Курсовая (Преображенская). Челябинский государственный университет
 Скачать 68.44 Kb.
|
|
2. Регуляция клеточного цикла 2.1. Циклины и циклинзависимые киназы Клетки вступают в клеточный цикл и осуществляют синтез ДНК в ответ на внешние митогенные стимулы. Лимфокины (например, интерлейкины ), цитокины (в частности интерфероны ) и полипептидные факторы роста, взаимодействуя со своими рецепторами на поверхности клеток, индуцируют каскад реакций фосфорилирования внутриклеточных белков, сопровождающихся передачей сигнала от поверхности клеток к ядру и индукцией транскрипции соответствующих генов. Одними из первых активируются гены, кодирующие белки циклины , получившие свое название от того, что их внутриклеточная концентрация периодически изменяется по мере прохождения клеток через клеточный цикл, достигая максимума на его определенных стадиях. Циклины являются специфическими активаторами семейства циклин-зависимых протеинкиназ (CDK) ( CDK - cyclin-dependent kinases ) - ключевых участников индукции транскрипции генов, контролирующих клеточный цикл. Активация индивидуальной CDK происходит после ее взаимодействия со специфическим циклином, и образование этого комплекса становится возможным после достижения циклином критической концентрации. В ответ на уменьшение внутриклеточной концентрации конкретного циклина происходит обратимая инактивация соответствующей CDK. Некоторые CDK активируются более чем одним циклином. В этом случае группа циклинов, как бы передавая протеинкиназы друг другу, поддерживает их в активированном состоянии длительное время. Такие волны активации CDK возникают на протяжении G1- и S- фаз клеточного цикла. Каждый тип циклинов имеет гомологичный участок (150 аминокислотных остатков, называемый "циклиновый бокс". Этот участок отвечает за связывание с CDK. В семействе циклинов известны 14 белков. Циклины делят на два семейства: G1-циклины ( C , D и E ) и митотические циклины ( A и B ). Некоторые члены семейства составляют подсемейства. Например, подсемейство циклинов D-типа состоит из трех членов: D1, D2 и D3. Циклины относятся к быстро обменивающимся белкам с коротким временем полужизни, которое составляет у циклинов D-типа 15-20 мин. Это обеспечивает динамизм их комплексов с циклинзависимыми киназами . За внутриклеточную деградацию циклинов отвечает N-концевая последовательность аминокислотных остатков, названная боксом деструкции. При прохождении клеток через клеточный цикл вслед за активацией отдельных CDK по мере необходимости происходит их инактивация. В последнем случае имеет место протеолитическая деградация циклина, находящегося в комплексе с CDK, которая начинающается с бокса деструкции. Сами по себе циклины не могут полностью активировать соответствующие CDK. Для завершения процесса активации должно произойти специфическое фосфорилирование и дефосфорилирование определенных остатков аминокислот в полипептидных цепях этих протеинкиназ. Большую часть таких реакций осуществляет киназа, активирующая CDK (CAK - CDK activating kinase) , которая представляет собой комплекс CDK7 с циклином H . Таким образом, CDK становятся способными выполнять свои функции в клеточном цикле лишь после их взаимодействия с соответствующими циклинами и осуществления посттрансляционных модификаций под действием CAK и других аналогичных белков-регуляторов клеточного цикла. 2.2. Ингибиторы клеточного цикла В клеточном цикле имеются две основные стадии (точки перехода, контрольные точки R - restriction points), на которых могут быть реализованы негативные регуляторные воздействия, останавливающие продвижение клеток через клеточный цикл. Одна из этих стадий контролирует переход клетки к синтезу ДНК, а другая - начало митоза. Имеются и другие регулируемые этапы клеточного цикла. Переход клеток от одной фазы клеточного цикла к другой контролируется на уровне активации CDK их циклинами с участием ингибиторов циклинзависимых киназ CKI . По мере необходимости эти ингибиторы могут активироваться и блокировать взаимодействие CDK со своими циклинами, а следовательно, и клеточный цикл как таковой. После изменения внешних или внутренних условий клетка может продолжить пролиферацию или вступить на путь апоптоза . Имеется две группы CKI: белки семейств p21 и INK4 (inhibitor of CDK4), члены которых внутри семейств обладают похожими структурными свойствами. Семейство ингибиторов p21 включает в себя три белка: p21 , p27 и p57. Все эти белки обладают широкой специфичностью действия и могут ингибировать различные CDK . В отличие от них, группа ингибиторов INK4 более специфична. В нее входят четыре белка: p15INK4B , p16INK4A , p18INK4C и p19INK4D. Ингибиторы семейства INK4 функционируют во время фазы G1 клеточного цикла, подавляя активность киназы CDK4 , однако второй белковый продукт гена INK4A - p19ARF, взаимодействует с регуляторным фактором MDM2 белка p53 и инактивирует фактор. Это сопровождается увеличением стабильности белка p53 и остановкой клеточного цикла. 2.3. Контроль клетки за прохождением клеточного цикла 2.3.1. Объекты контроля и сверочные точки В ходе цикла клетка не просто «бездумно» следует по раз и навсегда заданному маршруту. Нет, одновременно происходит и самоконтроль собственного состояния. Этот контроль приурочен к определенным стадиям цикла. В клеточном цикле существует несколько «сверочных точек» — по одной на каждый из четырех периодов цикла (G1- , S-, G2-периоды и митоз). Главное, что подвергается контролю, — это состояние наследственного материала, хромосом. И, в зависимости от результатов «проверки», выбирается один из трах вариантов дальнейшего «поведения»: а) безостановочный переход к следующей стадии цикла, б) более или менее длительная задержка на текущей стадии — для исправления обнаруженных дефектов, если таковое возможно; в) запуск механизма апоптоза, если выявленные нарушения неисправимы. Последний вариант выбирается не только тогда, когда хромосомные дефекты просто «несовместимы с жизнью», но и тогда, когда они в принципе не препятствуют прохождению последующих стадий цикла. Так что здесь имеет место «забота» о том, чтобы в организме не появлялись клетки с «неправильным» геномом, — даже если эти клетки и были бы жизнеспособными. В таблице указано, что конкретно может быть признано «неудовлетворительным» в каждой из сверочных точек. Иначе говоря, какие причины могут задержать клетку на данной стадии цикла или даже индуцировать ее «самоубийство», т.е. апоптоз.
Все эти причины действительно так или иначе связаны с состоянием хромосом. Даже тогда, когда речь идет о микротрубочках и образующемся из них веретене деления. Ведь от функционирования этого веретена непосредственно зависит сегрегация хромосом (расхождение их к разным полюсам анафазной клетки). Неправильная сегрегация хромосом может привести не только к аномалиям их числа, но и к образованию стабильных микроядер. Это наблюдается тогда, когда у каких-либо хромосом нарушается связь с диплосомой. Такие хромосомы в анафазе перемещаются (если перемещаются вообще) к одному из полюсов с видимым отставанием. В телофазе же они, как обычно, служат центрами формирования микроядер. Но из-за отсутствия связи с единым центром эти микроядра так и не сливаются с «основным» ядром. Видимо, образование единой ядерной ламины (заставляющее микроядра объединяться друг с другом) происходит при формообразующем участии микротрубочек клеточного центра. В процессе репликации ДНК могут происходить те или иные ошибки (например, включение «неправильного» нуклеотида). Такие ошибки детектируются и исправляются специальной системой репарации; поэтому они, как правило, не приводят к остановке цикла и тем более к апоптозу. Кроме того, в ДНК на всех стадиях цикла могут появляться и другие «точечные» повреждения. Они тоже — предмет «заботы» соответствующих систем репарации ДНК, но не тех систем, которые отвечают за прохождение цикла. Если, конечно, эти повреждения не настолько множественные, что серьезно нарушают структуру хромосом. Таким образом, контроль за состоянием хромосом касается лишь достаточно крупных нарушений их структуры — начиная с двухцепочечных разрывов и кончая изменением числа хромосом (в результате ошибок сегрегации). Как и в случае систем репарации ДНК, эффективность контроля и элиминации (в т. ч. и путем апоптоза) крупных хромосомных нарушений — все же не стопроцентна. Эти нарушения могут «переходить» из одного периода цикла в другой. И о том же говорит сам факт существования таких известных хромосомных аномалий, как синдромы Дауна, Шерешевского-Тернера и другие. 2.3.2. Механизм остановки цикла В большинстве случаев остается пока неизвестным, какие конкретно структуры являются сенсором или детектором нарушений хромосомной структуры. Но в отношении двухцепочечных разрывов ДНК некоторая определенность есть. Считают, что их узнает специальная ДНК протеинкиназа. Само исправление таких разрывов осуществляется, вероятно, путем гомологичной рекомбинации поврежденной хромосомы (или хроматиды) с интактной. Между этими хромосомами происходит обмен таким фрагментом одной из цепей ДНК, в котором и заключен разрыв. В результате обмена в каждой хромосоме оказывается молекула ДНК с одноцепочечным разрывом. А такие разрывы устраняются ДНК-лигазой. Но все это требует времени. Для чего и происходит остановка клеточного цикла. В большинстве, если не во всех, случаях хромосомных повреждений центральную роль в остановке цикла играет белок р53. Он синтезируется в клетке постоянно, но в обычных условиях очень быстро разрушается, так что его концентрация в клетке оказывается весьма низкой. При наличии же в клетке хромосомных повреждений «включение» белка р53 происходит следующими способами: - путем уменьшения скорости его распада - путем повышения активности его молекул На активность р53 влияет, в частности, его специфический ингибитор — белок Mdm2. В то же время связывание этого ингибитора зависит от того, фосфорилирован ли соответствующий локус белка р53. Так, если речь идет о двухцепочечных разрывах ДНК, то обнаруживающая их ДНК протеинкиназа фосфорилирует р53 и тем самым освобождает его от ингибирующего влияния белка Mdm2. При других повреждениях ДНК могут работать иные механизмы. Например, после УФ-облучения в действие вступает казеинкиназа II: она тоже способна фосфорилировать и тем самым активировать белок р53. Способов регуляции активности этого белка очень много. Белок р53 - это транскрипционный фактор. И одно из первых его действий в таком качестве - активация гена белка р21. Белок р21 - ингибитор всех комплексов циклин-Cdk. По этой причине и наступает остановка клеточного цикла, в каком бы его периоде не находилась клетка. Если повреждения хромосом достаточно велики и их исправление затягивается, то длительно сохраняющий высокую активность белок р53 начинает стимулировать (как транскрипционный фактор) серию других генов (ВАХ, KILLER/DR5. и др.) запускающих апоптоз. Одновременно ингибируются антиапоптозные гены (BCL2, RELA). В итоге в такой клетке начинает выполняться сложная программа самоуничтожения. 2.4. Датчики АТМ и АТR Центральное положение в системе контроля повреждений ДНК занимают две киназы: ATM и ATR. Эти белки, схожие между собой по структуре и функции, относятся к классу PI3K-белков. ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) и его гомолог ATR (ATM and Rad3 Related) активируются после связывания с разорванными концами ДНК и/или модифицированными белками хроматина, а также с белком BRCA1. При этом ATM активируется преимущественно в ответ на возникновение двунитевых разрывов ДНК, тогда как другие нарушения структуры ДНК (сшивки оснований, вызванные УФ-облучением; повреждения, индуцируемые алкилирующими соединениями и др.) активируют и привлекают в комплекс белок ATR. Индивидуумы, имеющие мутации в двух аллелях гена ATM, страдают тяжелым заболеванием атаксией-телеангиоэктазией. Это заболевание характеризуется нейродегенеративными процессами, иммунодефицитом и предрасположенностью к злокачественным новообразованиям. 2.5. Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk2 Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk2 - это серин/треонин-киназы, негомологичные по структуре, но сходные по функциям и субстратам фосфорилирования. Возможно, чекпойнт-киназы, являются опухолевыми супрессорами. В биопсиях мелкоклеточного рака легкого находят мутантную форму Chk2 и минорную изоформу Chk1. При возникновении повреждений ДНК датчики ATM и ATR фосфорилируют Chk2, в результате чего происходит ее активация. Активированная Chk2, в свою очередь, фосфорилирует различные мишени, среди которых опухолевые супрессоры p53 и BRCA1, а также фосфатаза Cdc25С, играющая важную роль в регуляции G2-чекпойнта. Так, Chk2 фосфорилирует p53 по Ser-15, "защищая" от атаки Mdm2. У клеток, мутантных по двум аллелям CHK2, нарушены p53-зависимые процессы, такие, как остановка в G1 и апоптоз. Известны случаи синдрома Ли-Фраумени, вызванного мутациями в гене Сhk2, а не p53. Chk2 колокализована в ядре с опухолевым супрессором BRCA1. Ионизирующее излучение активирует Сhk2, которая, в свою очередь, фосфорилирует BRCA1. При этом BRCA1 также активируется, что сопровождается его выходом из очагов локализации. Chk2 ингибирует фосфатазу Cdc25С. Видимо, в связи с этим клетки CHK2-/- не способны поддерживать остановку клеточного цикла в G2 (G2-arrest), хотя инициация G2-чекпойнта у них не нарушена. В отличие от Chk2, активность чекпойнт-киназы 1 не увеличивается в ответ на повреждения ДНК. Тем не менее, показано, что при ДНК-повреждающих воздействиях Chk1 фосфорилируется датчиками ATR и, возможно, ATM. Каким именно образом фосфорилирование Chk1 влияет на ее активность, до конца не выяснено. Предполагается, что в фосфорилированной форме Chk1 легче связывается со своими мишенями. Функции Сhk1 изучены в меньшей степени, чем Chk2, поскольку мутации CHK1-/- летальны. Мыши, нокаутированные по двум аллелям CHK1, умирают в раннем эмбриогенезе из-за p53-независимого апоптоза эмбриональных стволовых клеток. Тем не менее, удалось показать, что клетки CHK1-/- не способны к остановке клеточного цикла в G2. Имеются данные, что Сhk1 фосфорилирует p53 in vitro. Однако имеет ли место этот процесс in vivo, пока неизвестно. In vivo выявлено, что p53 при участии опухолевых супрессоров p21waf1 и pRb способен действовать как ингибитор Chk1. Возможно, Chk1 и p53 регулируются реципрокно. Основной механизм действия Chk1 на клеточный цикл - инактивация фосфатаз Cdc25 A и C. Chk1-зависимый распад Cdc25A лежит в основе p53-независимой остановки в G1. Роль Chk1 в системе G2-чекпойнта активно изучается. Имеются данные, что Chk1 не только инактивирует Cdc25С, но также активирует Wee1. Таким образом, возможно, Chk1 осуществляет "двойной удар" по комплексу циклин B-Сdk1, задерживая клетки в G2. |