Толстиков Никита Алексеевич_Биофамакология_30.11.20 (1). Биофармакология
 Скачать 32.93 Kb.
|
|
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра биотехнологии ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ№3 по дисциплине «Биофармакология» Выполнил: Студент 1 курса ФГМБО группа № 192 Направление подготовки: 19.04.01 — Биотехнология Толстиков Никита Алексеевич Руководитель дисциплины: доцент кафедры биотехнологии, к.б.н., доцент Чурилова Т.М. Дата выполения 30.11.2020 г. Ставрополь 2020 г. ДИСЦИПЛИНА: БИОФАРМАКОЛОГИЯТЕМА: БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО ГОРМОНОВИзучите материал и заполните таблицы: СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СТЕРОИДОВ
Ответы на вопросы для самоконтроля: Опишите механизм биологической активности соматотропина и перспективы применения в медицинской практике Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный оста- ток метионина на H2N-концe молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка был осуществлен в 1979 г. Д.Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, с фен (– NH2) долей (23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических испытаний на токсичность компанией «Генетех» (Сан-Франциско, США) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина. В ряду гормональных препаратов, получаемых биотехнологическими методами, особое место занимает соматропин – гормон роста человека (ГРЧ, рГРЧ). Нарушения роста у детей занимают третье место в структуре детской эндокринной патологии. Наиболее выраженные клинические проявления и тяжелый прогноз заболевания имеют дети, страдающие соматотропной недостаточностью. Что представляют собой препараты рекомбинантного ГРЧ (рГРЧ) для применения в медицинской практике? Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный оста- ток метионина на H2N-концe молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка был осуществлен в 1979 г. Д.Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, с фен (– NH2) долей (23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических испытаний на токсичность компанией «Генетех» (Сан-Франциско, США) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина. ГРЧ в клетках Е. coliи в культуре клеток животных был получен в 1982 г. одновременно в Институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГРЧ, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне. Что является характерной особенностью соматотропина? Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипо- физарной карликовости в развитых странах. Основные производители - Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка. На чем основан метод получения соматотропина методами генетической инженерии? Химический синтез гормона сложен и дорог. Именно поэтому соматотропин оказался одним из первых продуктов, полученных методами генетической инженерии. Фирмой Genentech Inc.(CШA) был сконструирован «квазисинтетический» ген соматотропина, построенный из синтетического фрагмента ДНК, кодирующего 23 аминокислоты N- концевой части гормона и фрагмента кДНК, несущего информацию об остальной части молекулы соматотропина. Введение его в плазмиду, содержащую бактериальный промо- тор (регуляторный элемент, контролирующий транскрипцию гена) и сигнал инициации трансляции, обеспечивало эффективную экспрессию гена и приводило к синтезу гормона роста. С чем связаны трудности получение эритропоэтина? Во всех случаях получение эритропоэтина ограничивается трудностями, связанными с выделением и культивированием клеток, нестабильностью продукции гормона и, наконец, низкой концентрацией его в культуральных жидкостях. Принципиально иной подход к получению больших количеств высоко очищенного эритропоэтина был связан с применением методов генной и клеточной инженерии. Была сделана попытка создания бактериального продуцента эритропоэтина (Lee-Huang S., 1984 ). Продуцируемый в Escherichia coli белок узнается антителами против эритропоэтина и имеет молекулярную массу, примерно соответствующую дегликозилированному эритропоэтину человека. Известно, что бактериальные клетки имеют систему гликозилирования, принципиально отличающуюся от эукариотической. Поэтому получить корректно гликозилированный белок в бактериальных клетках невозможно. В случае эритропоэтина получение корректно гликозилированного гликопротеида имеет принципиальное значение и, следовательно, создание продуцента гормона на основе бактериальных клеток является нецелесообразным. 6. Какими способами получают меченый эритропоэтин? мечение тритием по углеродной части ( Krantz S., Goldwasser E., 1984 ); иодирование ( Sawyer S. et al., 1987 , Todokoro K. et al., 1987 ); включение меченных радиоактивной серой аминокислот в процессе биосинтеза рекомбинантного эритропоэтина в трансфецированных клетках (Mufson P., Gesner T., 1987). 7. В каких клетках можно культивировать рекомбинантный человеческий инсулин? Рекомбинантный человеческий инсулин синтезируется с помощью внедрения ДНК из каждой цепи инсулина отдельно в ДНК ослабленных неинфекционных штаммов бактерий Escherichia Coli – более известный как E.coli. Затем бактерии проходят много циклов деления клеток и могут производить много копий каждой цепи инсулина. Индивидуальные цепи молекулы инсулина извлекают из бактерий и очищают. Две цепи, которые составляют полную молекулу инсулина, затем перемешивают и оставляют для связывания друг с другом. Рекомбинантный человеческий инсулин можно культивировать и в клетках дрожжей. Клетки дрожжей могут выделять полную молекулу инсулина, содержащую обе цепи уже связанные друг с другом. Такое производство лучше по сравнению с E.coli, так как минует дополнительный шаг смешения двух цепей вместе. Благодаря каким свойствам клеток Е. coli они могут использоваться для получения инсулина? Опишите свойства генно-инженерных штаммов Е.соlі. Природа гормонального вещества, продуцируемого Е. соlі, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препептида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин. Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химико-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гель-проникающей, анионообменной). В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генноинженерных штаммов Е. соlі. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и іn ѵіѵо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трѐх дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хроматографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности. 9. На чем основан контроль качества генно-инженерного инсулина? Основные отличия производственного процесса от лабораторного следующие: а) посевной материал (инокулят) выращивался в ферментере, рабочим объемом 200 л (температура +37оС, рН 7,0, рО2 – 55% от насыщения, давление в аппарате 0,25 атм), с автоматическим контролем параметров процесса. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости, материал передавался в производственный ферментер. б) Выращивание штамма-продуцента проводилось в производственном ферментере объемом 3000 л. Процесс контролировался автоматизированной системой управления (АСУ ТП) с параметрированием основных характеристик. в) Стадия сбора клеток и отмывки ТВ осуществляется на промышленном сепараторе непрерывного действия. Стадия разрушения упрощена применением замкнутого контура. Основные характеристики процесса: съем биомассы с 1000 л - 70 кг (влажность 72%); количество ТВ – 17 кг (влажность 80%); суммарное содержание белка – 2100г; (содержание РБ 86%); продуктивность – 1,8 г РБ с 1 л культуральной жидкости. 10. Перечислите основные этапы исследований, положенных в основу технологии производства инсулина. создание штамма-продуцента инсулина; создание технологии получения субстанции ГИЧ; масштабирование процесса и создание опытно-промышленного производства активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина; разработка методов контроля качества и создание стандарта качества (фармакопейной статьи предприятия). Как готовится посевной материал из эталонной (музейной) культуры штамма-продуцента Приготовление посевного материала. Эталонную (музейную) культуру штамма-продуцента дважды последовательно высевали на агаризованной питательной среде. Отобранные клоны проверяли на продуктивность РБ методом электрофореза на полиакриламидном геле. Уровень накопления гибридного белка должен быть не менее 30% от суммы всех белков клетки. Далее для выращивания маточной культуры в колбу с жидкой питательной средой вносили несколько типичных колоний рабочей культуры и выдерживали при +37оС. Готовая маточная культура имела оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 7,5 оптическим единицам (ОЕ); рН 5,1 и типичную морфологию клеток при отсутствии посторонней микрофлоры. Инокулят, получаемый из маточной культуры, имел оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 4,3 ОЕ; рН 6,1 и был использован на стадии биосинтеза. Биосинтез РБ. Выращивание штамма-продуцента проводили в биореакторе (ферментере) объемом 200 л, содержащем питательную стерильную среду. В ферментер засевали инокулят и проводили биосинтез при температуре +37оС, рН 7,0, рО2 - 55% от насыщения и давлении в аппарате 0,25 атм. Температуру, рН, давление в аппарате поддерживали автоматически. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости культуру непрерывно подпитывали раствором глюкозы. В ходе культивирования в ферментер вносили раствор ампициллина и проводили индукцию синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ). Через 4-5 ч. После добавления индуктора процесс останавливали. Общее время культивирования составляло 12-13 ч. Съем сырой биомассы с 1 л культуральной жидкости – 55 г, содержание влаги – около 70%, содержание рекомбинантного белка в клетках биомассы – 25-30 %. Получение биомассы. Культуральную жидкость центрифугировали с помощью проточной центрифуги. Средний съем сырой биомассы – 11 кг, влажность - 72%, содержание РБ в биомассе – 27-30%. Разрушение клеток и выделение телец включения. Подготовленную суспензию клеточной биомассы разрушали на проточном дезинтеграторе при повышенном давлении в 600 атм. за 3-4 цикла дезинтеграции. Разрушение клеток контролировали по накоплению растворимого белка, степень разрушения клеток оценивали визуально с помощью микроскопа. Степень разрушения клеток составляла 90-95%. Дезинтегрированную суспензию клеток далее подавали на вращающийся ротор проточной центрифуги. Скорость подачи не более 1 л/мин. Вес влажного осадка телец включения (ТВ), содержащих рекомбинантный белок, составлял около 3 кг (15 г/л КЖ), содержание влаги около 80%, содержание РБ около 50%. 12. Назовите основные отличия производственного процесса синтеза инсулина от лабораторного. Основные отличия производственного процесса от лабораторного следующие: а) посевной материал (инокулят) выращивался в ферментере, рабочим объемом 200 л (температура +37оС, рН 7,0, рО2 – 55% от насыщения, давление в аппарате 0,25 атм), с автоматическим контролем параметров процесса. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости, материал передавался в производственный ферментер. б) Выращивание штамма-продуцента проводилось в производственном ферментере объемом 3000 л. Процесс контролировался автоматизированной системой управления (АСУ ТП) с параметрированием основных характеристик. в) Стадия сбора клеток и отмывки ТВ осуществляется на промышленном сепараторе непрерывного действия. Стадия разрушения упрощена применением замкнутого контура. Основные характеристики процесса: съем биомассы с 1000 л - 70 кг (влажность 72%); количество ТВ – 17 кг (влажность 80%); суммарное содержание белка – 2100г; (содержание РБ 86%); продуктивность – 1,8 г РБ с 1 л культуральной жидкости. Охарактеризуйте стерины с позиции их растворимости в воде Растворимость стеринов в воде очень низка. В настоящее время стерины, предназначенные для окисления, в небольшой концентрации (порядка 1 г/л) вносят растворенный в малотоксичном, смешивающемся с водой растворителе (ацетоне, спирте, диметилформамиде). При более высоких концентрациях стеринов (выше 1 г/л) их вносят в среду в виде мелкоизмельченной пудры; для этого кристаллы стерина растирают в специальной аппаратуре или разрушают ультразвуком. 14. На чем основана трансформация стеринов микроорганизмами? Трансформация стеринов микроорганизмами основана на их использовании в качестве источника углерода, поэтому стимуляция роста трансформирующих штаммов должна приводить к увеличению выхода продуктов расщепления стеринов. Процесс стимулируется насыщением среды кислородом. Добавление в питательную среду некоторых масел в количестве 1-3 мас.% (соевого, арахисового, рапсового, оливкового) повышает выход продукта трансформации. Аналогичные результаты получены с применением глицеридов животного и растительного происхождения (тристеарин, триолеин, трипальмитин). Механизм стимуляции роста глицеридами, вероятно, состоит в устранении гидрофобности стеринов, глицериды действуют так же, как истинные ПАВ, обычно применяемых для микробиологических процессов трансформации. Температурный режим микробиологических трансформаций стероидов не отличается от принятых для других микробиологических процессов и составляет 24 - 330С. Условия рН определяются при отборе штамма культуры-трансформатора и колеблются в широком интервале. 15. С чем связывают дальнейшие успехи в производствестероидных препаратов? Применением иммобилизованных клеток; Использованием оптимального сочетания биологических и химических превращений; Совершенствованием технологии очистки получаемых соединений. Раскройте преимущества микробиологических методов перед химическими Природные стерины – сырье для получения ценных лекарственных препаратов. Большой класс стероидов характеризуется наличием в молекуле спсцифического циклического скелета – циклопентанпергидрофенантрена, построенного из четырех колец, три из которых шесгичленные (А, В и С) и одно – пятичленное (D). Для обозначения различных положений этого кольца принята следующая нумерация. К стеринам (стеролам) относятся стероиды, несущие в положении С-3 гидроксильную группу. Опишите штаммы микроорганизмов, обладающие способностью к трансформации (биоконверсии) стероидов Микробиологические трансформации стероидов заключаются в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный процесс микробной биотрансформации стероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования (11-альфа-гидроксилирование) прогестерона некоторыми видами грибов (Aspergillus ashraceus. 18. В основе промышленного получения каких продуктов лежит гидроксилирование кортикостерона? Большинство поступающих в продажу стероидов, обладающих противовоспалительным действием, – это производные преднизолона, и именно этим определяется важная роль процессов микробного гидроксилирования кортикостерона (вещества S Рейхштейна) и его производных. В промышленном масштабе производство гидрокортизонапутем гидроксилирования кортикостерона осуществляется при участии некоторых видов грибов (например, Cunninghamella blakesleeana) с начала 50-х гг. За это время процесс был неоднократно усовершенствован. 19. Как осуществляется микробиологический синтез гидрокортизона и получение из него путем биоконверсии преднизолона? Схема применяемого в промышленности метода микробной трансформации прогестерона. Прогестерон Гидроксилирование Дегидрирование, отщепление боковой группировки, раскрытие кольца  11α-гидроксипрогестерон 1-Дегидротестолактон |