08_ Структура биологических мембран. 8. Структура биологических мембран
 Скачать 1.11 Mb.
|
|
Фазовый переход 40 10 20 30 40 50 80 120 π (дин /см ) Площадь на молекулу (A 2 ) o Площадь на молекулу (A 2 ) o Твердое состояние Жидкое состояние А Б Рис. 8.17. Кривые давление – площадь при разных температурах (слева). 1 – 6,2 о С; 2 –21,1 о С; 3 – 34,6 о С. Справа – форма молекул липидов в твердом (А) и жидком (Б) монослое. Очевидно, что при фазовом переходе происходит изменение формы молекул в монослое (рис. 8.17). В твердом монослое углеводородные цепи жирных кислот вытянуты и находятся в полностью-транс конфигурации (А). В жидком монослое углеводородные цепи жирных кислот пребывают в различных конфигурациях и образуют относительно рыхлые клубки (Б). Такие молекулы занимают большую поверхность. Сжимая пленку, можно преодолеть стремление молекул к хаосу и заставить их «вытянуться в струнку» (фазовый переход Б → А). Мембранная везикула Поверхностное давление А Мембрана Б Рис. 8.18. Роль поверхностного натяжения в формировании структуры липидного бислоя. А – замкнутая мембранная структура (везикула); Б – поверхностное давление на липидный бислой вызвано силами поверхностного натяжения. Может показаться, что ситуация, когда липидная пленка образуется при боковом давлении, а ее свойства зависят от величины этого давления, – это ситуация искусственная, а потому монослои не могут быть моделью липидного слоя биологических мембран. Но это не так. В замкнутых фосфолипидных везикулах боковое давление в липидном бислое создается поверхностным натяжением на границе между водным раствором и липидной (гидрофобной) фазой, как это проиллюстрировано на рис. 8.18. Эта величина зависит от липидного и белкового состава мембран и варьирует в 27 фосфолипидных везикулах от 0,2 до 6,0 мН·м –1 , а в биологических мембранах – от 0,03 до 3,0 мН·м –1 (Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. – М.: Мир, 1980. С. 94). 8.7. Модельные мембраны Изучение физических свойств липидного слоя мембран осуществляется преимущественно на двух видах искусственных мембранных структур, образованных синтетическими фосфолипидами или липидами, выделенными из биологических источников: липосомах и бислойных липидных мембранах (БЛМ). 8.7.1. Липосомы Липосомы – это липидные везикулы (пузырьки), образующиеся из фосфолипидов в водных растворах. Чтобы получить липосомы, спиртовый раствор фосфолипидов впрыскивают в большой объем водного раствора фосфолипиды, нерастворимые в воде, образуют мелкие пузырьки, стенки которых состоят из одного липидного бислой я (однослойные липосомы). Можно сначала высушить раствор фосфолипидов в органическом растворителе (например, хлороформе) в пробирке, добавить в пробирку водный раствор и хорошенько потрясти пробирку. Липиды переходят в водный раствор, теперь уже в виде многослойных липосом. Суспензию липосом обычно используют для изучения физических свойств липидного бислоя как вязкость, поверхностный заряд или диэлектрическая проницаемость, а также для изучения проницаемости для незаряженных молекул. 8.7.2. Бислойные липидные мембраны (БЛМ) Для изучения ионной проницаемости липидного слоя мембран используют БЛМ. Для приготовления БЛМ (см. рис. 8. 19) в стаканчик с раствором электролита помещают второй, тефлоновый стаканчик , в стенке которого сделано отверстие, диаметром около 1 мм. 28 1 2 3 4 5 6 Рис. 8.20. Установка для изучения электрических свойств бислойной липидной мембраны (БЛМ): 1 — стакан с раствором электролита (2); 3 — тефлоновый стаканчик с отверстием (4); 4 — БЛМ; 5, 6 — неполяризующиеся электроды. С помощью капилляра в отверстие вводят маленькую каплю раствора фосфолипида в жидком углеводороде, гептане или гексане (рис. 8.20, А). Молекулы фосфолипидов собираются на поверхности капли таким образом, что полярные головки молекул обращены в водную среду, а гидрофобные хвосты – внутрь капли (рис. 8.21, Б). Постепенно растворитель уходит из капли и улетучивается, а капля превращается в липидную пленку (БЛМ), рис. рис. 8.20, В, Г). В БЛМ полярные головки фосфолипидов обращены в водную фазу, а неполярные углеводородные цепи жирных кислот сливаются в сплошную вязкую фазу во внутренней части липидной мембраны. По многим свойствам эта пленка сходна с липидным слоем биологических мембран. A Б В Г Рис. 8.20. Стадии приготовления БЛМ. Объяснения в тексте 8.8. Фазовые переходы липидов в мембранах 8.8.1. Подвижность углеводородных цепей фосфолипидных молекул Атомы углеводородной цепи жирных кислот соединены между собой одинарными связями, вокруг которых, как на оси, разные участки цепи могут вращаться. Это вращение приводит к тому, что жирнокислотные цепи в молекулах фосфолипидов могут находиться в самых различных конфигурациях, как это показано на рис. 8.21. 29 1 2 3 Рис. 8.21. Различные конфигурации жирнокислотных цепей фосфолипидов. 1 – все-транс-; 2 – две гош- конфигурации; 3 – одна дубль-гош- конфигурация. Жирным шрифтом выделена связь, вокруг которой произошел поворот цепи на 180°. В результате такого вращения жирнокислотные цепи приобретают как бы гибкость, хотя на самом деле они не изгибаются в полном смысле этого слова, а лишь могут поворачиваться вокруг связей между атомами, что и приводит к изгибу молекулы в целом. За счёт изгиба цепей и постоянного теплового движения молекула фосфолипида частично утрачивает свою цилиндрическую форму и становится более сферической. На плоскости возможные конфигурации фосфолипидной молекулы изобразить трудно, но некоторые из них для иллюстрации приведены на рис. 8.21. Полностью вытянутая конфигурация (1) соответствует совершенно одинаковому расположению всех углеродных атомов друг относительно друга. Такая конфигурация называется полностью-транс конфигурацией. Альтернатива транс-конфигурации – это так называемая гош-конфигурация (рис. 8.21, 2). В мембранах жирнокислотные цепи стиснуты соседними молекулами, и свободная форма клубка для фосфолипидной молекулы не реализуется. Распространена поэтому двойная гош-конфигурация (рис.8.21, 3), при которой углеводородная цепь остаётся вытянутой вдоль оси. 8.8.2. Фазовые состояния липидного бислоя В биологических мембранах липидный слой по всем имеющимся данным представляет собой жидкое тело с вязкостью, близкой к вязкости подсолнечного масла. Строго говоря, текучесть мембраны ограничена внутренней гидрофобной фазой, которая состоит из углеводородных цепей жирных кислот. Вместе с тем в расположении молекул в мембране имеется дальний порядок. Фосфолипидные хвосты расположены приблизительно параллельно друг другу. Есть порядок и в ориентации гидрофильных голов. Для простоты такое состояние липидов мы будем называть жидким. Липидная фаза, однако, не всегда бывает жидкой. Состояние липидов в липидном бислое очень чувствительно к изменению параметров среды (температуры, давления, ионной силы, рН и т.д.). Так, при охлаждении до температур ниже 10°С липидный слой затвердевает, приобретая свойства двумерного кристалла. Такое состояние часто называют состоянием геля, но, во избежание неопределенности мы будем в дальнейшем называть его просто твердым. 30 Рис. 8.24. Плавление по данным рентгеноструктурного анализа: Различное расположение молекул липидов в бислое: а) – кристаллическое (твердое состояние); б) – после включения в бислой холестерина: в) – расплавленное (жидкое) состояние бислоя. Непосредственно данные рентгеноструктурного анализа дают толщину бислоя и толщину промежутка между монослоями в бислое. В твердом состоянии молекулы липидов в мембране расположены строго упорядоченно. Все гидрофобные углеводородные хвосты фосфолипидных молекул полностью вытянуты параллельно друг другу и имеют полностью транс-конформацию) (рис. 8.22, а). В жидком кристалле за счет теплового движения возможны структурные переходы: молекулы изгибаются, их параллельность в отдельных местах нарушается, поэтому толщина мембраны в гель-фазе больше, чем в жидком кристалле (рис. 8.24, в). При переходе в жидкое состояние значительно увеличиваются площадь мембраны (от 0,48 нм 2 до 0,58 нм 2 ) и следовательно, несколько увеличивается объем мембраны. 8.8.3. Плавление липидов при нагревании На примере сливочного масла мы знаем, что при низкой температуре липиды по свойствам напоминают твердое тело, а при нагревании становятся жидкими. Резкого перехода, подобно плавлению льда, не происходит ни в сливочном масле, ни тем более в липидном слое биологических мембран из-за сложного химического состава липидов в этих объектах. Но если приготовить мембранные структуры (липосомы) из синтетического фосфолипида, такого, как например, дипальмитоилфосфатидилхолин, то фазовый переход из твердого состояния в жидкое происходит в очень узком интервале температур, вплоть до всего одного градуса по шкале Цельсия. Температура фазового перехода чистых фосфолипидов в сильной степени зависит от длины и степени ненасыщенности цепей жирных кислот. Чем длиннее цепь, тем выше температура фазового перехода, поскольку увеличивается сила вандерваальсового взаимодействия. Наличие двойных связей в цепи снижает Tc, поскольку они нарушают оптимальный взаимодействия цепей в твердом состоянии. Природные липиды обычно содержат ненасыщенные связи, благодаря чему температура фазового перехода большинства природных липидов отрицательна, т.е. в естественных условиях природные 31 мембраны находятся в жидком состоянии. В мембранах, образованных синтетическими липидами (как правило, насыщенными), фазовый переход из жидкого в твёрдое состояние может происходить при более высоких температурах, в зависимости от химического состава фосфолипида. В табл. 8.6 приведены температуры фазовых переходов некоторых синтетических фосфатидилхолинов (лецитинов). Таблица 8.5 Температуры плавления некоторых синтетических фосфолипидов Жирные кислоты Название остатка жирной кислоты Сокращённое название фосфолипида 1) Температура плавления, T c , oC 14:0 Миристоил ДМЛ 23 16:0 Пальмитоил ДПЛ 41 18:0 Стеароил ДСЛ 58 18:1 Олеил ДОЛ –21(цис-форма) 1) Полное название фосфолипидов: ДМЛ – 1,2-димиристоилфосфатидилхолин (ещё одно возможное сокращение – ДМФХ) и так далее. Фазовые переходы в липидах зависят также от давления. При повышении давления увеличивается вероятность перехода бислоя в твердую фазу, поскольку эта фаза является более плотной, чем жидкая. Заряженные липиды очень чувствительны к ионной силе и pH среды (если липид имеет pK в исследуемом диапазоне pH). На температуру фазового перехода оказывают влияние вещества, содержащиеся в мембране, в частности, холестерин. Молекулы холестерина располагаются между фосфолипидными молекулами; они упорядочивают бислой в жидком состоянии и разупорядочивают его в твердом состоянии, уменьшая таким образом различия между жидкокристаллической и твердокристаллической структурами (рис. 8.22, б). 8.8.4. Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии Для изучения фазовых переходов чаще всего работают с температурными переходами, потому что их относительно легко исследовать и с высокой точностью измерять соответствующие параметры. Для проведения таких измерений обычно используют метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК). Метод называется дифференциальным, потому что измеряется только теплоёмкость суспендированного материала на фоне гораздо большей теплоёмкости раствора сравнения. Не останавливаясь на конструкции прибора, отметим только, что в конечном счёте с его помощью записывается кривая теплоёмкости, т.е. зависимость теплоёмкости липидов или мембран в 32 суспензии от температуры. Пример такой записи дан на рис. 8.23. По оси ординат отложена теплоёмкость, по оси абсцисс – температура. Рис. 8.23. Кривые теплоемкости и плавления ДПЛ (ДПЛ — дипальмитоиллецитин (дипальмитоилфосфатид илхолин)); 1 – кривая плавления (рассчитана путем интегрирования кривой 2), 2 – кривая изменения теплоемкости с температурой. На рис. 8.24 обозначены параметры кривой ДСК. На первом этапе нас будут интересовать три из них: 1. Температура фазового перехода ("плавления") T c , соответствующая середине перехода. 2. Температурный интервал ("ширина") фазового перехода ( ∆T). 3. Общее количество тепла Q, поглощённого при плавлении, представляющее собой площадь под кривой ДСК, т.е. функции C = f(T). Температура T, K T Те пл ое м ко ст ь q Q T с Q ∆T dq C dT = Рис. 8.24. Параметры кривой теплоемкости при плавлении, полученной методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии; С — теплоёмкость, ∆T — ширина фазового перехода, T c — температура плавления. Заштрихованная область соответствует количеству тепла q, поглощённого при нагревании до температуры T. 8.9. Кривые плавления Кривой плавления называется зависимость доли жидкой фазы в общем количестве изучаемого вещества, в данном случае – липидов мембран (рис. 8.25). Обозначим количество липидов в жидкой фазе через m l , а количество липидов в твёрдой фазе через m s . Тогда доля жидких липидов будет равна 33 l l s m m m α = + (0.12) Для определения доли жидкой фазы в общем объёме изучаемого материала, в нашем случае, в липидном слое мембран, можно использовать разные методы. 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 20 30 40 50 60 m l m s α Т с = 0,5 α T Температура ( о С) α = + m m m l l s Рис. 8.28. Кривая плавления липидов в липосомах, приготовленных из ДПЛ; a — доля жидкой фазы; T — температура, T c - температура плавления ( α = 0,5), m l — количество липида в жидкой фазе, m s — количество липида в твёрдой фазе. 8.9.1. Анализ кривых ДСК Один из методов основан на анализе кривых, полученных методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Обратимся снова к рис. 8.24. Пусть удельная теплота плавления липида равна Q m , а количество липидов в образце составляет m кмоль. Общее количество энергии, поглощённой образцом во всем интервале температур плавления T 1 – T 2 равно очевидно площади под кривой C = f(T), т.е. 2 1 T m T Q Q m CdT = ⋅ = ∫ (0.13) В интервале температур от T 1 до текущей температуры T расплавится количество молей липида m l , и при этом поглотится количество тепла, равное 1 T m l T q Q m CdT = ⋅ = ∫ (0.14) (заштрихованная площадь на рис. 8.24). При температуре T мольная доля липидов, находящихся в жидкой фазе равна l l l s m m q m m m Q α = = = + (0.15) 34 Измеряя отношение площадей под кривой C=f(T)при разных температурах, мы, таким образом, строим кривую плавления α =f(T) (рис. 8.25). 8.9.2. Измерение флуоресценции зондов Многие флуоресцирующие соединения обладают тем свойством, что спектры и (или) квантовые выходы их флуоресценции сильно зависят от окружающей среды: её полярности, вязкости и других характеристик. Растворяясь в липидной фазе мембран, эти соединения могут информацию о физических свойствах их окружения. Эти вещества получили названия флуоресцентных зондов, формулы некоторых зондов были приведены ранее (рис. 2.13). Один из них, 1-анилино-2-нафталенсульфонат (АНС), применяется особенно часто. Этот зонд хорошо флуоресцирует в органических растворителях и в связанном с мембранами состоянии, но очень слабо флуоресцирует в водном растворе. При добавлении АНС к суспензии мембран он распределяется между водной и липидной фазами, но флуоресцирует практически только АНС, растворённый в липидной фазе. Поэтому интенсивность флуоресценции возрастает при плавлении липидов мембран и снижается при замерзании. На рис. 8.26 показаны кривые плавления, измеренные с помощью другого флуоресцентного зонда – МБА. Это гидрофобный зонд, который флуоресцирует в липидной фазе мембран. Рис. 8.26. Кривые плавления, измеренные с помощью флуоресцентного зонда МБА. Цифры слева от кривых обозначают исходное положение максимума флуоресценции, справа — конечное. В этом опыте липосомы были сформированы из ДМЛ (слева) и ДПЛ (справа). При плавлении липидного слоя мембран происходит длинноволновый сдвиг флуоресценции МБА; измеряя этот показатель, можно рассчитать кривую плавления способом, изображенным на рис. 8.27. При температуре ниже фазового перехода (в 35 данном случае ≤ 34 о С) все липиды в мембране находятся в жидком состоянии, а при температуре выше фазового перехода (в нашем случае ≥ 50 °C) – в твердом. Будем считать, что измеряемый параметр (в нашем случае – положение максимума флуоресценции) линейно изменяется с увеличением доли жидкой фазы (что, вообще говоря, не всегда верно). Тогда отношение величин l/s на рисунке 8.27 покажет соотношение жидкой и твердой фаз в системе, а величина l/(s + l) – долю жидкой фазы в общем количестве липида. Зависимость последней величины от температуры и есть кривая плавления. 20 30 40 50 О С T o C Из меряем ы й пар аметр 514 528,5 s l Рис. 8.30. Способ расчета кривых плавления по экспериментальным данным. Для расчета взята одна из кривых на рисунке 8.26). Отношение величин l/s показывает соотношение жидкой и твердой фаз в системе. |