследования) этапа лабораторного исследования. 10.Бактериологический метод Бактериологический (культуральный) метод имеет ряд преимуществ перед микроскопическим и другими методами. Основное преимущество состоит в возможности обнаружения скудного количества жизнеспособных МБТ в клиническом материале: положительные результаты получают при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако ему свойственны и недостатки, обусловленные длительностью сроков появления видимых колоний микобактерий туберкулеза. В тоже время возможность получения чистой культуры возбудителя, которая может быть подробно исследована, позволяет решать вопросы изучения ее лекарственной чувствительности, вирулентности и других биологических свойств (типовой принадлежности). Для нормального развития МБТ требуются специальные питательные среды, содержащие углерод, азот, водород, кислород, фосфор, магний, калий, а также железо, хлор, натрий, серу. Кроме того, для полноценного развития МБТ, как и других микроорганизмов, необходимо наличие факторов роста, которые в минимальных количествах улучшает рост бактерий на средах. Факторы роста не входят в состав ферментных систем клетки, но используются для их построения. Известны факторы роста, родственные по своей природе витаминам группы В, ряд аминокислот, органических кислот и липидов. Все эти факторы содержаться в разных количествах в питательных средах – яичных, кровяных, картофельных. Следует отметить, что потребности микробов в ростовых веществах весьма вариабельны и существенно зависят от условий культивирования. В популяции МБТ обычно встречаются быстро и медленно растущие, персистирующие и лекарственно-устойчивые штаммы микобактерий. В зависимости от преобладания тех или иных штаммов МБТ с разными свойствами, меняется скорость и характер их роста на питательных средах, а при снижении жизнеспособности МБТ их рост на среде может не только замедлиться, но даже и не появиться. Первичные культуры микобактерий, выделенные из патологического материала, особенно чувствительны к отсутствию факторов роста. По-видимому, при вегетировании в тканях организма они теряют способность самостоятельно синтезировать такие вещества. Следовательно, для таких культур необходимы полноценные питательные среды. По составу среды можно разделить на 3 группы: 1. среды, содержащие глицерин; 2. белковые среды (сывороточные, яичные); 3. синтетические (безбелковые) среды. 4. смешанные среды, которые являются более полноценными. По консистенции среды делят на твёрдые, полужидкие и жидкие. Для культивирования и дифференциации микобактерий туберкулёза используется большое количество разнообразных по составу и консистенции питательных сред. Бактериологический метод является более чувствительным и достоверным, он позволяет выявить МБТ, если их содержится около 100 в 1 мл. материала. Важным преимуществом этого метода является возможность выделения возбудителя и изучение его видовой принадлежности, вирулентности, лекарственной чувствительности 11.Бронхоальвеолярный лаваж В настоящее время БАЛ чаще проводится с использованием фибробронхоскопа, чаще на уровне сегментарных или субсегментарных бронхов. Через канал бронхоскопа вводят порционно 100-150 мл. теплого стерильного физиологического раствора (37˚С). Через несколько минут аспирируют содержимое бронхов в отдельную стерильную емкость (БАС). Аспирируется обычно 40-60% от введенного количества. Подсчет общего количества клеточных элементов проводят в камере Фукса – Розенталя. После центрифугирования, приготовления мазков из осадка и окраски по Райту- Романовскому, Романовскому-Гимзе, посчитывают клеточный состав: альвеолярные макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы и эозинофилы. Общее 35 количество клеток в БАС варьирует в пределах 0,055-0,083 х 106 /мл. Жизнеспособность альвеолярных макрофагов составляет в норме 63,6+-5,6%. Цитограмма БАС у здоровых лиц в среднем представлена: альвеолярные макрофаги – 85-98%, лимфоциты – 7-12%, нейтрофилы – 1%. По Voisin (1975) у некурящих здоровых лиц в БАС содержится в среднем: альвеолярных макрофагов – 93±5%, лимфоцитов – 7±1%, нейтрофилов, эозинофилов – менее1%. Изменения при туберкулезе легких. При активном туберкулезе легких в БАС может наблюдаться 4 типа клеточных реакций. 1 тип: макрофагальная реакция (МР)– при наличии: - альвеолярных макрофагов >86% - лимфоцитов 12% 3 тип: нейтрофильная реакция (НР) – при наличии: - лимфоцитов 2% 4 тип: смешанная лимфоцитарно-нейтрофильная реакция (ЛНР) – при наличии: - лимфоцитов >12% - нейтрофилов >2% Каждая клиническая форма туберкулеза легких имеет различный клеточный состав БАС, что связано с особенностями течения туберкулеза и наличием сопутствующих патологических процессов. Клеточные реакции БАС можно использовать для прогнозирования течения туберкулезного процесса. Развитие и нарастание деструктивных процессов в легких оказывает достоверное влияние на клеточные реакции БАС за счет увеличения частоты НР и ЛНР. При бактериовыделении увеличивается частота НР и ЛНР. Количество нейтрофилов в БАС при наличии у больного бактериовыделения составляет 21,8+-36 9,9%, при отсутствии - 9,1+-7,1%. Количество лимфоцитов не зависит от бактериовыделения. В то же время цитологические исследования БАС при ограниченных поражениях легких не позволяют установить туберкулезную природу заболевания. У 10% больных даже при развитом туберкулезном процессе цитограмма БАС остается без изменения. Помогает в дифференциальной диагностике туберкулеза легких одновременное проведение пробы Коха, которая повышает диагностическую информативность цитологических исследований. При повторном цитологическом исследовании лаважной жидкости через 48-72 часа после пробы Коха при туберкулезе у 62,5% больных среднее содержание АМ имеет тенденцию к повышению, а нейтрофилов – к снижению, увеличивается число плазматических и эпителиальных клеток. При пневмонии и раке среднее содержание АМ снижается, а нейтрофилорв повышается, содержание лимфоцитов и эозинофилов практически не изменяется. Различия в содержании АМ, нейтрофилов становятся более выраженными. У больных с длительно протекающей пневмонией (абсцедирующей) и бронхоальвеолярным раком возможны ложноположительные реакции. Использованная литература: 1. Цитоморфологические методы диагностики болезней органов дыхания / Л.Суркова, М. Дюсьмикеева, А. Василевский и др. // Метод. рекомендации. - Минск, НИИПиФ РБ. - 2001. 2. Туберкулез / Под ред. Хоменко А. Г. // Руководство для врачей М.: Медицина, 2002. – 496 с. 3. Ященко Т. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. - М., «Медицина». – 1993. 4. Колб В. Г. Биохимические аспекты организма при туберкулезе. - 1991. 5. Рудой И. М. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза.- М.: Медицина, 1989. 6. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. проф. Е. А. Коста. – М.: Медицина, 1985. 7. Шебанов Ф. В. Туберкулез. – М.: Медицина, 2009. 8. Любина А., Ильичева Л. Клинические лабораторные исследования. – М.: Медицина, 2001. 9. Камышников В. Справочник по клинико-биохимическим методам исследования. –2000. 10. Лаптева И. М., Королева Е. Г. Применение метода индуцированной мокроты в диагностике пневмоний / Инструкция по применению. - Минск, - 2004. 11. Мордовской Г. Г. Приготовление и использование новой питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза / Метод. рекомендации. - М., 1992. - С. 9. 12. Ященко Т. Н., Мечева И. С. Питательные среды / Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. - М.: Медицина. – 2000. С.149- 157. |