Курсовая (Преображенская). Челябинский государственный университет
 Скачать 68.44 Kb.
|
|
2.6. Белок Ki-67 В настоящее время известно несколько ядерных и мембранных антигенов, изменение экспрессии которых связано с пролиферативной активностью клеток. Одним из наиболее изученных молекулярных биомаркеров является показатель пролиферативной активности Ki-67, антитела к антигену которого реагируют с пролиферирующими клетками, находящимися в G1, S, M, G2 стадиях клеточного цикла. Если клетка не пролиферирует, такого взаимодействия не происходит. На протяжении большей части интерфазы Ki-67 локализован в ядрышке. В начале периода G1, Ki-67 антиген обнаружен в большом количестве дискретных очагов во всей нуклеоплазме, распространяясь на ядерную оболочку. В S- и G2-периодах антиген находится в ядрышке. С помощью двойной непрямой иммунофлюоресценции было показано, что в начале-середине G1-периода Ki-67 связан с реформированием ядрышек в дискретных доменах, которые отличаются от доменов, содержащих фибрилларин и РНК-полимеразы I. В онкологии изучение негистонового протеина Ki-67 (маркера пролиферации), экспрессирующегося во всех клетках, вышедших из G0-фазы, представляется актуальным и позволяет определить именно "скрытый" пролиферативный потенциал опухоли и судить о степени злокачественности, а также разделить пациентов на группы с относительно благоприятным и неблагоприятным прогнозом. Пролиферативную активность опухоли оценивают как процент Ki-67-положительных клеток от общего числа опухолевых клеток. При прогрессировании опухоли выявляется тенденция к усилению экспрессии Ki-67. 3. Нарушения регуляции клеточного цикла и канцерогенез Нарушение нормальной регуляции клеточного цикла является причиной появления большинства твердых опухолей. В клеточном цикле прохождение контрольных пунктов возможно только в случае нормального завершения предыдущих этапов и отсутствия поломок. Для опухолевых клеток характерны изменения компонентов сверочных точек клеточного цикла. При инактивации сверочных точек клеточного цикла наблюдается дисфункция некоторых опухолевых супрессоров и протоонкогенов. В основе образования опухоли лежит избыточное размножение определенных клеток. Совершенно естественно поэтому, что нарушения регуляции клеточного цикла являются неотъемлемым и основополагающим признаком неопластической клетки. "Мотором" клеточного цикла, как известно, служат активности последовательно сменяющих друг друга циклинзависимых киназ. Регуляция активности циклинзависимых киназ осуществляется за счет направленного изменения уровня определенных циклинов в определенные фазы клеточного цикла. Кроме того, активность Сdk регулируется изменениями фосфорилирования их определенных аминокислотных остатков. В активной форме комплексы циклин-Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие протекание данной фазы. Большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров тем или иным образом регулируют активность циклинзависимых киназ, ответственных за вход в S-фазу клеточного цикла. Продукты некоторых из клеточных (Mdm2) или вирусных (Т-антиген вируса SV40, E1A аденовирусов, E7 HPV и др.) онкогенов связывают и инактивируют основной субстрат таких Cdk - pRb. Нарушения в сигнальных путях Cdk2,4/6 - pRb - E2F/DP являются необходимыми для появления постоянно пролиферирующих неопластических клеток. Нарушение регуляции клеточного цикла - это способ подстегнуть клетку к нерегулируемому размножению. Раковые клетки могут производить избыточные количества циклина D и циклина Е, в них могут отсутствовать такие ключевые регуляторы клеточного цикла, как р53 или р16. Белок p53 является одним из факторов транскрипции, который инициирует синтез белка p21, являющегося ингибитором комплекса CDK-циклин, что приводит к остановке клеточного цикла в G1 и G2 периоде. Таким образом клетка, у которой повреждена ДНК, не вступает в S-фазу. При мутациях, приводящих к потере генов белка p53, или при их изменениях, блокады клеточного цикла не происходит, клетки вступают в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, большая часть из которых нежизнеспособна, другая — дает начало злокачественным клеткам. 4. Клеточный цикл и ионизирующее излучение В случае возникновения нарушений, вызванными различными экзогенными факторами (в том числе и радиацией) клетка приостанавливает продвижение по клеточному циклу. Иногда – на некоторое время, если последствия воздействий среды окажутся обратимыми. Иногда – навсегда, если последствия окажутся необратимыми. Облучение клеток в очень высоких дозах (несколько десятков грей) может вызвать мгновенное прекращение метаболизма и разрушение клетки. Этот тип гибели, часто называемый "немитотической" или "интерфазной" гибелью, наблюдается в неделящихся или редко делящихся клетках, таких, например, как клетки печени взрослых животных, почек, мышечной и нервной ткани. Однако облучение в гораздо более низких дозах также может привести к гибели клеток подавлением способности к делению. Этот вид клеточной гибели, которую можно определить как потерю клеткой способности к неограниченному размножению, назывеют "репродуктивной гибелью". Клетки, способные к ограниченному делению после облучения, дающие стерильное потомство, считаются погибшими, несмотря на то, что с морфологической, физиологической и биохимической точек зрения они кажутся нормальными. Таким образом, термин "репродуктивная гибель" относится как к клеткам делящимся, но постепенно деградирующим после облучения в умеренных дозах, так и к клеткам, полностью утратившим репродуктивную способность. После воздействия ионизирующего излучения происходят двунитевые разрывы ДНК. Если происходит репарация ДНК, то клеточный цикл восстанавливается, если нет - происходит гибель клетки путем апоптоза или развивается мутантный клон. Клеточный цикл при воздействии радиации может быть блокирован в двух критических точках-перехода из G1 в S и/или из G2 в М фазу. Существуют различные методы определения гибели клеток ин витро при облучении. Например, по методу Пака популяция одиночных клеток высеивается в чашку Петри. После облучения в разных дозах определяют способность каждой клетки к делению и образованию макроколоний. Если клетка образует макроколонию, она считается выжившей, если нет — погибшей. Обычно клетки, используемые для таких экспериментов, случайно распределены по клеточному циклу. В отличие от такого случайного распределения клеток по стадиям клеточного цикла можно получить популяции, в которых все клетки делятся синхронно и проходят клеточный цикл с одинаковой скоростью. Цель экспериментов — выяснение зависимости чувствительности клеток от стадии клеточного цикла, в которой они находились во время облучения (например, в митозе, синтезе ДНК и т. д.). Такие опыты возможны только в условиях ин витро, так как большинство клеточных популяций ин виво делится асинхронно. Популяции клеток ин витро и ин виво имеют тенденцию к асинхронному делению, поскольку каждая клетка немного отличается от соседней по скорости, с которой она проходит клеточный цикл. В условиях ин витро существует несколько способов накопления клеток в одной определенной фазе клеточного цикла и наблюдения за синхронным прохождением фаз. Строгая синхронность сохраняется лишь у одной или двух генераций клеток (один или два цикла деления), и затем индивидуальные различия между клетками приводят к постепенной ее потере. Первый эксперимент по определению зависимости радиочувствительности клеток от фазы клеточного цикла проведен в 1963 г. на линии раковых клеток человека, известных как клетки Не1_а. В этих опытах клетки, находящиеся в определенной фазе клеточного цикла, облучали однократно в дозе 3 Гр. Было установлено, что гибель клеток, вызванная облучением, существенно зависит от фазы, в которой клетки облучали. Клетки в стадии митоза были наиболее чувствительными, а клетки в начале G1-фазы, поздних частях S-фазы и G2 были наиболее резистентными. Клетки в начале S-фазы имели промежуточную чувствительность. Термин чекпойнт клеточного цикла (или сверочные точки) обозначает механизмы, способные останавливать клеточный цикл в определенных точках в ответ на различные повреждения. Эти системы достаточно консервативны в эволюции (основные принципы одинаковы, как у млекопитающих, так и у низших эукариот, дрожжей), что отражает их важность не только для конкретной особи, но и для популяции в целом. Чекпойнты можно представить себе как многоуровневые системы, на «верхних этажах» которых происходит контроль повреждений, в то время как «нижние этажи» ответственны за остановку клеточного цикла при их возникновении. Существуют различные чекпойнты, которые контролируют процессы репликации ДНК, сегрегации хромосом, следят за повреждениями ДНК, концентрацией кислорода в клетке, выявляют гиперпролиферативные сигналы. Каждая из этих систем, состоит из множества белков, различных по структуре и биохимической функции. Наиболее хорошо изученной является система, активирующаяся при повреждении ДНК. По функциональному критерию компоненты этой системы можно разделить на 3 группы: сенсоры, датчики и эффекторы. Сенсорные белки находят поврежденные участки ДНК и передают информацию датчикам, которые, в свою очередь, распределяют ее по различным эффекторам. Эффекторы активируют различные системы ответа на повреждения ДНК: комплекс репарационных белков, механизмы остановки клеточного цикла в чекпойнтах, и т.д. 5. Проведение методики оценки задержки клеточного цикла лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии 5.1. Выделение лимфоцитов периферической крови человека на градиенте фиколл-урографин В стерильную центрифужную пробирку вносят 1 мл стерильного раствора фиколл-урографина. Кровь в шприце хорошо перемешивают и наслаивают по стенке 4 мл крови. Центрифугируют 25 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту при комнатной температуре. Аккуратно забирают кольцо лимфоцитов с частью плазмы и помещают в чистую стерильную пробирку. Проводят 3-кратную отмывку средой Хенкса (199). 5.2. Культивирование лимфоцитов периферической крови человека Приготовление культуральной среды: подписывают бакпечатки, вскрывают их. Вносят стерильным шприцом в каждую бакпечатку 4 мл среды RPMI, 0.5 мл эмбриональной телячьей сыворотки и 130 мкл ФГА наконечником. Аккуратно перемешивают. Выделенную клеточную суспензию хорошо перемешивают и равномерно разделяют на две части. Клеточную суспензию, предназначенную для оценки спонтанного уровня клеток, фиксируют не позднее 30 минут. Клеточную суспензию, предназначенную для оценки уровня клеток после стимуляции клеток к делению, инкубируют в бакпечатках 42 часа в термостате при температуре +37°C. 5.3. Анализ пролиферативной активности лимфоцитов с использованием набора Кi-67 Клеточную суспензию из бакпечаток переливают в чистые центрифужные пробирки, подписывают. Центрифугируют 7 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Добавляют 200-250 мл Cytofix/Cytoperm, перемешивают и инкубируют 15 минут при температуре +4°С. Центрифугируют 7 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Затем проводят 2-кратную отмывку раствором Perm/Wash. Добавляют 1000 мл охлажденного 70% спирта, хорошо перемешивая, и инкубируют на льду не менее 2 часов. Окраска Ki-67. Клеточную суспензию по окончании фиксации однократно отмывают раствором BSA или Perm/Wash. Затем снова добавляют 1 мл раствора BSA или Perm/Wash и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость сливают. Добавляют 100 мкл буфера BSA, перемешивают и переносят по 100 мкл клеточной суспензии в чистые пробирки для проточного цитометра. В первую пробирку добавляют 8 мкл изотипического негативного контроля, во вторую – 8 мкл анти-Ki-67. Инкубируют 40 минут при комнатной температуре в темноте. Затем проводят 2-кратную отмывку раствором BSA или Perm/Wash. Добавляют 450 мкл PI/RNase, инкубируют 30 минут при комнатной температуре в темноте. 5.4. Анализ проб на проточном цитометре Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации. Анализ проб проводят с учетом правил проточной цитометрии. Первая гистограмма (FSxSS) предназначена для выделения области лимфоцитов. Оно проводится по соотношению размера клеток (FS) и ее гранулярности (SS). Вторая гистограмма (Main) необходима для исключения дебриса (мусора). На третьей гистограмме выделяют область клеток, окрашенных ДНК-тропным красителем PI и красителем FITS, конъюгированным с антителами против белка Ki-67. Все клетки, попадающие в эту область, считаются как Ki-67-положительные. Заключение Ионизирующие излучение индуцируют комплекс цитогенетических, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека, в том числе изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидатной защиты, систем репарации и клеточного цикла. Одним из основных механизмов радиационной защиты клетки, направленных на предотвращение деления клеток с повреждениями ДНК, является блок клеточного цикла. В случае нарушения этого защитного механизма повреждения ДНК, возникающие при длительном облучении, могут проявляться в виде соматических мутаций, что в конечном счете, может привести к продукции пула дефектных, структурно и функционально неполноценных клеток . Исследование клеточного цикла у людей, подвергшихся низкоинтенсивному хроническому радиационному воздействию, позволяет оценить пролиферативную активность и клеточный цикл лимфоцитов периферической крови как модели гемопоэтической клетки красного костного мозга, в отдаленные сроки после радиационного воздействия. Особенно актуальна оценка данных параметров в период, когда большая часть облученных людей достигла пожилого возраста, когда происходит снижение адаптационных резервов, ослабление систем контроля клеточного цикла и репарации, а также спонтанное увеличение частоты соматических мутаций. Список использованной литературы Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология: Учебное пособие для студентов медицинских вузов. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – С. 405-412, 439-443 Коггл Дж. Биологические эффекты радиации. Пер.с англ. – М.: Энергоатомиздат, 1986. – С. 46, 57-58 Бондарева В.А., Шпонька И.С. Значение прогностических маркеров опухолевой прогрессии Ki-67 и р53 в опухолях молочной железы // Морфологiя. 2007. - Т. 1. - №1. - С. 40 Копнин Б.П. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. В кн: Канцерогенез. / Под ред ДГ Заридзе / Москва: Медицина, 2004. – С.125 –156. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 2000. – С.5-33. Антонеева И.И., Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника. Онкология. 2008. - Т. 10. - №2. - С. 235 Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Пролиферация и задержка клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз. Тезисы докладов IV международной конференции 9-11 ноября 2010 года, г. Челябинск, Россия Хлебникова А.Н., Селезнева Е.В., Бобров М.А. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 и структурного протеина клеточной адгезии Е-кадхерина при актиническом кератозе // Современные аспекты дерматовенерологии. Тезисы докладов II научно-практичесой конференции 2-3 декабря 2010 года, г. Москва, Россия Ian R. Kill. Localisation of the Ki-67 antigen within the nucleolus. Evidence for a fibrillarin-deficient region of the dense fibrillar component // Journal of Cell Science. 1996. – Р.1253 |