08_ Структура биологических мембран. 8. Структура биологических мембран
 Скачать 1.11 Mb.
|
|
8.9.3. Использование спиновых зондов Спиновыми зондами называют стабильные радикалы (в которых неспаренный электрон принадлежит практически во всех случаях группе иминоксила >N·=O), которые встраиваются в биомолекулы или в липидный слой мембран без образования ковалентных связей и в этом отношении отличаются от спиновых меток. Примером спинового зонда может служить молекула 5-доксилстеарата, химическая формула и спектр ЭПР которой показаны на рис. 3.11. В сущности, этот зонд является спин-меченной молекулой стеариновой кислоты. Метод ЭПР оказался весьма ценным для изучения свойств липидного слоя мембран. Применение спиновых зондов основано на зависимости спектров ЭПР этих соединений от условий микроокружения в мембране: вязкости, полярности среды и других. Поскольку при фазовом переходе происходит изменение этих свойств (например, микровязкость возрастает при плавлении твердого бислоя), зонды могут применяться также и для изучения кривых плавления. Принцип обработки данных тот же, что и в случае использования других методов. 36 В качестве характеристики свойств микроокружения используют либо интегральную характеристику вращательной подвижности зонда, так называемое временя корреляции (обозначаемое обычно как τ), либо характеристику асимметрии вращательного движения, параметр упорядоченности (обозначаемый как S). Величина τ близка к среднему времени поворота молекулы зонда вокруг любой из осей на угол один радиан. Для исследований микровязкости в мембранах часто используют небольшую и компактную молекулу соединения, получившего аббревиатуру TEMPO (2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил), формула и ЭПР спектр которого приведены на рис. 3.9. Положение спектра нитроксидного радикала (g-фактор) и сверхтонкое расщепление зависят от ориентации молекулы относительно внешнего поля. При быстром вращении эти различия не проявляются и спектр характеризуется узкими линиями сверхтонкого расщепления. В вязкой среде молекулы вращаются медленно и сигнал ЭПР представляет собой суперпозицию сигналов отдельных молекул, как бы застывших в разных положениях. Поэтому измеряемый сигнал характеризуется сглаженными и раздвинутыми максимумами сверхтонкой структуры. На рис. 3.10 приведены спектры для самых разных случаев – от свободного вращения ТЕМПО до полной неподвижности, что соответствует очень жидкому и очень вязкому окружению. Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым, что приводит к усреднению анизотропии спектра ЭПР (верхний спектр). При уменьшении скорости вращения проявляются анизотропные взаимодействия, которые приводят к уширению линий и соответственно изменению амплитуд компонент спектра, а затем и к сдвигу крайних компонент. Немаловажно, что этот метод очень чувствителен, обычно спектр регистрируется при концентрации спиновых меток около 10 –6 М в 50 мкл образца. В случае таких вытянутых молекул, как 5-доксилстеарат характеристика времени корреляции ( τ) не подходит, т.к. поворот зонда вокруг разных осей происходит за совершенно разное время, тем более в такой асимметричной среде как липидный бислой. В этом случае правильнее использовать параметр упорядоченности S. Дело в том, что если спиновый зонд присоединен где-то к середине жирнокислотной цепи в молекуле жирной кислоты, встроенной в мембрану, его вращение будет происходить преимущественно вокруг длинной оси молекулы жирной кислоты, т.е. появится анизотропия вращения. Это отразится на спектре ЭПР. Параметр упорядоченности S равен 1, если вращение зонда происходит только вокруг нормали к мембране. При разжижении мембраны конус вращения будет расширяться, и значение параметра S будет приближаться к нулю. Таким образом, параметр упорядоченности растет с увеличением вязкости и 37 структурированности мембраны, в том числе при фазовом переходе липидного бислоя из жидкого состояния в твердое. Интересным следствием использования спиновых зондов, содержащих жирную кислоту, является возможность измерения параметра упорядоченности на разных расстояниях от поверхности мембраны, так называемый профиль упорядоченности или профиль вязкости. Подобные измерения представляются возможными при использовании набора однородных спиновых зондов, которые содержат нитроксильный фрагмент на разном расстоянии от карбоксильной группы. Например, используются спиновые зонды с нитроксильным радикалом у 5, 7, 12 и 16 атома углерода стеариновой кислоты. Набор этих соединений позволяет измерять S параметр на расстоянии 3,5, 5, 8,5 и 10,5 Ǻ от поверхности мембраны (см. рис. 3.12). 8.9.4. Светорассеяние Метод светорассеяния дает немного для понимания физических свойств липидного бислоя, но вполне достаточен, чтобы проследить за фазовыми переходами в суспензии липосом при изменении температуры или при иных воздействиях. Чтобы понять принцип применения метода, обратимся к рис. 8.28. Рассеяние света везикулой связано с тем, что показатели преломления липидного слоя и окружающей водной среды различаются, а сам липидный слой имеет кривизну. Наибольшее отклонение от первоначального направления имеют лучи, попавшие на край везикулы (рис. 8. 28, А, нижняя стрелка). Другие лучи отклоняются тем меньше, чем ближе они к центру сферы. В совокупности происходит рассеяние падающего света. Рассеяние это тем выше, чем больше различие в показателях преломления стенок сфер, т.е. липидных слоев мембран и водного раствора. Твердые мембраны плотнее и имеют более высокий показатель преломления, чем жидкие. Поэтому рассеяние света сильнее везикулами, липиды которых находятся в твердом состоянии. Измеряя светорассеяние (или светопропускание) суспензии при разных температурах, можно построить кривые плавления, используя тот же общий подход, как и в других случаях. А Б Рис. 8.31. Рассеяние света везикулой. А – твердое состояние липидной мембраны (высокий показатель преломления), Б – жидкое состояние липидной мембраны (низкий показатель преломления). 38 8.10. Кооперативность фазовых переходов 8.10.1. Фазовое равновесие В области температур фазового перехода при достаточно медленном плавлении устанавливается равновесие: Твёрдое состояние ↔ Жидкое состояние Можно считать, что вся мембрана состоит из участков жидких липидов и участков твёрдых липидов. Тогда обратимый процесс фазового перехода можно рассматривать как процесс превращения таких участков (доменов) друг в друга со скоростями, пропорциональными концентрации доменов, иначе говоря, фазовое равновесие можно рассматривать как обратимую химическую реакцию: s ↔ l Константа равновесия этой реакции равна [ ] [ ] l s m l K s m = = (0.16) где [l] и [s] – концентрации липидов в жидкой и твёрдой фазах, m l и m s – количество липида в жидкой и твёрдой фазах, соответственно. Изменение свободной энергии ∆G при плавлении моля липида равно изменению энтальпии ∆H минус изменение тепловой энергии T ∆S: G H T S ∆ = ∆ − ∆ . (0.17) Учитывая, что ln ln ∆ = − = − s l m G RT K RT m , (0.18) находим 1 ln ∆ ∆ − = ⋅ − H S K R T R , (0.19) при том, что = = − l s m q K m Q q (0.20) 39 Таким образом, зависимость –lnK от 1/T представляет собой прямую линию с угловым коэффициентом H R ∆ и отрезком, отсекаемым на оси ординат, равной S R ∆ . Примеры такого рода прямых даны на рис. 8.29. Объяснение величины nна этом рисунке будет дано ниже. 100 lnK -100 -200 0 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 1000/T n=100 n=30 n=3 n=10 Рис. 8.29. Зависимость lnK от обратной абсолютной температуры; отрезок, отсекаемый на оси ординат позволяет найти энтропию плавления, угловой коэффициент — энтальпию плавления ; n — размеры кооперативной единицы плавления. Из кривых плавления, полученных экспериментально, можно найти термодинамические характеристики процесса H ∆ и S ∆ . Для этого: 1. Находим отношение s l m K m = при разных температурах T, °C. 2. Строим зависимость lnK от обратной абсолютной температуры (1/(T°C+273)). 3. Рассчитываем H ∆ , исходя из того, что тангенс угла наклона прямой равен H R ∆ ;. 4. Рассчитываем S ∆ , зная, что отрезок, отсекаемый по оси ординат, равен S R ∆ 8.10.2. Понятие кооперативной единицы Из кривых теплоёмкости можно найти теплоту плавления образца Q (см. рис. 8.24) и молярную теплоту плавления Q m = Q/m, где m – количество молей липида в образце (раcсчитано как масса липида, делённая на его молекулярную массу). С другой стороны, анализ кривых плавления позволяет определить энтальпию плавления ∆H. На первый взгляд величины Q m и ∆H должны быть примерно равны, поскольку система не совершает механической работы. Однако оказалось, что при плавлении синтетических липидов ∆H превышает Q m в десятки, а иногда и в сотни раз. 40 В чём же тут дело? Вернёмся к основному уравнению (0.19). Его применение основано на том, что "...фазовое равновесие можно рассматривать как обратимую химическую реакцию s ↔ l с константой равновесия l s m K m = ". Спрашивается, какие "молекулы" s переходят в этой реакции в "молекулы" l. Очевидно, что это не отдельные молекулы фосфолипида, поскольку одна молекула не может находиться в жидкой или в твёрдой фазе. Переходит из одного состояния в другое одновременно несколько молекул, объединенных в группу, а лучше сказать кооперативную единицу. В пределах кооперативной единицы все молекулы находятся в одинаковом состоянии, образуя либо кристаллическую (твёрдую) фазу либо жидкую фазу. Каждая группа может изменять своё фазовое состояние по закону "всё или ничего" и притом совершенно независимо от других групп. В этом смысле кооперативные единицы представляют собой как бы «сверхмолекулы», которые могут переходить из состояния lв состояние s. Изменение свободной энергии ∆G, энтальпии ∆H и энтропии ∆S в уравнении (0.19) относится к молю таких "сверхмолекул". Довольно очевидно, что если кооперативная единица образована n молекулами фосфолипида, то m H n Q ∆ = ⋅ (0.21) где n – размер кооперативной единицы, т.е. число молекул фосфолипида, входящих в одну кооперативную единицу. Таким образом, из кривых плавления мы находим теплоту плавления в расчёте на n молей фосфолипида, тогда как из данных калориметрии мы определяем теплоту плавления в расчёте на один моль фосфолипида. Если одновременно получены данные калориметрии, позволяющие определить теплоту плавленияQ и рассчитать молярную теплоту плавления Q m , и величины ∆H по кривым плавления, то разделив ∆H на Q m , мы получим размер кооперативной единицы n. После этого можно из данных по кривым плавления найти ∆Sв расчете не на моль кооперативных единиц, а на один моль фосфолипида. В табл. 8.6 приведены полученные таким образом термодинамические параметры плавления синтетических фосфолипидов (в расчете на один моль фосфолипида). Таблица 8.6 Термодинамические параметры переходов гель–жидкий кристалл для 1,2-диацил-L- фосфатидилхолинов (по Phillips, 1972) Фосфолипид T c , °C ∆H, ккал/моль ∆S, кал/моль ДОЛ (18:1) –21 7,6 30,3 ДМЛ (14:0) 23 6,64 22,4 41 ДПЛ (16:0) 41 8,66 27,6 ДСЛ (18:0) 58 10,67 32,4 ДБЛ (22:0) 75 14,88 42,8 8.10.3. Влияние размера кооперативной единицы на форму кривых плавления Чтобы проанализировать влияние кооперативности фазовых переходов на форму кривых плавления и калориметрических кривых, нам придётся произвести некоторые расчеты. Главной характеристикой формы кривой плавления служит, как нетрудно догадаться, температурный интервал фазового перехода. Хотя это не принципиально, давайте примем за этот интервал разницу температур T 2 – T 1 , при которых в системе соотношение жидкой фазы к твердой составляет соответственно 10:1 и 1:10. При этом 2 ln 1 K = и 1 ln 1 K = − Из уравнений (0.19) и (0.21) находим 1 2 2 1 1 1 ln ln 2 nQ nQ K K R T R T − = ⋅ − ⋅ = − ; 1 2 1 2 2 ( ) R T T T T nQ − = − ; 1 2 2 ( ) 1 R TT T Q n ∆ = ⋅ (0.22) И этого уравнения видно, что при равных прочих условиях ширина температурного интервала фазового перехода обратно пропорциональна размеру кооперативной единицы. Как видно на рис. 8.30, включение холестерина в липидный слой уменьшает размер кооперативной единицы плавления, поскольку приросте содержания холестерина в мембране ширина температурного интервала перехода увеличивается, а амплитуда кривой поглощения тепла, соответственно, уменьшается (площадь под кривой, равная теплоте плавления при этом остается прежней). 42 Рис. 8.30. Влияние холестерина на кривые теплоемкости по данным ДСК. Цифры у кривых показывают содержание холестерина в молярных процентах. 8.11. Физическое состояние липидного бислоя и активность ферментов в биомембранах На рисунке 8.31 приведены данные о влиянии холестерина на микровязкость мембраны (оцененную по параметру упорядоченности S вращения спинового зонда) и на активность фермента Na-K-АТФазы в мембранах эритроцитов. Хорошо видно, что холестерин увеличивает микровязкость липидного бислоя и, как и следовало ожидать, тормозит работу фермента, осуществляющего транспорт ионов натрия и калия и поддерживающего тем самым водно-солевой баланс в клетке и электрический потенциал на мембране. Имеется обширная литература, в которой наблюдали изменение микровязкости мембран при самых различных воздействиях, как в норме так и при различных заболеваниях. Неизменным было всегда только одно: обратная зависимость между вязкостью липидного бислоя и активностью мембранных ферментов и белковых рецепторов. Это легко понять, если учесть, что белковые молекулы, как и люди, должны “пошевеливаться”, чтобы хорошо выполнять свою работу. 43 Холестерин / фосфолипид, моль/моль П араметр упорядоченности , S Рис. 8.34. Зависимость активности Na + , K + - АТФазы (1) и микровязкости (2 – параметр упорядоченности S) от содержания холестерина в мембране эритроцита. |