Биотехника размножения
 Скачать 288.22 Kb.
|
|
1 Петрозаводский государственный университет БИОТЕХНИКА РАЗМНОЖЕНИЯ Рабочая тетрадь с методическими указаниями для лабораторно-практических занятий по курсу «Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных» для студентов 4 курса специальности 3107 «Зоотехния» Петрозаводск 2002 2 Рассмотрены и утверждены к печати на заседании редакци- онной комиссии по отрасли науки и техники «Проблемы агро- промышленного комплекса» 20 мая 2002 г. Печатаются по решению редакционно-издательского совета Петрозаводского государственного университета Составители: И.П.Комлык, канд. с.-х. наук, доцент кафедры зоотехнии В.Ю.Сиротинина, ст. преподаватель кафедры зоотехнии Электронный вариант тетради находится по адресу: http://www.karelia.ru/psu/Chairs/zootech.html 3 СОДЕРЖАНИЕ Введение…………………………………………… 4 Тема 1. Подготовка материалов, применяемых при ис- кусственном осеменении сельскохозяйственных животных…………………..……………………… 5 Тема 2. Методы получения спермы. Порядок подготовки искусственной вагины………..…………………… 10 Тема 3. Оценка спермы по внешним признакам. Визу- альная оценка активности и концентрации спермиев…………………………………………… 13 Тема 4. Определение концентрации спермиев в счетных камерах…………………………………………….. 21 Тема 5. Определение резистентности спермиев…………. 26 Тема 6. Оценка спермы по интенсивности дыхания…….. 27 Тема 7. Определение процента живых спермиев………… 29 Тема 8. Влияние на спермии физических и химических факторов…………………………………………… 32 Тема 9. Исследование глубокозамороженного семени….. 37 Тема 10. Учет и отчетность в искусственном осеменении 40 Тема 11. Организация работы по получению, разбавле- нию и замораживанию спермы быков на плем- предприятии «Карельское»………………………. 43 4 Введение Искусственное осеменение – крупнейшее достижение био- логической науки ХХ века. В течение последних 50 лет искусст- венное осеменение является основным зоотехническим методом воспроизводства сельскохозяйственных животных. Он широко используется как для контроля заболеваний скота, передающихся половым путем, так и для улучшения генетических показателей сельскохозяйственных животных. Использование криоконсервантов для глубокого заморажи- вания спермы позволило продлить жизнь спермиев, полученных от высокоценных племенных производителей, открыло возмож- ности для транспортировки семени в отдаленные регионы России и за рубеж. Прогресс эндокринологической науки в области размноже- ния самок сельскохозяйственных животных привел к развитию методов синхронизации эструса с использованием простагланди- нов или прогестагенов. Это позволило внедрить в зооветеринар- ную практику метод трансплантации эмбрионов сельскохозяйст- венных животных. Несмотря на прогресс, достигнутый в области искусствен- ного осеменения, существуют проблемы с использованием замо- роженного семени в свиноводстве и овцеводстве. Большой инте- рес представляет изучение морфологии и биохимии спермиев, рассмотрение влияния семенной плазмы на жизнеспособность спермиев, изучение механизмов акросомной реакции и капаци- тации спермиев. Данные методические указания разработаны для приобрете- ния навыков практической работы в области искусственного осеменения в соответствии с программой курса «Акушерство, гинекология и биотехника размножения». 5 Тема 1. Подготовка материалов, применяемых при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных Приборы и материалы. Колбы, воронки, мензурки разного объема, мер- ные стаканы и цилиндры, флаконы, баночки с притертыми крышками (100 мл – три, 400 мл - одна), спиртометры, стеклянные палочки; пинцеты, ножницы, корнцанги, влагалищные зеркала, спермоприемники, шприцы-катетеры, ампу- лы, полиэтиленовые перчатки; сода двууглекислая и кальцинированная, хлори- стый натрий (в таблетках), спирт 96%-ный, дистиллированная вода; марля, вата белая, фильтровальная бумага; сушильный шкаф, стерилизатор. Задание 1. Освоить методику обработки инструментов и по- суды, приготовления растворов, применяемых при получении, разбавлении, расфасовке спермы и при искусственном осемене- нии самок сельскохозяйственных животных. 1. Порядок работы при использовании разных методов обез- зараживания посуды и инструментов. Порядок мойки посуды и инструментов. Обеззараживание жаром. 6 Автоклавирование. Кипячение. Фламбирование. Обеззараживание спиртом. 7 Обеззараживание ультрафиолетовым облучением (УФО). 2. Порядок приготовления растворов для использования на пунктах искусственного осеменения. Приготовление 70%-ного спирта. Приготовление раствора соды: а) кальцинированной б) двууглекислой 8 Приготовление раствора фурацилина. Приготовление 1%-ного раствора хлористого натрия. Приготовление раствора лимоннокислого натрия. 3. Приготовление стерильных ватных тампонов и марлевых салфеток. 9 Задание 2. Перечислите инструменты, применяемые при разных методах искусственного осеменения самок сельскохозяй- ственных животных, и наиболее эффективные методы их обра- ботки. Опишите технику осеменения коров и телок. 1. Визо-цервикальный метод. 2. Мано-цервикальный метод. 3. Ректо-цервикальный метод. 10 Тема 2. Методы получения спермы. Порядок подготовки искусственной вагины Приборы и материалы. Искусственные вагины в разобранном виде, под- ставки для искусственных вагин; стерильные марлевые салфетки, ватные там- поны, пропитанные 96%-ным спиртом; 70%-ный спирт, 2,8-3,0%-ный раствор цитрата натрия; пинцеты, корнцанги, ерши для мытья вагин, термометры; мер- ные стаканы, стеклянные палочки, воронки, сливные чашки; горячая и холодная вода. Задание 1. Изучить устройство искусственной вагины и правила ее сборки. Цилиндр. Таблица 1 Размеры цилиндра искусственной вагины для разных видов животных Вид животного Длина (см) Диаметр (см) Баран 20 5,5 Бык 50 8-9 Жеребец 54 13 Хряк 30-35 6-9 Резиновая камера (трубка). 11 Эбонитовый краник, резиновая трубка. Резиновые кольца. Резиновый держатель для спермоприемника. Спермоприемник. Сборка искусственной вагины. 12 Задание 2. Описать порядок подготовки искусственной ва- гины для получения спермы от быка. Зарисовать правильно соб- ранную вагину. Указать, какие условия должны соблюдаться при взятии спермы. 13 Тема 3. Оценка спермы по внешним признакам. Визуальная оценка активности и концентрации спермиев Приборы и материалы. Микроскопы, нагревательные столики Морозова, предметные и покровные стекла, термометры, мерные цилиндры на 10-15 мл, стеклянные палочки, воронки, сливные чашки, горячая и холодная вода, марле- вые салфетки. Задание 1. Изучить анатомическое строение спермия. У спермия различают головку, шейку, тело и хвост. Головка является носителем наследственной информации. Шейка, тело и хвост – двигательная часть спермия. Таблица 2 Величина спермиев в микронах (1 микрон ( μ) = 0,001 мм) Головка Вид живот- ного Длина спер- мия дли- на ши- ри- на тол- щи- на Шейка Тело Хвост Баран 66-75 8 5 1 1,5 13,6 42 Бык 65-72 9 4 1 1,0 10-13 44-53 Жеребец 58-60 7 4 2 10,0 42-43 Хряк 55-57 8 4 1 неот- личима от тела 11,0-11,8 33-38 Приготовление раздавленной капли. На чистое предметное стекло нанести стеклянной палочкой каплю исследуемой спер- мы, накрыть покровным стеклом. Капля должна быть среднего размера. Если капля слишком маленькая, то под покровным стеклом останутся свободные промежутки или образуются пу- зырьки воздуха, что будет затруднять исследование. Если капля очень большая, сперма вытекает из-под покровного стекла (стек- ло плавает), при этом может попасть на объектив, затруднив пра- вильность наводки поля зрения и нарушив тем самым процесс исследования. 14 Микроскопирование спермы. Исследование спермы под микроскопом с несколькими объективами начинают с установки поля зрения при малом увеличении. Затем, переведя револьвер микроскопа, устанавливают объектив нужного увеличения. Рез- кость при этом сохраняется или требует незначительной регули- ровки микровинтом микроскопа. Сперма очень чувствительна к температурным колебаниям. При резком ее охлаждении наступает холодовой удар (темпера- турный шок), движение спермиев прекращается, значительная часть их погибает. Чтобы не допустить этого, работу со спермой следует проводить в помещении с температурой 18-25 0 С. Если температура ниже 18 0 С, необходимо пользоваться спе- циальным термостатом или обогревательным столиком. Иссле- дование на подвижность спермы, охлажденной до 0 0 С, проводят обязательно при температуре 38-40 0 С в термостате или на обог- ревательном столике. Порядок работы 1. Подготовить к работе микроскоп, обогревательный сто- лик Морозова. 2. Приготовить раздавленную каплю спермы быка. 3. При наблюдении под микроскопом за двигающимися и вращающимися вокруг продольной оси спермиями можно ви- деть, что головка представляет собой вогнуто-выпуклую пла- стинку овальной формы и несколько суженную со стороны шей- ки. Короткой и тонкой шейкой головка прикреплена к телу спермия; длина его вдвое больше, чем головка. Внутри шейки, тела и хвоста спермия проходит осевая нить, состоящая из 2 цен- тральных фибрилл и окружающих их 9 тонких фибрилл. В теле спермия параллельно тонким фибриллам расположено наружное кольцо из 9 грубых фибрилл. В хвосте грубые фибриллы отсут- ствуют. Конец хвоста свободен от оболочки. 15 4. Зарисовать спермии (рис. 1). Рис. 1. Анатомическое строение спермия. Задание 2. Ознакомиться с органолептическими показате- лями спермы здоровых производителей разных видов животных. Объем эякулята определяют по делениям цилиндра или мен- зурки, в которые переливают эякулят. Предварительно их про- гревают до 25-30 0 С. Объем эякулята быка и барана можно определить также при помощи теплой стерильной пипетки или шприца. Для определения объема эякулята жеребца и хряка получен- ную сперму процеживают через сложенную вдвое или вчетверо стерильную марлевую салфетку. На марле остается густой, тягу- чий секрет пузырьковидных желез. Его объем учитывают от- дельно. Так как этот секрет снижает жизнеспособность спермиев при хранении, затрудняет работу со спермой и при искусствен- ном осеменении не нужен, его выбрасывают. У производителей одного вида животных и даже у одного и того же самца объем эякулята подвержен колебаниям, связанным с условиями кормления, содержания и режима полового исполь- зования. 16 Таблица 3 Объем эякулята производителей разных видов сельскохозяйственных животных Объем эякулята (мл) Вид животного минимальный средний максимальный Баран 0,6 1,0-1,5 3-4 Бык 2 4-6 10-15 Жеребец 40-50 60-80 200-300 Хряк 150 250-400 600-1000 Цвет спермы характерен для производителей каждого вида сельскохозяйственных животных и зависит главным образом от насыщенности спермы сперматозоидами. В норме сперма быка белая, иногда желтоватая; сперма ба- рана белая с желтоватым оттенком; сперма жеребца и хряка се- ровато-белая (наподобие цвета молока, сильно разбавленного во- дой). Изменение цвета спермы свидетельствует о наличии в ней примесей, снижающих ее качество. Розовый или красноватый цвет эякулята (примесь крови) свидетельствует о наличии свежей травмы половых органов самца. При давней травме эякулят име- ет буро-красный цвет. Иногда у производителей во время эрекции могут происхо- дить разрывы мелких капилляров уретрального канала, сперма при этом окрашивается свежей кровью в темно-красный цвет. Зеленоватый цвет спермы указывает на наличие в ней гноя. Интенсивно желтый цвет бывает при попадании в эякулят мочи. Запах спермы. Обычно сперма не имеет особого, специфи- ческого запаха. У быка она иногда может пахнуть парным моло- ком, у барана – жиропотом. Наличие несвойственного запаха (гнилостного) указывает на какой-либо патологический процесс в половых органах самцов, запах аммиака – на попадание мочи в сперму. 17 Консистенция. Нормальная консистенция спермы быка – сливкообразная, барана – сметанообразная, жеребца – водяни- стая, часто с примесью слизи, хряка – водянистая со студянисто- клейкими зернами (секрет куперовых желез). При воспалении пузырьковидных желез в сперме бывают хлопья. Если внешние признаки эякулята значительно отклоняются от нормальных показателей, такую сперму не используют. Задание 3. Записать порядок визуальной оценки спермы по ее активности. 1. Температура воздуха в помещении: 2. Температура в столике Морозова: 3. Кратность увеличения микроскопа: 4. Яркость освещения поля зрения: Задание 4. Описать виды движения спермиев. 1. Прямолинейное поступательное. 2. Манежное. 18 3. Колебательное. 4. Отсутствие движения. Оценку спермы по подвижности спермиев проводят по де- сятибалльной системе. Оценка спермы в баллах отражает про- цент подвижных спермиев. Наивысшую оценку – 10 баллов дают сперме в том случае, если все спермии обладают поступательным движением; при оценке 9 баллов 9 спермиев из 10 обладают прямолинейно- поступательным движением, при оценке 6 баллов – 6 из 10 и так далее. Для искусственного осеменения используют свежеполучен- ную и сохраненную при 0 0 С сперму производителей с подвижно- стью в баллах: баран - 10-8 бык - 10-8 жеребец - 10-6 хряк - 10-7 Сперма быка, хранившаяся при температуре –196 0 С в жид- ком азоте, должна иметь активность не ниже 3 баллов. 19 Задание 5. Изучить порядок оценки концентрации спермиев (по густоте под микроскопом). Описать сперму разной густоты. На рис. 2 отразить различия спермы разной густоты. 1. Густая 2. Средняя 3. Редкая 4. Олигоспермия 5. Аспермия 20 а) б) в) Рис. 2. Сперма быка: а) – густая; б) – средняя; в) – редкая. 21 Задание 6. Оценить представленный эякулят по внешним признакам. Сделать заключение о качестве и целесообразности дальнейшего использования спермы. Тема 4. Определение концентрации спермиев в счетных камерах Приборы и материалы. Микроскоп, счетная камера Горяева, предметные и покровные стекла, лейкоцитарный и эритроцитарный меланжеры, стеклянные палочки, 3%-ный раствор хлористого натрия, 96%-ный спирт, дистиллирован- ная вода, салфетки. Густота спермы, определяемая при глазомерной микроско- пической оценке, дает приблизительное представление о количе- стве спермиев в 1 мл эякулята. Это субъективная оценка, ошибка может достигать 25-30%. Для установления рациональной степени разбавления и оп- тимальной дозы спермы при осеменении самок необходимо знать действительное количество спермиев в эякуляте (объективная оценка). Для этого определяют концентрацию спермы, т.е. коли- чество спермиев (миллиардов) в 1 см 3 22 Концентрация спермы подвержена значительным колебани- ям в зависимости от кормления, условий содержания и эксплуа- тации производителей. В среднем концентрация спермиев в 1 мл спермы производителей сельскохозяйственных животных со- ставляет: барана - 1 млрд. быка - 2-3 млрд. жеребца - 100-150 млн. хряка - 100-200 млн. К разбавлению в искусственных средах допускается сперма с минимальной концентрацией спермиев: барана - 1,0 млрд. быка - 0,7 млрд. жеребца - 0,15 млрд. хряка - 0,1 млрд. Спермии подсчитывают в счетной камере, применяемой для определения числа форменных элементов крови (с сеткой Горяе- ва, Томма или Бюркера). Порядок работы 1. Подготовка счетной камеры. Камеру и покровное стекло предварительно моют и обезжиривают спиртом. Затем сетку счетной камеры накрывают покровным стеклом и притирают его к опорным пластинам камеры до появления радужных колец. 2. Разбавление спермы. При работе со свежеполученной спермой быка используют эритроцитарный меланжер. Верхний конец меланжера соединяют с резиновой трубочкой. Через нее в меланжер набирают сперму до метки 1,0. С конца меланжера салфеткой снимают каплю спермы, а затем набирают до верхней метки (101) 3%-ный раствор хлористого натрия (т.о. проводят разбавление в 100 раз). Разбавленную сперму исследуют с помощью лейкоцитарно- го меланжера. Сперму набирают до метки 1,0, затем разбавляют 3%-ным раствором хлористого натрия до метки 11, т.е. в 10 раз. Зажимают пальцами оба конца смесителя и встряхивают в течение 2-3 минут до полного смешения спермы с раствором. 23 3. Зарядка счетной камеры. Счетную камеру заряжают раз- бавленной спермой сразу же после перемешивания. Задержка может привести к грубым ошибкам при подсчете, так как спер- матозоиды быстро оседают. Первые 2-3 капли из меланжера выпускают, чтобы удалить раствор из капилляра, где он почти не смешивается со спермой. Следующую каплю пускают под край притертого стекла. Капля вследствие капиллярности втягивается под покровное стекло на сетку, и смесь равномерно распределяется в камере. Неправильно заряженной камеру считают в том случае, если там оказались пу- зырьки воздуха. 4. Подсчет спермиев. Заряженную камеру кладут на столик микроскопа в строго горизонтальном положении. Сначала оты- скивают сетку под малым (120 раз) увеличением, затем перево- дят на большое (300-600 раз). В поле зрения должен помещаться один большой квадрат сетки. Подождав 2-3 минуты, пока сперматозоиды осядут, присту- пают к их подсчету. Спермии подсчитывают в 5 больших квадра- тах (80 малых) по диагонали. Считают головки спермиев внутри малых квадратов, а также на левых и верхних линиях. 5. Вычисление концентрации спермиев. Результаты подсче- та суммируют. Концентрацию определяют по формуле: K = (n * D * 400 * 1000) / (80 * 0,1), где K – концентрация спермиев (млрд.) в 1 мл спермы; n – количество спермиев, подсчитанных в 80 малых (5 больших) квадратах; D – степень разбавления спермы. Цифры – постоянные величины: 400 – число малых квадра- тов на площади в 1 мм 2 , 1000 – число перевода на миллилитр (мл); 80 – количество малых квадратов; 0,1 – глубина камеры (мм). Для более точного определения концентрации спермиев подсчет следует вести в обеих сетках камеры Горяева и при вы- числении брать средний показатель. Расхождение результатов не должно быть более 10%. Если разница превышает 10%, подсчет 24 спермиев повторяют третий раз и берут среднее из двух подсче- тов, расходящихся не более чем на 10%. Задание_1'>Задание 1. Оценить сперму по внешним признакам. Дать заключение о пригодности ее для дальнейшего использования при искусственном осеменении. Задание 2. Определить концентрацию спермы в счетной камере Горяева. Результаты подсчетов записать в соответствую- щие клетки квадратов. Сетка № 1 1 2 3 4 5 25 Сетка № 2 1 2 3 4 5 Задание 3. Сравнить результаты, полученные при выполне- нии заданий 1 и 2. Сделать заключение о целесообразности даль- нейшего использования представленного эякулята. 26 Тема 5. Определение резистентности спермиев Приборы и материалы. Микроскоп, предметные и покровные стекла, мик- ропипетка на 0,02 мл, градуированные пипетки на 1 и 10 мл, комплект из 2 фла- конов на 20 мл каждый, стеклянные палочки, 1%-ный раствор химически чис- того хлористого натрия, салфетки. Спермии в процессе спермиогенеза в извитых канальцах се- менников приобретают сравнительно плотную клеточную обо- лочку, представляющую по химическому составу сложное бел- ковое образование и придающую мужским половым клеткам оп- ределенную постоянную форму. Проходя по длинному (40-70 м) каналу придатка семенника, спермии покрываются липоидной оболочкой. Она выполняет за- щитные функции, предохраняя сперматозоиды от неблагоприят- ного воздействия факторов внешней среды, а также придает спермиям отрицательные одноименные электрические заряды. Чем устойчивее эта оболочка, тем более жизнеспособны спер- мии, тем лучшего качества сперма, выше ее оплодотворяющая способность. Определение резистентности спермиев к многократному разбавлению проводится по методу Смирнова – Поставной. Порядок работы Работу проводят при температуре 18-22 0 С. Во флакон № 1 микропипеткой вносят 0,02 мл испытуемой спермы и малыми порциями добавляют 10 мл 1%-ного раствора хлористого натрия, перемешивая смесь круговыми движениями флакона. Остатки спермы из канала микропипетки смывают во флакон. Стеклянной палочкой каплю смеси наносят на предмет- ное стекло и исследуют на активность спермиев под малым уве- личением микроскопа без покровного стекла. Если спермии неподвижны, то резистентность менее 500 (10 мл : 0,02 мл = 500). При наличии спермиев с поступательным движением 0,5 мл смеси из флакона №1 переносят во флакон № 2 и доливают 0,5 мл 1%-ного раствора хлористого натрия. Каплю исследуют на 27 активность спермиев. Если спермии мертвые, резистентность не более 1000. Если спермии двигаются поступательно, во флакон № 2 на- ливают еще 1 мл раствора хлористого натрия. При добавлении каждой новой порции раствора резистентность увеличивается на 1000. Добавление раствора проводят до тех пор, пока не прекра- тится поступательное движение спермиев. Считается пригодной для осеменения животных сперма бы- ка и барана с резистентностью спермиев не менее 10-40 тысяч. Задание. Определить резистентность спермиев быка. Сде- лать вывод о пригодности спермы для осеменения коров. Тема 6. Оценка спермы по интенсивности дыхания Приборы и материалы. Микроскоп, стеклянная трубка диаметром 0,8-1,0 мм (можно использовать трубку от шприца-катетера), предметные стекла, 2 глазные пипетки, стеклянные палочки, песочные часы, 0,01%-ный раствор ме- тиленовой синьки, белая бумага, салфетки. Активность спермы оценивают по скорости обесцвечивания (восстановления) метиленовой синьки, смешанной со спермой (методика Н.П.Шергина). При дыхании спермии потребляют кислород, растворенный в смеси, в результате этого синька обесцвечивается. Интенсив- ность дыхания зависит от концентрации и активности спермиев. Спермии, способные к прямолинейно-поступательному движе- нию, имеют более высокую активность жизненных процессов и дыхания. Следовательно, чем выше концентрация спермиев и чем большее их количество способно к прямолинейно- поступательному движению, тем быстрее расходуется кислород, 28 скорее происходит обесцвечивание метиленовой синьки и, соот- ветственно, выше качество спермы. Оценку качества свежеполученной спермы по скорости обесцвечивания метиленовой синьки проводят при температуре 18-22 0 С, т.к. понижение температуры замедляет интенсивность энергетических процессов и дыхания спермиев. При снижении температуры на 10 0 С интенсивность дыхания уменьшается при- мерно вдвое, а при 0 0 С почти прекращается. Приготовление 0,01%-ного раствора метиленовой синьки. 0,5 г синьки растворяют в 200 мл 1%-ного раствора хлористого натрия и настаивают три дня. Затем готовят рабочий раствор: к 1 части раствора синьки добавляют 9 частей 1%-ного раствора хлористого натрия. Порядок работы На предметное стекло глазной пипеткой нанести по одной капле краски и спермы и быстро смешать их стеклянной палоч- кой. Смесь набрать в стеклянную трубочку, чтобы столбик ее был длиной около 2 см. Трубку положить на лист белой бумаги и наблюдать за обесцвечиванием синьки. Обычно она обесцвечи- вается в середине столбика. На концах столбика могут оставаться голубые кольца, т.к. с концов смесь постоянно обогащается ки- слородом воздуха. О качестве спермы судят по показателям, приведенным в табл. 4. Таблица 4 Время обесцвечивания метиле- новой синьки (мин.) спермиями Качество спермы быка барана Хорошее 5-10 3-7 Среднее 11-30 8-12 Плохое (непригодное для ис- кусственного осеменения) более 30 более 12 Для оценки качества спермы жеребца и хряка этот метод не используется, поскольку обесцвечивание смеси метиленовой синьки со спермой затягивается до 60 минут. 29 Задание 1. Оценить качество спермы быка по времени обес- цвечивания. Сделать вывод о пригодности ее для искусственного осеменения. Задание 2. Визуально оценить сперму быка по густоте и ак- тивности. По результатам заданий 1 и 2 сделать вывод о целесо- образности ее использования. Тема 7. Определение процента живых спермиев Приборы и материалы. Микроскоп, обезжиренные предметные стекла, шлифованные покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки, раствор эозина, 96%-ный спирт, салфетки. Оболочка спермиев, у которых энергично протекают обмен- ные процессы, не пропускает в протоплазму лабораторные крас- ки, поэтому живые спермии не окрашиваются. Мертвые и ослаб- ленные с колебательным движением спермии легко пропускают краску внутрь и, следовательно, окрашиваются этой краской. 30 Наличие в сперме мертвых и патологически измененных спермиев снижает качество спермы. Наличие в сперме патологических (уродливых) форм спер- миев выше допустимого называется тератоспермией. Выделяют две группы патологических форм спермиев: 1) с изменением ве- личины и формы головки – гигантские, карликовые, двухголо- вые, с круглой, грушевидной головкой и др.; 2) с изменениями формы хвоста. Можно также обнаружить спермии с утолщением в области шейки, тела и хвоста в виде протоплазматической кап- ли (незрелые сперматозоиды). Способы подготовки обезжиренных стекол. 1. Чистые стек- ла выдерживают в смеси спирта и эфира (соотношение 1:1) в те- чение суток. Затем извлекают и протирают насухо. 2. После тщательного мытья в растворе детергента предмет- ные стекла промывают в дистиллированной воде, протирают, за- ворачивают в бумагу и выдерживают в сушильном шкафу не ме- нее 30 минут. 3. Полевой способ. На холодную поверхность электроплиты помещают в один слой чистые стекла. После того как стекла рас- калятся, плиту выключают. Дают стеклам остыть. Рецепт краски. В 100 мл дистиллированной воды растворя- ют 1,7 г эозина и 3 г цитрата натрия. Порядок работы На обезжиренное предметное стекло нанести 1 каплю семе- ни и 1-2 капли краски эозина. Капли смешать и ребром шлифо- ванного стекла сделать тонкий ровный мазок. Он должен быстро высохнуть на воздухе. Активные спермии, сохранившие избира- тельную способность мембран, отталкивают краску и не окраши- ваются, неактивные окрашиваются в красный или розовый цвет. Просмотреть мазок под микроскопом. В каждом поле зрения следует подсчитать количество нормальных и патологических, или живых и мертвых, спермиев. Рекомендуется подсчитать не менее 500 спермиев. Вычисляют процент неактивных спермиев, он не должен превышать у барана – 14, быка – 18, у жеребца и хряка – 20. 31 Задание 1. Просмотреть препарат под микроскопом при увеличении 300-600 раз и зарисовать в тетрадь одно поле зрения (рис. 3). Отметить эозинотрицательные (активные, живые) и эо- зинположительные (неактивные, мертвые) спермии. Рис. 3. Активные и неактивные спермии при увеличении в 300-600 раз. Задание 2. Подсчитать количество окрашенных и неокра- шенных спермиев, результаты занести в табл. 5. Сделать вывод о пригодности спермы для искусственного осеменения. Таблица 5 Поля зрения Цвет спермиев 1 2 3 4 5 6 7 8 Все- го Белый Розовый Всего 32 Тема 8. Влияние на спермии физических и химических факторов Приборы и материалы. Микроскоп, обогревательный столик Морозова, предметные и покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки, чашка со льдом или снегом, горячая вода; 1%- и 3%-ные растворы хлористого натрия, дистил- лированная вода, 1-2%-ный раствор бикарбоната натрия, 2,8-3,0%-ный раствор цитрата натрия, 1-2%-ный раствор уксусной кислоты, 10%-ные растворы сер- ной кислоты и едкого натра, раствор марганцовокислого калия (1:5000), раствор фурацилина (1:5000), 70%-ный спирт, 5%-ный спиртовой раствор йода; салфет- ки. С момента получения спермы спермии, находясь вне орга- низма производителя, подвергаются воздействию ряда факторов окружающей среды. Семенная плазма, представляющая в основ- ном совокупность секретов придаточных половых желез, дейст- вием растворенных в ней веществ активизирует спермии и со- кращает их жизнь. Кроме того, при разбавлении и хранении спермы на спермии влияют такие факторы, как свет, температу- ра, осмотическое давление, различные химические вещества, ко- торые при определенных условиях могут способствовать удли- нению их жизни вне организма самца или, наоборот, оказывать на них губительное действие. 1. Влияние осмотического давления Осмос – диффузия растворенных веществ через проницае- мую оболочку, разделяющую раствор и чистый растворитель или два раствора разной концентрации. Давление растворенного ве- щества называется осмотическим и исчисляется в атмосферах. Сперма животных имеет постоянное осмотическое давление (7 атмосфер), причем осмотическое давление сыворотки спермы и протоплазмы спермиев примерно одинаковое. В том случае, когда осмотическое давление раствора равно осмотическому давлению спермиев, он является изотоническим. Гипотониче- ский и гипертонический растворы губительно влияют на спер- мии. 33 Порядок работы Приготовить три раздавленных капли спермы, определить активность спермиев. Под покровное стекло внести каплю дис- тиллированной воды, 1%-ного или 3%-ного раствора хлористого натрия. Сперму просмотреть под микроскопом при большом увеличении. При внесении в сперму дистиллированной воды происходит быстрая гибель спермиев вследствие их гидратации (набухания головки), у части спермиев закручиваются хвосты. Под влиянием 3%-ного раствора хлористого натрия спермии погибают через 1-2 минуты вследствие обезвоживания. Головки спермиев сморщи- ваются, уменьшаются в размерах. 1%-ный раствор хлористого натрия изотоничен по отношению к спермиям. Задание. Провести исследование влияния осмотического давления на жизнеспособность спермиев. Записать наблюдения, сделать выводы. 34 2. Влияние температуры Температура является важнейшим условием, определяющим жизнеспособность спермиев вне организма. При повышении температуры все жизненные процессы в них усиливаются, при понижении – замедляются. Порядок работы Приготовить две раздавленных капли спермы, определить активность спермиев. Сперму просматривать под микроскопом при малом увели- чении. Одно предметное стекло нагреть до 50-55 0 С. Вначале отме- чается усиление активности спермиев, затем наступает их гибель. Предметное стекло с другой раздавленной каплей поместить на 1-2 минуты на лед и, протерев нижнюю часть стекла салфет- кой, просмотреть под микроскопом. Затем подогреть предметное стекло до 40 0 С на обогревательном столике. В первом случае все спермии будут неподвижны, при повышении температуры часть спермиев восстанавливает подвижность, остальные – мертвые. Задание. Провести исследование влияния температуры ок- ружающей среды на жизнеспособность спермиев. Записать на- блюдения, сделать выводы. 35 3. Влияние химических веществ Сперма чрезвычайно чувствительна к различным химиче- ским веществам. Даже следы мыла на руках или посуде губи- тельно действуют на спермии. Поэтому следует тщательно про- поласкивать дистиллированной водой посуду и инструменты по- сле мойки и дезинфекции. В помещении пункта искусственного осеменения запрещается хранить медикаменты и дезинфици- рующие вещества, а также курить. Порядок работы После оценки активности выявляют влияние различных хи- мических веществ на спермии. Для этого каждый раз на чистое предметное стекло наносят новую каплю спермы и действуют на нее тем или иным испытуемым раствором. Капли перемешивают, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроско- пом при малом увеличении. Устанавливают время, через которое прекращается движение спермиев. Для изучения влияния йода вокруг капли спермы нанести настойку в виде кольца и, не по- крывая покровным стеклом, просматривать под микроскопом. При внесении в сперму 70%-ного спирта, 10%-ных раство- ров кислоты и щелочи, марганцовокислого калия, фурацилина наступает гибель сперматозоидов через 1-2 минуты. Раствор ки- слоты малой концентрации вызывает замедление движения спермиев (кислотный анабиоз). При слабо щелочной реакции среды активность спермиев повышается. Из настойки йода улетучивается свободный йод, который вызывает быструю гибель спермиев. Проникновение и накопле- ние йода в сперме подтверждается пожелтением капли. При работе со спермой в лабораториях станций и пунктов искусственного осеменения необходимо соблюдать условия, обеспечивающие длительный срок хранения спермы с сохране- нием оплодотворяющей способности спермиев. 36 Задание. Провести исследование влияния различных хими- ческих веществ и их концентрации на жизнеспособность сперми- ев. Записать наблюдения, сделать выводы. 37 Тема 9. Исследование глубокозамороженного семени Приборы и материалы. Сосуд Дьюара с замороженной спермой, микро- скоп, обогревательный столик Морозова, водяная баня с термометром, корн- цанг, пинцет, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, ампулы с 2,8-3,0%-ным цитратом натрия, 70%-ный спирт, салфетки. Техника безопасности при работе с жидким азотом Жидкий азот – прозрачная, бесцветная, легкоиспаряющаяся жидкость. Массовая плотность его 0,804 кг/л при давлении 760 мм ртутного столба. В обычных условиях химически инертен. Производят его путем сжижения газообразного азота. Доставляют жидкий азот до потребителей с заводов- поставщиков транспортными цистернами различной емкости, ус- тановленными на соответствующих автомобилях. Замороженную в жидком азоте сперму производителей за- кладывают на длительное хранение в сосуды Дьюара емкостью 50 л и стационарные биохранилища на 200-500 л. Транспортировку замороженной спермы на пункты искусст- венного осеменения и хранение ее там осуществляют в сосудах Дьюара емкостью 5, 20 и 30 л. При попадании на открытые участки тела жидкий азот вы- зывает ожоги, при испарении большой массы жидкого азота из- за снижения концентрации кислорода в воздухе возможны го- ловокружение, обморок или удушье, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать правила безопасности. 1. Общие правила при работе с жидким азотом: тщательная защита лица, глаз, рук; одежда, полностью закрывающая кожный покров тела; вентиляция помещения. 2. Особую осторожность следует соблюдать при оттаивании глубокозамороженной спермы в соломинках и облицованных гранулах, т.к. при плохой герметизации проникший внутрь жид- кий азот при оттаивании быстро испаряется, увеличивает давле- ние и разрывает оболочку. 3. Для извлечения из сосудов Дьюара замороженной спермы следует использовать предварительно охлажденные инструмен- 38 ты, чтобы предотвратить бурное кипение и разбрызгивание жид- кого азота. Не следует заглядывать в сосуд Дьюара с целью оп- ределения уровня жидкости в нем, для этого используют специ- альную линейку. При длительном хранении в жидком азоте на станциях и племпредприятиях сперму замораживают до температуры –196 0 С в однодозовых стеклянных или пластмассовых ампулах, облицо- ванных и необлицованных гранулах, соломинках (пайеттах). Этот способ позволяет хранить сперму многие месяцы и да- же годы. Однако для этого требуется строгое соблюдение сле- дующих правил: 1) не допускается преждевременное оттаивание спермы и повторное ее замораживание. Даже кратковременное повышение температуры до –125 0 С, например, при перекладывании ампул со спермой из стационарного хранилища в транспортный сосуд Дьюара или из одного сосуда в другой, вредно отражается на ка- честве спермы. Поэтому до использования сперму постоянно хранят в жидком азоте. Нарушение этого правила приводит к ги- бели спермиев и снижению качества спермы; 2) перед использованием спермы оператор в защитных оч- ках и в перчатках извлекает ампулу (гранулу или соломинку) из сосуда Дьюара и производит оттаивание, предварительно подго- товив все необходимые для этой работы инструменты и оборудо- вание. Оттаивание спермы в гранулах. Гранулы бывают трех ви- дов: 1) необлицованные гранулы малого объема, 0,1-0,2 мл (с вы- сокой концентрацией спермиев и с разбавлением дозы изотони- ческими растворами перед осеменением); 2) необлицованные гранулы большого объема, 0,5-1,0 мл (со средней концентрацией спермиев, разбавления дозы не требуется); 3) гранулы, облицо- ванные в полимерную оболочку (объем 0,25-0,33 мл). 39 Порядок работы 1. Для оттаивания гранул объемом 0,1-0,2 мл одну-две ам- пулы с раствором цитрата натрия поместить на 1-2 минуты в во- дяную баню с температурой 38-40 0 С. 2. К горловине сосуда Дьюара быстро подтянуть канистру или марлевый мешочек с гранулами. Стерильным и охлажден- ным в жидком азоте пинцетом извлечь нужное количество гра- нул и опустить их в подготовленные ампулы с раствором цитрата натрия. 3. Оттаивать гранулы спермы в течение 8-10 с до полного превращения их в жидкое состояние. После этого ампулы со спермой сразу же вынуть из водяной бани, не допуская дальней- шего нагревания спермы. Одновременно при размораживании быстро опустить канистру, закрыть сосуд крышкой. 4. Ампулы вытереть насухо салфеткой и поставить в штатив, где сперма постепенно приобретает температуру 18-25 0 С. 5. Набрать сперму в инструмент. Сделать мазок, оценить ка- чество спермы. Замороженную сперму быка используют после оттаивания при активности спермиев не ниже 3 баллов. В дозе спермы для осеменения коров и телок должно быть не менее 10- 12 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением (при всех способах хранения). Задание. Разморозить дозу спермы. Оценить ее качество (активность, густота, концентрация). Сделать выводы о пригод- ности спермы для осеменения. 40 Тема 10. Учет и отчетность в искусственном осеменении Учет и отчетность должны быть простыми, краткими, но точно отражающими всю производственную деятельность и дающими возможность оперативно контролировать работу пунк- тов искусственного осеменения сельскохозяйственных живот- ных. Задание 1. Ознакомиться с документами учета и отчетно- сти, применяемыми на пунктах искусственного осеменения для учета работы по воспроизводству стада на сельскохозяйственных предприятиях. Обратить внимание на назначение и срок состав- ления каждого документа, какие показатели учитываются и кто ведет записи. 1. Ордер на отправку спермы производителя (форма №3-ио). 2. Информация о ходе искусственного осеменения. 41 3. Отчет об использовании замороженного семени. 4. Акт ректального исследования на стельность (форма №8- ио) с приложением (список коров и телок, прошедших ректаль- ное исследование по результатам искусственного осеменения). 5. Журнал искусственного осеменения, запуска и отелов ко- ров и осемененных телок (форма №10-мол). 42 Задание 2. Изучить методы контроля воспроизводства стада (расчет продолжительности межотельного периода и сервис- периода, выхода телят, яловости коров). 43 Тема 11. Организация работы по получению, разбавлению и замораживанию спермы быков на племпредприятии «Карельское» Во время экскурсии на племпредприятие «Карельское» оз- накомиться: 1) с организацией содержания и кормления быков- производителей; 2) с техникой взятия спермы; 3) с технологией разбавления, замораживания и хранения спермы в неблицованных гранулах; 4) с документами учета количества и качества спермы, хранящейся на племпредприятии. 44 Учебное издание Биотехника размножения Рабочая тетрадь с методическими указаниями для лабораторно-практических занятий по курсу «Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных» для студентов 4 курса специальности 3107 «Зоотехния» Составители: Комлык Ирина Петровна Сиротинина Валерия Юрьевна Редактор Т.Н.Музалева Компьютерная верстка И.П.Комлык ЛР ИД № 02969 от 06.10 2000 Гигиенический сертификат № 10.КЦ. 34.953.П.00136.03.99 от 05.03.99. Подписано в печать 03.07.02. Формат 60х84 1 / 16 Бумага газетная. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,8. Усл. кр.-отт. 13. Тираж 200 экз. Изд. № 119. Петрозаводский государственный университет Типография Издательства Петрозаводского государственного университета 185640, Петрозаводск, пр. Ленина, 33 |