08_ Структура биологических мембран. 8. Структура биологических мембран
 Скачать 1.11 Mb.
|
|
8.2.4. Другие методы Применяются и другие методы изучения структуры белков и липидов в мембранах и ее изменений при функционировании мембран или под влиянием различных воздействий. К таким методам относится ИК-спектроскопия и метод комбинационного рассеяния, электронный парамагнитный и ядерный магнитный резонанс, флуоресцентные метки и зонды, измерения светорассеяния и другие. С методом спиновых и отчасти флуоресцентных зондов мы ознакомились в предыдущих разделах, равно как и с основами метода ядерного магнитного резонанса. На других методах мы будем кратко останавливаться на них по мере необходимости при дальнейшем изложении материала. 8.3. Белки мембран Белки мембран принято делить на интегральные и периферические. Интегральные белки имеют обширные гидрофобные участки на поверхности и нерастворимы в воде. С 14 липидами мембран они связаны гидрофобными взаимодействиями и частично погружены в толщу липидного бислоя, а зачастую и пронизывают бислой, оставляя на поверхности сравнительно небольшие гидрофильные участки. Отделить эти белки от мембраны удается только с помощью детергентов, типа додецилсульфата или солей желчных кислот, которые разрушают липидный слой и переводят белок в растворимую форму (солюбилизируют его) образуя с ним ассоциаты. Все дальнейшие операции по очистке интегральных белков осуществляются также в присутствии детергентов. Периферические белки связаны с поверхностью липидного бислоя электростатическими силами и могут быть отмыты от мембраны солевыми растворами. 8.4. Распределение функций между белками и липидами В клетках животных и растений цитоплазматические мембраны выполняют функции, зависящие от специализации данного типа клеток. Примеры этому даны в табл. 8.2. Мембраны нейронов генерируют электрические импульсы (потенциалы действия), а мембраны аксонов осуществляют их проведение по нервному волокну. Мембраны мышечных клеток отвечают за сокращение мышцы под действием пришедшего нервного импульса и т.д. Внутриклеточные структуры также обладают разнообразными функциями. Внутренняя мембрана митохондрий осуществляет преобразование энергии окисления субстратов в энергию АТФ. Мембраны саркоплазматического ретикулума мышечных клеток осуществляют удаление кальция из клеточного сока при расслаблении мышцы и его выброс при сокращении. Мембраны эндоплазматического ретикулума клеток печени осуществляют окисление чужеродных соединений (ксенобиотиков), включая лекарства и промышленные загрязнения и т.д. Все эти специализированные функции осуществляются благодаря функционированию специализированных мембранных белков, набор которых различен в разных мембранах. Липидныйслой, хотя и сложен по своему составу и также различается в различных мембранных структурах, повсюду выполняет одни и те же две основные функции: барьера для ионов и водорастворимых молекул и структурной основы («матрицы») для мембранных белков и гликолипидов. Именно благодаря наличию сплошного двойного слоя липидных молекул (называемого обычно липидным бислоем), практически непроницаемого для ионов и полярных молекул, растворимых в воде, во всех живых клетках биологические мембрану выполняют функцию барьера, отделяющего клетку от окружающей среды, и разделяющего внутренний объем клетки на сравнительно изолированные "отсеки" (компартменты, compartments). 15 В этот липидный бислой встроены многочисленные белковые молекулы и молекулярные комплексы, одни из которых обладают свойствами селективных (т. е. избирательных) каналов для ионов и молекул, а другие – насосов, способных активно перекачивать ионы через мембрану. Барьерные свойства мембран и работа мембранных насосов создают неравновесное распределение ионов между клеткой и внеклеточной средой, что лежит в основе процессов внутриклеточной регуляции и передачи сигналов между клетками (в том числе в форме электрического импульса). Вторая функция, общая для всех мембран – это функция "монтажной платы" или матрицы, на которой располагаются в определенном порядке белки и белковые ансамбли, образующие системы переноса электронов, запасания энергии в форме АТФ, регуляции внутриклеточных процессов гормонами, поступающими извне и внутриклеточными медиаторами, узнавания других клеток и чужеродных белков, рецепции света и механических воздействий и т. д. Гибкая и эластичная пленка, которой по существу являются все мембраны, выполняет и определенную механическую функцию, сохраняя клетку целой при умеренных механических нагрузках и нарушениях осмотического равновесия между клеткой и окружающей средой. Таблица 8.2 Некоторые функции биологических мембран Клетки Мембраны Функция Все клетки Цитоплазматические Активный транспорт ионов K+, Na+, Ca 2+ , подержание осмотического равновесия Большинство клеток Цитоплазматические Связывание гормонов и включение механизмов внутриклеточной сигнализации Большинство клеток (кроме эритроцитов) Внутренняя мембрана митохондрий Перенос электронов на кислород и синтез АТФ (окислительное фосфорилирование) Нервные и мышечные клетки Цитоплазматические Генерация потенциалов покоя и действия, распространение потенциала действия 16 Клетки печени Эндоплазматический ретикулум Окисление ксенобиотиков Большинство клеток (кроме эритроцитов) Эндоплазматический ретикулум Перенос ионов кальция из клеточного сока внутрь везикул Клетки зрительного эпителия Мембраны зрительных дисков Поглощение квантов света и генерация внутриклеточного сигнала 8.5. Химический состав мембран В табл. 8.3 приведено относительное содержание белков и липидов в некоторых мембранах. Грубо говоря, по весу мембраны состоят наполовину из белков, наполовину из липидов, но во внутриклеточных мембранах, содержащих переносчики электронов (внутренние мембраны митохондрий, мембраны микросом), белков существенно больше, чем липидов. Таблица 8.3 Относительное содержание белков и липидов (%) в некоторых мембранах (Котык А. и Яначек К. Мембранный транспорт, Москва: Мир, 1980, с. 33). Мембраны Белки Липиды Бычий миелин 22 78 Эритроциты человека 49 44 Плазматические мембраны клеток печени 60 40 Наружные митохондриальные мембраны 55 45 Внутренние митохондриальные мембраны 78 22 Микросомы из печени крыс 62 32 В состав липидов мембран входят в основном фосфолипиды, сфингомиелины и холестерин. Например, в мембранах эритроцитов человека их содержание, составляет, соответственно 36, 30 и 22 % по весу; еще 12% приходится на гликолипиды (Котык А. и Яначек К., Мембранный транспорт, Москва: Мир, 1980, с. 45). (табл. 8.4). Таблица 8.4 Состав липидов в мембранах эритроцитов человека Фосфолипиды 36,3 Сфингомиелины 29,6 Холестерин 22,2 Гликолипиды 11,9 17 Как видно из табл. 8.5, основные фосфолипиды мембран – это фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит и кардиолипин. Таблица 8.5 Содержание фосфолипидов и сфингомиелина в мозгу и почках человека (Котык А. и Яначек К. Мембранный транспорт, Москва: Мир, 1980, с. 44) Фосфолипиды Мозг Почки Фосфатидилхолин 29,2 37,9 Фосфатидилэтаноламин 35,0 30,8 Фосфатидилсерин 17,6 7,0 Фосфатидилинозитол 2,2 6,1 Кардиолипин 0,4 4,2 Фосфатидиловая кислота 0,5 0,6 Сфингомиелин 13,6 12,8 8.6. Липиды мембран Липидные бислои образуются амфифильными молекулами фосфолипидов и сфингомиелина в водной фазе. Амфифильными эти молекулы называют потому, что они состоят из двух частей, различных по своей растворимости в воде: полярной “головки”, обладающей высоким сродством к воде, т. е. гидрофильной, и “хвоста” образуемого неполярными углеводородными цепями жирных кислот; эта часть молекулы обладает низким сродством к воде, т. е. гидрофобна. С химической точки зрения фосфолипид состоит из четырёх частей: глицерина, двух жирных кислот с длинной углеводородной цепью, фосфорной кислоты и особой для каждого фосфолипида группы, которую мы будем называть характеристической группой. 18 О О О С О О О С O P=O I NH3 Б. Полярная голова фосфолипида Характеристическая группа + Фосфат Глицерин HO NH3 + Холин Этаноламин HO + N(CH ) 3 3 HO COO NH3 + Серин В. Характеристические группы фосфолипидов O P= O I NH 3 Углеводородный «хвост» (цепи жирных кислот) Полярная "голова" + O O O O O O- C C А. Фосфатидилэтаноламин О О О С О О О С O P=O I NH3 Б. Полярная голова фосфолипида Характеристическая группа + Фосфат Глицерин О О О С О О О С O P=O I NH3 Б. Полярная голова фосфолипида Характеристическая группа + Фосфат Глицерин HO NH3 + Холин Этаноламин HO + N(CH ) 3 3 HO COO NH3 + Серин В. Характеристические группы фосфолипидов HO NH3 + Холин Этаноламин HO + N(CH ) 3 3 HO COO NH3 + Серин В. Характеристические группы фосфолипидов O P= O I NH 3 Углеводородный «хвост» (цепи жирных кислот) Полярная "голова" + O O O O O O- C C А. Фосфатидилэтаноламин O P= O I NH 3 Углеводородный «хвост» (цепи жирных кислот) Полярная "голова" + O O O O O O- C C А. Фосфатидилэтаноламин Рис. 8.5. Вверху - Амфифильная молекула фосфолипида фосфатидилэтаноламина. Внизу - Характеристические полярные группы некоторых фосфолипидов. Примером амфифильной молекулы может служить молекула фосфатидилэтаноламина, пространственная структура которой показана на рис. 8.5, А. В фосфатидилэтаноламине характеристической группой является остаток этаноламина (рис. 8.5, Б). В других фосфолипидах такой группой может остаток холина, серина и другие полярные молекулы (см. рис. 8.5, В). В состав липидного слоя мембран входят также холестерин и сфингомиелины; последние близки к фосфолипидам по химическому строению и физическим свойствами. 8.6.1. Липидные кристаллы На рисунке 8.6 приведены результаты рентгеноструктурного анализа кристаллов дилауроилфосфатидилэтаноламина (ДЛФЭ). В таких кристаллах молекулы фосфолипида располагаются в виде чередующихся бимолекулярных слоев. Рис. 8.6. Структура бислоев дилауроилфосфатидилэтанол амина (ДЛФЭ) (по результатам рентгеноструктурного анализа кристаллов ДЛФЭ). 19 Атомы кислорода (O11–O22) , фосфора (P) и азота (N) сгруппированы в районе "полярной головки", а основная масса атомов – углероды – образует две углеводородные цепи "жирного хвоста" фосфолипидной молекулы (рис. 8.7). Если рассматривать пространственную структуру бислоя ДЛФЭ в плоскости слоев липидных молекул), то видно, что молекулы образуют в плане мембраны регулярную структуру. Однако при детальном воспроизведении положения каждого атома картина получается довольно сложной (рис. 8.7). Рис. 8.7. Упаковка молекул в кристалле 1, 2-дилауроил- фосфатидил-этаноламина (по данным рентгеноструктурного анализа). Вид на плоскость монослоя. Кружочки – атомы полярных групп, черточки – химические связи. 20 Рис. 8.8. Расположение фосфолипидов в мембране. Вид на плоскость мембраны. Эту картину можно упростить при грубом разрешении (см. рис. 8.8). Хорошо видно, что жирнокислотные цепи имеют вид окружностей, упакованных с максимальной плотностью, т. е. образуя нечто наподобие гексагональной решетки. Такая плотная упаковка характерна, однако, только для фосфолипидных мембран, построенных из одинаковых молекул, которые при температуре ниже температуры плавления находятся в кристаллическом (твердом) состоянии. При нагревании прежде всего нарушается регулярность упаковки молекул в плане мембраны («предпереход»), а затем жирнокислотные цепи переходят из все-транс конфигурации в иные конфигурации и бислой делается жидким (фазовый переход – плавление). Данные рентгеноструктурных и других исследований показывают, что жирнокислотные цепи в молекулах фосфолипидов обычно вытянуты под некоторым углом к плоскости мембраны, как это видно на рис. 8.9. При этом угол наклона различается у разных фосфолипидов и может изменяться при структурных перестройках липидного бислоя. 21 Рис. 8.9. Расположение молекулы фосфолипида в бислое по данным рентгеноструктурного анализа. Кружочки показывают расположение отдельных атомов: (а) — азот, (б) — фосфор, (в) — кислород, (г) — углерод. Пунктиром показан профиль электронной плотности одного монослоя в мембране по данным РСА. 8.6.2. Самосборка липидных мембран в водной среде Данные рентгеноструктурного анализа и другие показывают, что молекулы фосфолипидов имеют форму цилиндра, сплюснутого с боков и разделенного по длине на две неравные части: небольшую "голову", состоящую из полярных групп, и гидрофобный "хвост". Такое строение приводит к тому, что в водных растворах фосфолипидные молекулы самособираются в бислойную мембрану. В мембране "жирные хвосты" упрятаны внутрь, а снаружи в контакте с водным окружением оказываются полярные "головы" этих молекул (рис. 8.10). В водном растворе происходит не только самосборка мембран (рис. 8.10, справа), но и замыкание мембран с образованием липидных пузырьков, называемых липосомами (рис. 8.10, слева). Полярные группы Жирные хвосты Липидная везикула Липидная мембрана Полярные группы Жирные хвосты Липидная везикула Липидная мембрана Рис. 8.11. Самосборка фосфолипидных молекул в липидных везикулы в водном растворе. Слева – фосфолипидная везикула (липосома) в водном растворе; справа – участок мембраны липосомы, выделенный пунктиром при большом увеличении. 22 8.6.3. Монослои фосфолипидов на границе раздела фаз На поверхности водных растворов амфифильные молекулы, включая мембранные липиды, образуют мономолекулярную пленку (монослой), как это схематически изображено на рис. 8.11. Рис. 8.11. Расположение молекул липидов в монослое на водной поверхности. Изучение свойств таких мономолекулярных пленок дало довольно много для понимания свойств бимолекулярного липидного слоя мембран. Прикладывая определенное боковое давление к пленке π, можно уменьшать площадь пленки S (и площадь, занимаемую каждой липидной молекулой на поверхности) (рис. 8.12). При малых давлениях молекулы фосфолипида на поверхности воды не взаимодействуют друг с другом, образуя, так сказать, «двумерный газ» (область a на рис. 8.13). Затем происходит конденсации «газа» (область b), приводящая к образованию «жидкой» пленки на поверхности воды (область c). Молекулы в пленке соприкасаются друг с другом, и сжимание пленки требует преодоления упругих сил. 23 π π π π Рис. 8.12. Схема ванны Ленгмюра для изучения монослоев фосфолипидов (объяснение в тексте). Подвижная пластина на поверхности жидкости сжимает монослой с силой π [Н/м]. ∆S – изменение площади монослоя в ответ на прилагаемое воздействие. f - разрушение пленки (коллапс) e - область твердой пленки d - фазовый переход c - жидкая пленка b - область конденсации газа A - площадь π - давл ение Направление сжатия f - разрушение пленки (коллапс) e - область твердой пленки d - фазовый переход c - жидкая пленка b - область конденсации газа A - площадь π - давл ение Направление сжатия Рис. 8.13. Схематическое изображение кривых площадь — давление в монослоях липидов. (объяснение в тексте) По мере сжатия жирнокислотные цепи принимают все более вытянутую форму, переходя в конце концов в полностью-транс конфигурацию. Пленка становится «твердой», т.е. почти несжимаемой (область e). Переход между жидким и твердым состоянием происходит «скачком», эта область сосуществования твердой и жидкой фаз соответствует плавлению монослоя (область фазового перехода d). Наконец, при попытке еще больше 24 сжать пленку, монослой разрушается, превращаясь в многослойную структуру (область коллапса, т. е. разрушения пленки – f на рис. 8.13). «Твердая» пленка «Жидкая» пленка Рис. 8.14. Влияние химического состава Рис. 8.14. Влияние химического состава на поведение монослоев липидов (С – холестерин, 1 – 19- норхолестерин, 2 – 16:0/18:1с-лецитин, 3 – 2+53,9 мол.% С, 4 – 2+53,9 мол.% 1). Рис. 8.15. Кривые давление – площадь при разных температурах (oC) (1 – 6,2; 2 – 12,4; 3 – 16,8; 4 – 21,1; 5 – 26,0; 6 – 29,5; 7 – 34,6). Кривые зависимости давления от площади зависят от химического состава липидов и температуры, но в общем варьируют между двумя крайними случаями (см. рис. 8.14, 8.15). В первом случае пленка проявляет большую жесткость: начиная с некоторой 25 пороговой величины, площадь ее (около 50 Å на молекулу) мало меняется даже при высоких давлениях. Молекулы липидов в этом случае с самого начала занимали малую поверхность, но зато уменьшить ее еще больше очень трудно. Такое поведение характерно для твердых тел, и монослой в этом состоянии можно назвать твердым. Твердое состояние в монослоях характерно для фосфолипидов, содержащих только насыщенные жирные кислоты с достаточно длинной цепочкой и при том при сравнительно низких температурах. В случае фосфолипидов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты, а также насыщенные жирные кислоты с относительно короткой цепью, монослой проявляет значительную эластичность: при малых давлениях молекулы занимают большую поверхность (около 100–120 Å), а с ростом давления сжимается лишь постепенно (рис. 8.14, 8.15). Такое состояние липидного слоя принято называть жидким. Рис. 8.16. Плавление монослоя при заданном давлении. В некоторых случаях удается наблюдать фазовые переходы в монослое при измерении давления при определенной температуре или при изменении температуры при заданном давлении. При этом происходит как бы переход кривых давление- площадь из одной формы в другую (средняя кривая на рис. 8.15). Особенно четко фазовые переходы в монослое можно наблюдать, если фиксировать поверхностное давление измерять площадь монослоя (в расчете на одну молекулу) при разных температурах. Как видно на рис. 8.16, при определенной температуре происходит скачкообразное изменение (при нагревании – увеличение) площади, занимаемой молекулами в монослое. Это изменение площади вызвано фазовым переходом (при нагревании – плавлением) липидов в монослое. Температура фазового перехода (T c ) зависит от химического состава липидов. |