Курсовая (Преображенская). Челябинский государственный университет
 Скачать 68.44 Kb.
|
|
МИНОБРНАУКИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Биологический факультет Кафедра радиационной биологии КУРСОВАЯ РАБОТА ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА У ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОМУ ХРОНИЧЕСКОМУ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ Выполнила: студентка группы ББ-401(3) Преображенская Юлия Научный руководитель: Тряпицына Г.А. Челябинск 2012 г. Содержание Введение3 1. Клеточный цикл4 1.1. Стадии клеточного цикла4 1.2. Фазы митоза6 1.3. Методы изучения регуляции клеточного цикла9 2. Регуляция клеточного цикла13 2.1. Циклины и циклинзависимые киназы13 2.2. Ингибиторы клеточного цикла15 2.3. Контроль клетки за прохождением клеточного цикла16 2.3.1. Объекты контроля и сверочные точки16 2.3.2. Механизм остановки цикла19 2.4. Датчики АТМ и АТR21 2.5. Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk222 2.6. Белок Ki-6724 3. Нарушения регуляции клеточного цикла и канцерогенез25 4. Клеточный цикл и ионизирующее излучение 27 5. Проведение методики оценки задержки клеточного цикла лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии30 5.1. Выделение лимфоцитов периферической крови человека на градиенте фиколл-урографин30 5.2. Культивирование лимфоцитов периферической крови человека30 5.3. Анализ пролиферативной активности лимфоцитов с использованием набора Кi-6731 5.4. Анализ проб на проточном цитометре 32 Заключение33 Список использованной литературы34 Введение Деление клетки - важный биологический процесс, контролируемый высоко скоординированными механизмами. Задержка клеточного цикла может свидетельствовать о повреждении генетического материала клетки. А увеличение скорости прохождения клетки по циклу, и/или усиление пролиферации клеток может указывать, как на нарушение механизмов регуляции клеточного цикла (системы сверочных точек), так и на компенсаторные процессы, связанные с восстановлением клеточного состава ткани. Такие эффекты изменения параметров клеточного цикла наблюдаются при радиационном и ультрафиолетовом облучении. Возрастающий риск облучения человека, связанный с бурно развивающейся атомной энергетикой и широким применением в медицине радиоизотопных методов диагностики и лечения приводит к необходимости исследования эффектов радиационного воздействия. После крупных радиационных инцидентов прошлых лет: атомной бомбардировки городов Хиросимы и Нагасаки, аварии на ЧАЭС, радиоактивного загрязнения вод р. Теча, ставшего результатом деятельности ПО «МАЯК», а также в связи с произошедшей в 2011 году радиационной аварией на Фукусиме-1, особое место занимает проблема отдаленных эффектов радиационного воздействия на человека. 1. Клеточный цикл 1.1. Стадии клеточного цикла Период жизни клетки от одного деления до другого называется митотическим (клеточным) циклом. Полный митотический цикл включает 4 периода. 1) G1-пepиод (постмитотический, или пресинтетический): начинается сразу после образования клетки (наряду с сестринской) в результате митоза материнской клетки. В этот период в новой клетке постепенно растёт содержание цитоплазматнческих белков, отчего сама клетка увеличивается до размеров материнской. В этот же период принимается «решение»: вступает ли клетка (по «стопам» материнской) в митотический цикл или она не будет делиться. О клетках, вышедших из цикла, говорят, что они вступили в G0-период. Этот выход может быть необратимым (если клетка вступает в дифференцировку и далеко заходит на этом пути), но может быть и обратимым — для «заснувших» стволовых клеток и некоторых дифференцированных клеток (например, фибробластов и лимфоцитов). Возвращаясь под действием внешних сигналов в митотический цикл, клетки вступают в его S- пepиод. Примерно так же и «решение» о вступлении клетки в деление может быть обратимым и необратимым. Если подготовка к делению зашла слишком далеко, то клетка войдет в S-период даже тогда, когда на нее перестают действовать митогены. В таком случае говорят, что клетка прошла точку рестрикции. Очевидно, эта точка предшествует периоду, т. е. для постоянно делящихся клеток находится где-то в конце G1-периода. а для клетки, начинающей деление после перерыва, где-то в конце Gn- периода. 2) S-период (синтетический): а ядре клетки происходит удвоение ДНК (кроме центромерных участков) и хромосомных белков; в цитоплазме — удвоение центриолей. К концу периода клетка становится тетраплоидной по ДНК. Каждая хромосома реплицируется сразу во многих точках, что значительно сокращает продолжительность репликации. Но ни в одной такой точке репликации процесс не инициируется более одного раза. 3) G2-период (постсинтетический, или премитотический): происходит синтез других белков, необходимых для прохождения митоза, и в т. ч. тубулина. из которого формируются микротрубочки веретена деления. 4) М - митоз: деление тетраплоидной (по ДНК) клетки на две диплоидные. Примерная продолжительность периодов цикла для быстро делящихся клеток человека: G1-период — 9 ч. S-период - 10 ч. G2-период — 4,5 ч. М (митоз) — 0.5 ч. Итого 24 ч. Но, разумеется, это очень приблизительные оценки, и дли каких-то клеток цикл может быть более продолжительным. В частности для сперматогоний S-период длится 15 ч. И, соответственно, в 1,5 раза больше оказывается у них общая продолжительность цикла примерно 1,5 суток. Так что на 10 митотических делений сперматогоний (происходящих на первом этапе сперматогенеза) требуется 2 недели. 1.2. Фазы митоза 1) Профаза — в ядре клетки конденсируются хромосомы, поэтому они начинают обнаруживаться под световым микроскопом в виде нитчатых структур. При этом каждая хромосома содержит две прилегающие друг к другу хроматиды. что является результатом репликации хромосом S-периоде. я выявляется лишь и конце профазы. Но и в профазе сестринские хроматиды еще связаны друг c другом во многих местах с помощью белков когезинов. Синтез РНК на хромосомах, естественно, полностью прекращается. Из-за инактивации рибосомных генов исчезают ядрышки. Постепенно разрушается ядерная оболочка: - ядерная ламина (связанная с внутренней ядерной мембраной) разрушается путем деполимеризации составляющих ее промежуточных филамеитов, - а сами ядерные мембраны (внутренняя и наружная) распадаются на мелкие пузырьки. Аналогичный процесс происходит в цитоплазме: эндо-плазматическая сеть (ЭПС) и аппарат Гольджи тоже распадаются на везикулы. Две диплосомы (каждая из которых — это пара центриолей) постепенно расходятся к полюсам клетки и начинают участвовать в формировании веретена деления. Синтез белка на рибосомах значительно снижается (до 25 % от прежнего уровня). б) Метафаза — хромосомы достигают максимальной степени конденсации и выстраиваются в экваториальной плоскости клетки, образуя метафазную пластинку хромосом, или материнскую звезду.митоза: Постепенно в хромосомах разрушаются когезиновые комплексы между сестринскими хроматидами. К концу метафазы разделение хроматид завершается; они сохраняют только кажущуюся связь в области центромериых перетяжек. Путем полимеризации белка тубулииа завершается формирование веретена деления. В его состав входят микротрубочкн трех видов: - кинетохорные — связывают каждую хроматиду (отходя от ее кинетохоры. — специального белкового комплекса в области центромеры) с одной из днплосом; - полярные — идут от одной из диплосом к центру веретена, где перекрываются с микротрубочками от другого полюса; - астральные — направлены от диплосомы к поверхности клетки. У дрожжей и других грибов ядерная оболочка в профазе митоза не разрушается. Так что митотическое веретено формируется внутри ядра (которое позднее расщепляется на два ядра). в) Анафаза — это самая короткая стадия митоза. Хроматиды, сохраняя максимальную степень конденсации, теряют связь друг с другом и начинают расходиться к полюсам клетки. При этом они ориентированы центромерными участками к соответствующему полюсу, а теломерными - к экватору клетки. Причем две хроматиды каждой хромосомы расходятся к противоположным полюсам. Поэтому обе дочерние клетки получают полные и равные наборы однохроматидных хромосом. Движение хромосом обеспечивается несколькими факторами. С одной стороны, видимо, имеет значение изменение длины микротрубочек веретена деления: -укорочение (разборка) кинетохорных микротрубочек и удлинение полярных микротрубочек (что ведет к расхождению самих полюсов). С другой стороны, считается, что в процессе участвуют и белки транслокаторы: - одни из них перемещают хромосомы вдоль кинетохорных микротрубочек, - другие перемещают полярные микротрубочкн в стороны друг от друга. г) Телофаза — каждый набор расходящихся однохроматидных хромосом, приблизившись к «своей» диплосоме, останавливается. С хромосомами ассоциируют пузырьки, образовавшиеся в профазе из разрушенных ядерных мембран. В их стенки вновь встраиваются комплексы ядерных пор. Через последние в пузырьки проникают белки, формирующие промежуточные филамеиты, которые, в свою очередь, образуют ядерную ламину. Благодаря этому пузырьки сливаются. Вначале они образуют двойную оболочку вокруг каждой хромосомы. Получаются своего рода мини-ядра, называемые кариомерами. Каждое из них сохраняет связь со «своей» диплосомой. Позднее сливаются друг с другом сами кариомеры, связанные с одной и той же диплосомой. Таким образом образуются два дочерних ядра. Хромосомы постепенно деконденснруются, и начинают формироваться ядрышки. В поздней телофазе происходит цитотомия (иногда называемая цитокинезов) — разделение тела клетки между ядрами. Для этого по экватору клетки формируется актомиозиновое кольцо, которое постепенно сжимается, стягивая за собой плаз- 1 молемму и образуя перетяжку все уменьшающегося диаметра. В конце концов получаются две дочерние клетки. После цитотомии в клетках восстанавливаются эндоплазматическая сеть и аппарат Гольджи. 1.3. Методы изучения регуляции клеточного цикла Даже вышеприведенное краткое описание клеточного цикла (и митоза как его части) показывает, сколь много событий происходит всего лишь за 24-36 часов (составляющих обычную продолжительность цикла. Очевидно, все это управляется на молекулярном уровне. Т. е. за, казалось бы, чисто морфологическими явлениями стоит некое множество молекул-регуляторов, которое воспринимает митогенные сигналы и затем последовательно инициирует строго определенные события. Как же расшифровывалась такая сложная молекулярная «кухня»? Это достаточно интересно и поучительно, поэтому хотя бы очень бегло расскажем о соответствующих экспериментах. Их можно поделить на три типа: а) эксперименты по слиянию клеток, б) изучение делений бластомеров, в) исследования мутантов (в основном, дрожжей). а) Эксперименты по слиянию клеток. Здесь используются клетки, растущие в культуре. Вот наиболее характерный эксперимент: специальной обработкой добиваются попарного слияния клеток двух видов - одни находятся в G1-, а другие — в S-периоде цикла. (Для краткости их будем обозначать соответственно G1 и S-клетки.) Образующиеся химерные клетки содержат по два ядра, причем на момент слияния в одном (нз S-клетки) происходит синтез ДНК, а в другом (из G1-клетки) нет. Так вот, через не большое время синтез ДНК начинается и во втором ядре. Следовательно, в S-клетке содержатся некие факторы, способные диффундировать в ядра G1-клеток и инициировать репликацию ДНК. Очевидно, это те самые факторы, которые вызывают переход клеток из G1-периода в S-период. Но если аналогичный эксперимент произвести с G2- и S- клетками, то результат будет отрицательным: в G2-ядре (уже содержащем удвоенный набор ДНК) репликация ДНК не начинается. Значит, в G2-ядрах имеется механизм, который блокирует избыточную репликацию даже при действии стимулирующих факторов. Весьма показательны также эксперименты с М-клетками (т. е. клетками, находящимися в митозе). В них нет ядерной оболочки. После же слияния с ними любых ннтерфазных клеток (G1-, S- или G2-клеток) ядерная оболочка последних также разрушается, а хромосомы подвергаются конденсации. Это свидетельствует, во-первых, о том, что в митотических клетках присутствуют регуляторные факторы, запускающие митоз. Во-вторых, в отличие от синтеза ДНК, контроль над запуском митоза не столь жесткий, так что возможно преждевременное вхождение в митоз (не только из G2-. но также из G1- и S- периодов). С этим обстоятельством могут быть связаны определенные нарушения клеточного цикла. б) Изучение делений бластомеров. В данном случае объектом исследования служили крупные яйцеклетки амфибий и морских ежей, а также образующиеся из них зародыши самых ранних стадий развития. Как известно, на этих стадиях интенсивно происходят митотические деления, причем у зародышей амфибий (как и морских ежей) все клетки делятся одновременно. Кроме того, укапанные объекты удобны тем, что могут быть получены в достаточна . больших количествах. Все это позволяет осуществлять i.биохимический анализ — фракционировать содержимое клеток, находящихся на определенной стадии цикла, и производить очистку соответствующих белковых факторов. А как проверить биологическую роль выделяемых факторов? Примерно так же, как это делалось в экспериментах предыдущего типа. А именно: ввести либо клеточный экстракт, либо определенную его фракцию в ооциты. покоящиеся в самом начале мейоза. Если в изучаемом образце содержатся факторы, запускающие деления, ооциты «просыпаются» и вступают в мейотические деления, превращаясь в яйцеклетку. Положительные результаты такого тестирования, между прочим, означают, что механизмы митотических и мейотическнх делений во многом близки. Более того: оказалось, что данный тест можно использовать для оценки экстрактов из делящихся клеток не только самих амфибий, но и других животных, в т. ч. млекопитающих. в) Исследования мутантов. Как уже отмечалось, в этих генетических экспериментах использовались, в основном, дрожжи. В вегетативной фазе жизнедеятельности их клетки гаплоидны (содержат по одной копии генов), что облегчает выявление мутаций. Мутации можно индуцировать разными способами: облучением, нагреванием, химическими агентами. Такие исследования показали, что некоторые мутации нарушают клеточный цикл. При этом характерным образом меняются размеры клеток. При т. н. cdc-мутациях (от cell division cycle цикл деления клеток) блокировано деление клеток, отчего последние только растут в длину (не почкуясь) и достигают очень больших размеров. Напротив, при т. н. wee-мутациях (wee — крошечный) деления происходят раньше времени — до того, как клетка успела достаточно удлиниться; поэтому получаются клетки очень малой длины. Выяснилось, что проявляться как cdc мутация могут повреждения разных генов: то одного, то другого, то третьего — и т. д. То же относится к мутациям wee. Следовательно, все эти гены ответственны за регуляцию клеточного цикла. А чтобы идентифицировать конкретный продукт каждого такого гена, поступают следующим образом: - выделяют ДНК из нормальных клеток, - фрагментируют ее с помощью рестриктаз, -включают получающиеся фрагменты нормальной ДНК в состав различных плазмид - и вводят плазмиды с испытуемым фрагментом в мутантные клетки. Если мутация - рецессивная, а введенный фрагмент ДНК содержит «правильную» версию мутированного гена, то клеточный цикл нормализуется и образуется колония клеток обычного размера. Так становится известным очередной ген, отвечающий за клеточный цикл. После этого сравнительно нетрудно выяснить природу белка, который кодируется данным геном и является одним из регуляторов цикла. До сих пор речь шла лишь о генах н белках дрожжей. Но белки, регулирующие клеточный цикл, высококонсервативны, т. е. сравнительно мало изменились за время эволюции. Поэтому соответствующие гены даже человека, будучи введенными с плазмидами в мутантные дрожжевые клетки, часто способны восстановить у последних нормальный клеточный цикл. Следовательно, данная модель подходит для изучения регуляторных генов и высших животных. |