МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа: установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией и определение стадии заболевания. За определением стадии неразрывно следует и выяснение характера течения заболевания, а затем и формирование прогноза у данного больного, а также выбор тактики лечения.
Как известно, диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.
При диагностике ВИЧ-инфекции часто встречается типичная ошибка, когда диагноз устанавливается на основании какого-нибудь лабораторного теста, к которому у врача по той или иной причине возникает чересчур сильное доверие. Некоторые работники лабораторий даже сами берут на себя смелость устанавливать диагноз ВИЧ-инфекции, никогда не видя больного. Иногда клиницисты также безоговорочно доверяют результатам лабораторных исследований, которые могут служить только как отдельные свидетели в деле вынесения окончательного приговора пациенту. Можно не останавливаться на сплошь и рядом встречающихся «обыкновенных» ошибках, которые возникают при перепутывании сывороток, неправильном заполнении документации и т. п. Клиницист просто обязан знать «диагностическую ценность» того или иного метода. Известен случай, когда в Санкт-Петербурге в результате неумелого использования какого-то «нового» метода, один «ученый» выдал диагноз «ВИЧ-инфекция» совершенного здоровому и неинфицированному человеку (которого он, кстати, никогда не видел), в результате чего последний покончил с собой. Другой, не менее «выдающийся ученый», несколько лет водил за нос руководство одной бывшей советской республики, доказывая, что население этой страны «поражено эпидемией СПИДа», поскольку разработанный им « сверхчувствительный» метод исследования «выявляет ВИЧ-инфекцию у зараженных намного раньше, чем все другие известные методики». В обоих случаях речь, конечно, шла о ложных реакциях, которые давали их «новейшие методы».
Типичный случай «установления диагноза ВИЧ-инфекции (вирусологически)» приводится в статье Н.Н. Беляевой (1). Несмотря на то, что у описываемого автором умершего пациента, мужчины 21 г., отсутствовали достоверные факторы риска инфицирования ВИЧ в эпиданамнезе, были отрицательные результаты обследования крови на антитела к ВИЧ, не было диагностировано ни одного типичного для ВИЧ-инфекции оппортунистического заболевания, и был патологоанатомически поставлен диагноз «лимфогранулематоз с поражением КМ (костного мозга?), печени, селезенки, лимфоузлов кишечника», автор (видимо, только в своей собственной статье) ставит ему «посмертный диагноз: «ВИЧ-инфекция». Основанием для этого «ретроспективного» диагноза было упоминание, что материал от больного «исследовали с помощью молекулярной гибридизации с использованием радиоактивного зонда и выявили в мононуклеарных клетках наличие вирусоспепецифических последовательностей ВИЧ-1». По-видимому, на автора статьи столь сильное впечатление произвела вирусологическая терминология, что он увидел на «этом примере исключительную ценность вирусологической диагностики по сравнению с серологической, особенно у детей младшего возраста (?)...».
Новые методы диагностики должны подтверждаться старыми, а не наоборот. Поэтому общей рекомендацией для клиницистов и эпидемиологов является скептическое отношение ко всем «новейшим» методикам, до тех пор, пока они не «устареют», то есть пока не станут известны все их достоинства и недостатки.
До последнего времени не прекращаются споры: можно ли диагностировать ВИЧ-инфекцию без лабораторного подтверждения. Это было бы предметом серьезной дискуссии, если бы в России не были повсеместно доступны методы обнаружения антител к ВИЧ. Но, тем не менее, это вполне возможно. Было множество случаев, когда диагноз ВИЧ-инфекции не вызывал сомнения с момента сбора анамнеза и с первого осмотра пациента. Трудно припомнить случай, чтобы типичная лимфаденопатия у выходца из центральной или восточной Африки не оказалась верным признаком ВИЧ-инфекции.
В силу сложившейся в России традиции миллионы людей обследуются на антитела к ВИЧ без определенных показаний, и в большинстве случаев врач сначала получает данные исследования (положительная реакция на антитела к ВИЧ), а лишь потом видит самого больного и может его опросить.
При таком положении вещей быстро забывается, что лабораторное исследование служит лишь подтверждением клинического. В тех же случаях, когда врач уже знает, что у осматриваемого больного выявлены антитела к ВИЧ, он легко может ошибиться, пойдя на поводу у бумажки с соответствующей записью. Так, в 1985-1989 годах врачам пришлось осматривать десятки пациентов, которых направляли в Москву из-за ложных лабораторных подтверждений ВИЧ-инфекции. В период 1987-1995 годов на один истинно положительный «лабораторный диагноз», основанный только на определении антител к ВИЧ по иммуноферментной методике, приходилось до 2000-3000 ложных! Все люди с подобной реакцией раньше длительно находились на диспансерном наблюдении, создавая много работы для сотрудников Центров по борьбе со СПИДом.
Практический интерес представляют случаи, когда пациент находится в стадии инкубации или стадии первичных проявлений ВИЧ и количество антител в его крови еще слишком мало для выявления. Тем не менее, при достаточном опыте инфекционисты довольно быстро распознают эти случаи. Так, например, однажды доктор М. А. Бурчик, работавшая в боксовом отделении 2-й КИБ г. Москвы, заподозрила ВИЧ-инфекцию у мужчины 44 лет, вернувшегося из поездки в США и страдавшего заболеванием, по клинике очень напоминавшим инфекционный мононуклеоз, и при первом обследовании серонегативного к ВИЧ. Доктор справедливо заметила, что для мононуклеоза зрелый возраст пациента не очень типичен, ведь, описавший его Филатов в свое время назвал его детской «железистой лихорадкой», а некоторые авторы, наблюдавшие его у взрослых, называли также «болезнью студентов и влюбленных», то есть лиц молодого возраста. Повторный анализ на антитела к ВИЧ, сделанный через неделю, также был отрицательным. Однако доктор проявила настойчивость, и уже при третьем анализе, сделанном через месяц после начала клинических проявлений, были обнаружены антитела к отдельным белкам ВИЧ, а в последующих анализах - полностью положительная реакция** на антитела к ВИЧ в иммунном блотинге. При последующем сборе эпиданамнеза выяснилось, что пациент имел гомосексуальные связи во время поездки в США, в результате чего и заразился ВИЧ.
К числу наиболее изученных и распространенных относится метод обнаружения антител к ВИЧ. Так как ВИЧ-инфекция в большинстве случаев длится пожизненно, то для диагностики достаточно самого факта обнаружения антител. При ВИЧ-инфекции, в отличие от других инфекций, в большинстве случаев нет необходимости использовать парные, то есть взятые через определенный временной промежуток, сыворотки.
Обнаружение антител, в принципе, может выявить более 99% инфицированных ВИЧ лиц. Некоторые сложности связаны с тем, что антитела к ВИЧ отсутствуют в первые недели после заражения, а также их количество может заметно снижаться в терминальном периоде заболевания. Имеются сведения об отдельных, но достаточно редких случаях ВИЧ-инфекции, когда антитела длительно не обнаруживаются или исчезают на сравнительно длительный срок.
Так, с 1995 по 1997 в США и Канаде были идентифицированы 8 пациентов с клиническими признаками ВИЧ-инфекции, у которых многократные исследования сывороток на наличие антител давали отрицательные результаты. (2). У всех больных отмечались клинические проявления, соответствующие определению СПИДа, снижение уровня СД4 ниже клеток ниже 200. Пробы на р24 антиген были положительными, так же как и результаты обнаружения РНК и ДНК ВИЧ. Исследование сывороток этих пациентов в нескольких тест-системах для обнаружения антител показали, что некоторые из них выявляют наличие антител к ВИЧ, а другие нет. Исследования сывороток в иммунном блотинге у 4 из 8 пациентов обнаруживало наличие антител к протеинам ВИЧ, то есть эти сыворотки могли расцениваться как сомнительные (неинтерпретируемый результат).
Это наблюдение подчеркивает необходимость комплексной оценки результатов обследования при диагностике ВИЧ-инфекции, так как во всех случаях заболевание было заподозрено на основании клинических проявлений. У ряда пациентов из этой группы можно было выявить в анамнезе половые связи с лицами, в последствии заболевшими СПИДом. Эпидемиологическое значение таких случаев в целом невелико, так как они встречаются нечасто, однако теоретически они могут играть роль в возникновении отдельных вспышек, что следует принимать во внимание при проведении эпидрасследований.
Еще раньше эксперты высказывали мнение, что отсутствие антител к ВИЧ к 6 месяцам от заражения является чрезвычайно редким и негативный результат обследования на антитела к ВИЧ в этот срок является, скорее всего, "веским аргументом против диагноза ВИЧ-инфекции" (3, 4). Описанные в вышеупомянутом сообщении (2) «серонегативные» случаи клинически выраженной ВИЧ-инфекции составляли лишь сотые доли процента от общего числа выявленных за тот же период времени в США больных СПИДом. Теоретически можно предполагать, что с увеличением заболеваемости ВИЧ-инфекцией в России абсолютное число таких случаев будет возрастать, и соответственным образом может вырасти роль серонегативных источников в эпидпроцессе. Но, с другой стороны, так как качество диагностических тест-систем и их способность выявлять все более низкие концентрации антител, возрастает, то эти расчеты могут и не иметь существенного значения.
Так как терминология, используемая при лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции далеко не всегда является понятной для практикующего врача, необходимо остановиться на ней более подробно.
Диагностическими тест-системами называют специальные наборы реактивов для обнаружения маркеров ВИЧ-инфекции. Чаще всего, как было отмечено выше, они предназначены для определения антител к ВИЧ. Главным их различием между собой является лишь способ обнаружения реакции антитела с антигеном ВИЧ. Тест-системы отличаются, кроме метода обнаружения реакции "антиген-антитело", также по подбору используемых антигенов ВИЧ, которые могут быть получены непосредственно из ВИЧ рекомбинантными методами или синтезированы из аминокислот, а, кроме того, - и по подбору сопутствующих реактивов и дизайну. Врачей-практиков не должны смущать чаще всего употребляемые в рекламных целях выражения «тест-системы третьего поколения», «тест-системы нового поколения» и т.п. Фактически под этим скрывается только лишь использование новых ингредиентов, хотя на самом деле качество «тест-системы четвертого поколения» может быть значительно ниже, чем у тест-системы «первого поколения». Так, системы с использованием в качестве антигена «вирусного лизата», то есть разрушенного вируса относят к «первому поколению», но по своей способности выявлять всех зараженных, имеющих антитела к ВИЧ, они могут превосходить «новые поколения».
Качественными характеристиками этих тестов являются способность выявлять максимальное число "истинно положительных" сывороток, то есть сывороток, действительно содержащих антитела к ВИЧ (чувствительность тест-системы), и способность регистрировать минимальное число "ложноположительных", то есть дающих ложную реакцию с диагностикумом сывороток (специфичность тест-системы). Если заявленная чувствительность теста составляет 99,9%, то это означает, что он выявляет 999 сывороток из каждых 1000, содержащих антитела, а одну из тысячи не выявляет. Если специфичность заявлена как 99,9%, то это значит, что тест прореагирует как «положительный» с одной из 1000 обследованных сывороток, в которых точно нет антител к ВИЧ.
Как правило, реальные чувствительность и специфичность тест-систем ниже заявленных производителями, и о ценности этих тестов можно судить в основном по результатам их практического применения.
Вполне естественно, что наибольшее количество сывороток, содержащих антитела к ВИЧ, выявляют те тесты, которые содержат антигенные детерминанты, наиболее часто встречающиеся у ВИЧ-1. Но для того, чтобы выявлять, например, и более редко встречающиеся сыворотки с антителами к ВИЧ-2 или субтипу О ВИЧ-1 в настоящее время приходится вводить в состав набора антигенов также и антигенные детерминанты, специфичные для этих вариантов, то есть постоянно расширять набор антигенных детерминант. Неспособность тест-системы выявить как "положительные" некоторые содержащие антитела сыворотки приводит к ложноотрицательным результатам. Причиной ложноотрицательных результатов может быть недостаточная чувствительность, связанная как с неправильным подбором используемых реагентов, так и неадекватный подбор используемых антигенных детерминант.
Все известные тест-системы имеют некоторые ограничения по своей возможности выявлять все сыворотки, содержащие антитела к ВИЧ, ( по чувствительности ) уже хотя бы потому, что количество этих антител может быть очень небольшим, особенно в начальный и финальный периоды болезни. Однако в модельных опытах с заранее известными заведомо позитивными сыворотками ("диагностическая панель сывороток") чувствительность некоторых тест-систем может достигать 100% - то есть они выявляют все заведомо "положительные" сыворотки, использованные в данном эксперименте. При этом, разумеется, не следует забывать, что лица, проводящие испытания, могут случайно или сознательно подбирать сыворотки с теми или иными особенностями, что влияет на результат испытания.
В то же время и ложноположительные реакции присущи практически всем тест-системам. Это связано с тем, что в исследуемых материалах могут присутствовать антитела к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ, или примесям к антигену. Так, при классической методике получения антигена ВИЧ из лизата клеточных культур вируса в конечном продукте обнаруживаются фрагменты лимфоцитов, антитела к которым могут давать ложные реакции (5) и т.п. Отмечено, что по мере повышения чувствительности теста, отмечается тенденция к увеличению числа ложноположительных реакций.
На практике к этому добавляются также ложноотрицательные и ложноположительные результаты, возникающие из-за ошибок персонала, ухудшения качества систем из-за транспортировки и хранения в неправильных условиях, из-за снижения качества тест-систем вследствие длительного хранения. Поэтому, наряду с со специфичностью и чувствительностью, определенными в лабораторных условиях иногда определяют эти параметры в «полевых» условиях, то есть такими, какими они достаются практическому здравоохранению. Как правило «полевые» характеристики, вследствие вышеперечисленных причин ниже лабораторных. На результаты использования тест-систем могут оказывать влияние даже такие факторы, как качество используемой для промывания посуды воды и т.п.
Чаще всего антитела к ВИЧ обнаруживают иммуноферментными методами. Принципиальных различий в многочисленных коммерческих тест-системах для твердофазного иммуноферментного анализа нет, хотя по чувствительности и специфичности они могут существенным образом отличаться. Довольно часто наблюдается, что одни и те же сыворотки дают различные результаты при использовании различных тест-систем. Отсюда, безусловно, признано, что "положительные" результаты обследования в одной тест-системе нельзя считать безусловно "истинно-положительным" результатом.
В связи с этим предложен и используется ряд методов для проверки специфичности результатов обнаружения антител. Среди этих методов наиболее часто применяют реакцию "иммунный блотинг" или «иммуноблот» в модификации Western Blot. (В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» - как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.»). Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции. (Рисунок. Иммуноблот с антигенами ВИЧ)
Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.
Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140. Однако и здесь имеются некоторые расхождения между мнениями отдельных исследовательских групп.
Так, ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ (7). Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).
Но (8), допустима трактовка сывороток как позитивных и при наличии антител только к одному белку оболочки, особенно в тех случаях, когда речь идет об обследовании в очагах ВИЧ-инфекции. Совершенно очевидно, что в том случае, если речь идет о сыворотке ребенка, находившегося в нозокомиальном очаге ВИЧ-инфекции, или реципиента крови, получившего переливание крови от серопозитивного лица или о половом партнере ВИЧ-инфицированного, диагностическая значимость позитивной реакции резко возрастает. Здесь нужно обратить внимание читателя на то, что диагноз ВИЧ-инфекции устанавливается не на основании лабораторных исследований, а при их сопоставлении с клиническими и эпидемиологическими данными. Так, именно в Элисте, во время эпидрасследования внутрибольничной вспышки, наблюдали около десяти случаев, когда у инфицированных детей первоначально в иммунном блотинге отмечались антитела только к одному гликопротеиду env.
Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.
Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев). Если через 6 месяцев вновь будут получены неопределенные результаты (отсутствие реакции с белками env ВИЧ-1 и ВИЧ-2), а также не будут выявлены факторы риска и клинические симптомы иммунодефицита, то обычно делают вывод о неспецифической реакции иммунного блотинга. Считается, что в случае истинной ВИЧ-инфекции обычно после нескольких месяцев наблюдения за спектром антител определяется "положительная" динамика - то есть появление антител к прочим структурам ВИЧ, а на нитроцеллюлозе в иммунном блоте наблюдается появление недостающих для диагностики полос (7). Напротив, в случае ложной реакции результаты иммунного блотинга остаются неопределенными или становятся "отрицательными", то есть "подозрительные" полосы исчезают.
Эффективность диагностики ВИЧ-инфекции с помощью обнаружения антител в крови снижает то, что антитела к ВИЧ могут не обнаруживаться в первые месяцы заражения или в терминальной стадии заболевания, и, напротив, обнаруживаться в первые месяцы жизни у незараженных детей, родившихся от ВИЧ инфицированных матерей.
Так как у детей действительно обнаруживаются антитела к ВИЧ, то в данном случае реакцию нельзя назвать "ложноположительной". С одной стороны, в течение первого года жизни в сыворотке крови ребенка циркулируют материнские антитела и, следовательно, обнаружение антител к ВИЧ у детей первого года жизни не является достаточным основанием для постановки им диагноза ВИЧ-инфекции. С другой стороны, поскольку заражение ВИЧ в неонатальном периоде может индуцировать гипо - и агаммаглобулинемию, исчезновение антител не может считаться достаточным основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. В связи с эти дети, родившиеся от ВИЧ позитивных матерей должны были раньше клинически наблюдаться не менее, чем в течение 36 месяцев от рождения. С появлением новых методов диагностики отмечается тенденция к сокращению сроков наблюдения. Обнаружение у таких детей ВИЧ антигенов ВИЧ, или нуклеотидных последовательностей ВИЧ может подтверждать диагноз ВИЧ-инфекции в более ранние сроки, однако отрицательные результаты таких исследований не позволяют его полностью отвергнуть.( подробнее см. ниже). По истечении всего срока наблюдения вопрос о наличии у ребенка ВИЧ-инфекции решается на основании анализа комплекса клинических, иммунологических и серологических данных.
Недостатком наиболее распространенных в настоящее время иммуноферментных систем является необходимость применения специального оборудования для оценки результатов реакции - спектрофотометров с аксессуарами, которые могут включать компьютеры со специальными программами обсчета и т.п., что значительно увеличивает стоимость исследований и делает исследователя зависимым от специальных условий, включая специальные помещения, электро- и водоснабжение. Использование иммунного блотинга сильно лимитирует его высокая стоимость.
Так как иммунный блотинг, вопреки распространенному мнению, является менее чувствительной методикой, чем твердофазный иммуноферментный метод, то в некоторых странах допускают постановку серологического диагноза после обнаружения антител к ВИЧ с помощью нескольких тест-систем для иммуноферментного твердофазного анализа, отличающихся по составу антигенов. Эффективность метода иммунного блотинга снижает обнаружение достаточно большого числа "не интерпретируемых" или "неопределенных" результатов.
Методом, теоретически упрощающим диагностику, является методика обнаружения антител к ВИЧ в слюне, которая в настоящее время приближается по чувствительности к обнаружению антител в крови, но пока значительно уступает по специфичности, то есть, дает большее количество ложноположительных результатов.
Кроме иммуноферментных, с успехом развиваются и другие методы обнаружения антител в крови: агглютинационный, иммунофлюоресцентный, радио-иммунопреципитационный и другие.
Для "полевых" исследований в настоящее время предлагаются всякого рода "упрощенные" варианты тест-систем для обнаружения антител к ВИЧ. Их чувствительность и специфичность может значительно колебаться.
В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с последующим подтверждением их специфичности в реакции иммунного блотинга.
Антитела к ВИЧ появляются у 90-95 % зараженных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9 % - через 6 месяцев от момента заражения, и у 0,5-1 % - в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител - 2 недели от момента заражения.
Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа. На первом этапе проводится выявление суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с использованием различных тестов: иммуноферментных, агглютинационных, комбинированных, гребеночных, мембранно-фильтрационных или мембранно-диффузных. На втором этапе методом иммунного блотинга проводится определение антител к отдельным белкам вируса. В работе допустимо использование только тест-систем, имеющих разрешение к применению Министерства Здравоохранения РФ. Диагностические процедуры должны проводиться только в соответствии с утвержденными инструкциями по применению соответствующих тестов.
Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь. Полученный материал (цельную кровь) не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при 4-8°C. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. Сыворотка отделяется центрифугированием или обводкой крови по стенке пробирки пастеровской пипеткой либо стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может храниться до 7 дней при температуре 4-8°С. При работе следует соблюдать правила техники безопасности.
При получении первого положительного результата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой и в той же тест-системе).
При получении хотя бы еще одного положительного результата (два положительных результата из трех постановок в ИФА) сыворотка исследуется в другой тест-системе для определения суммарных антител к ВИЧ.
Первично положительная сыворотка, (то есть давшая два положительных результата в первой тест-системе) повторно исследуется в ИФА во второй (другой) тест-системе, выбранной для подтверждения.
При получении положительного результата анализа и во второй тест-системе сыворотку необходимо исследовать в ИБ.
При получении отрицательного результата во второй тест-системе сыворотка повторно исследуется в третьей тест системе.
В случае получения отрицательного результата анализа и во второй и в третьей тест-системе выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ.
При получении положительного результата в третьей тест-системе сыворотка также направляется на исследование в иммунном блотинге.
Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. Белки оболочки вируса (env) ВИЧ-1, обычно обозначаемые как гликопротеины, (гп) с молекулярным весом, обозначаемым в килодальтонах (кд): 160кд, 120кд, 41кд. У ВИЧ-2 гликопротеины имеют вес 140кд, 105кд, 36кд. Белки сердцевины (gag) (обычно обозначаемые как протеины) у ВИЧ-1 имеют молекулярный вес соответственно 55кд, 24кд, 17кд, а ВИЧ-2 - 56кд, 26кд. 18кд. Ферменты ВИЧ-1 (pol) имеют молекулярный вес 66 кд, 51 кд, 31кд, ВИЧ-2 - 68кд.
Результаты, полученные в иммунном блотинге, интерпретируются, как положительные, сомнительные и отрицательные.
Положительными (позитивными) считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ.
Отрицательными (негативными) считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антител ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ.
Пробы, в которых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-либо протеинам ВИЧ, считаются сомнительными (неопределенными или не интерпретируемыми).
При получении сомнительного результата с антителами к белкам сердцевины (gag) в иммунном блотинге с антигенами ВИЧ-1 проводится исследование с антигенами ВИЧ-2.
При получении положительных результатов иммунного блотинга делается заключение о наличии в исследуемом материале антител к ВИЧ.
При получении отрицательного результата анализа в ИБ выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ.
При получении неопределенного результата проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ через 3 месяца и при сохранении неопределенных результатов - через 6 месяцев.
Если через 6 месяцев вновь будут получены неопределенные результаты, а у пациента не будут выявлены факторы риска заражения и клинические симптомы ВИЧ-инфекции, результат расценивается как ложноположительный. (При наличии эпидемиологических и клинических показаний серологические исследования повторяются по назначению).
Особенностями серологической диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, является то, что как у зараженных, так и у незараженных детей в первые 6-12 месяцев жизни обнаруживаются антитела к ВИЧ материнского происхождения, которые затем могут исчезать. Критерием, свидетельствующим о наличии у ребенка ВИЧ-инфекции, является обнаружение у него антител к ВИЧ в возрасте 18 и более месяцев. Отсутствие антител к ВИЧ у ребенка в возрасте 18 месяцев, рожденного от инфицированной ВИЧ матери, является критерием, свидетельствующим против наличия у него ВИЧ-инфекции.
С целью диагностики используются также методы обнаружения вируса, его антигенов или генного материала (специфических нуклеотидных последовательностей).
Среди антигенов ВИЧ чаще всего пытаются обнаруживать белок p24 ВИЧ-1, однако эта методика не нашла должного применения в эпидемиологических исследованиях, так как большая часть антигена не связана антителами только в начальный период заболевания и в период развития клинически выраженного иммунодефицита. В связи с этим метод представляет интерес для выявления больных в ранних стадиях ВИЧ-инфекции и иногда для оценки прогрессирования заболевания (см. ниже). Обнаружение этого антигена у ребенка, родившегося от ВИЧ-инфицированной матери, может служить критерием при установлении у него диагноза ВИЧ-инфекции. Не исключено, впрочем, что могут быть разработаны модификации метода, позволяющие расширить его диагностическое применение.
Выделение и идентификация культуры ВИЧ является достоверным признаком инфицирования ВИЧ, однако, этот метод малодоступен, требует длительного времени, высокой квалификации исполнителей, специального оборудования. Поэтому выделение вируса и его идентификация проводятся только в научных. Современные методы позволяют выделять ВИЧ в подавляющем большинстве, если не в 100% случаев истинной ВИЧ-инфекции, если, конечно, исследователи имеют соответствующие навыки, проявляют упорство (то есть делают многократные попытки выделения ВИЧ) и обладают большими денежными средствами, которые обеспечивают возможность использовать специальную вирусологическую лабораторию, оснащенную современной техникой и реактивами. Последнее условие, однако, существенно ограничивает использование этого подхода, и он обычно применяется только в ограниченных научных целях.
Следует помнить, что отрицательные результаты однократной попытки выделить ВИЧ, не имеют никакого практического значения, так как такие попытки выделения ВИЧ бывают удачными лишь в половине случаев. Сообщение лаборатории о том, что ВИЧ удалось выделить, имеет большее диагностическое значение, однако все лаборатории делают свои умозаключения о том, что выделен именно ВИЧ, на основании своих проверочных тестов, и правильность этой проверки врач может оценивать лишь по степени своего доверия к данной вирусологической лаборатории. Мы неоднократно отмечали, что некоторым вирусологам удавалось якобы «выделить ВИЧ», из материалов, не имеющих никакого отношения к больным ВИЧ-инфекцией, например, от больных ветряной оспой или эпидемическим паротитом, или даже от здоровых ( правильнее - не инфицированных ВИЧ) людей.
Существенной проблемой является также то, что идентификация вируса занимает сравнительно длительное время.
Наконец, в последние годы большой популярностью стал пользоваться метод обнаружения генного материала ВИЧ методами репликации (амплификации, размножения) специфических генных последовательностей, часто объединяемых под названием одного из вариантов этого метода «полимеразная цепная реакция» (ПЦР). Как недавно убедительно показано в обзоре современного состояния дел в развитии этой техники диагностики при ВИЧ-инфекции, сделанном в конце 1998 г. Г.А. Шипулиным с соавторами (9), известные модификации ПЦР для диагностики ВИЧ-инфекции достигают чувствительности лишь в 98%, то есть выявляют лишь 98% проб от ВИЧ инфицированных лиц, что существенно ниже, чем при использовании ИФА (до 99,9%). То есть они в 1998 г. были способны выявлять лишь 980 инфицированных из 1000, а не 999, как лучшие образцы ИФА. По этой причине они не могут использоваться и как подтверждающие тесты, так как будут давать заведомо больше ложноотрицательных результатов, чем иммуноблот. Можно лишь не согласиться с авторами, которые приписывают своей любимой реакции специфичность, «близкую к 100%», хотя на самом деле эта реакция на практике ведет себя как чересчур «чувствительная» к внешним колебаниям, и в неумелых руках, и в недостаточно хорошо оборудованных лабораторных условиях дает немалое количество неспецифических (ложноположительных) реакций. Специфичность ПЦР также зависит от подбора используемых в ней ингредиентов, в особенности, так называемых «праймеров», которые должны имитировать «генные последовательности ВИЧ», но далеко не всегда могут быть точно подобраны. Неудачный подбор может приводить, в частности, к тому, что такие тесты могут с разным успехом выявлять разные субтипы ВИЧ-1, например, выявлять субтип B и не выявлять субтип A и G т.п. Впрочем, разработка этих методик идет быстрыми темпами и не исключено скорое появление более качественных наборов стандартных реактивов. На практике врачи должны учитывать операционные характеристики предлагаемых им диагностических тестов, изначально предполагая, что их полевая (практическая) ценность может быть существенно ниже заявляемой производителями.
Теоретическое преимущество ПЦР состоит в том, что она способна выявлять ВИЧ-инфекцию в инкубационном и раннем клиническом периоде, когда антител еще может не быть. Однако, она пока не всегда может выявлять инфицированных в более позднем периоде инфекции. Это в будущем, возможно, будет иметь значение и при попытке диагностики ВИЧ-инфекции у лиц, получающих противоретровирусную терапию, когда уровень ВИЧ в крови значительно снижается. Совместное использование двух методик, которое могло бы быть выходом из создавшейся ситуации - ИФА и ПЦР, к сожалению, сделает исследования значительно дороже, тем более, если они осуществляются в массовом масштабе.
В настоящее время в России разрешены к применению тест-системы для обнаружения генного материала ВИЧ. Эти тест-системы могут давать положительные реакции на наличие маркеров ВИЧ в ранних стадиях ВИЧ-инфекции. Пока опыт их использования нельзя считать достаточно большим рекомендуется придерживаться следующей тактики из применения. При обнаружении положительных результатов на ВИЧ-инфекцию в тест-системах данных типов, следует провести обследование на антитела к ВИЧ. При обнаружении антител следует придерживаться стандартной диагностической тактики. При положительных результатах обследования на генные или антигенные маркеры ВИЧ и отрицательных результатах обследования на антитела к ВИЧ следует повторить обследования на антитела к ВИЧ через 3 и 6 месяцев.
Пока метод амплификации сравнительно успешно применяется только для диагностики ВИЧ-инфекции у детей, родившихся от ВИЧ инфицированных матерей. Как известно, диагностика ВИЧ-инфекции у них затруднена наличием на первом году жизни материнских антител к ВИЧ в крови и здоровых и зараженных детей. Но и здесь использование генноинженерных методов имеет ограниченную ценность. По современным данным, положительный результат определения генного материала ВИЧ у ребенка в первый месяц жизни действительно свидетельствует о ВИЧ-инфекции с 50-95% вероятностью, а отрицательный - с 3-10% вероятностью свидетельствует об отсутствии ВИЧ-инфекции. Таким образом, говоря практическим языком, получается, что ребенок в возрасте до 1 месяца с положительной реакцией ПЦР возможно инфицирован, а ребенок с отрицательной реакцией - весьма вероятно не инфицирован. Повторные исследования материалов от ребенка, сделанные через 1-2 месяца, если их результат совпадает с первым, увеличивают точность диагноза, но не дают абсолютного результата. Положительный результат ПЦР, полученный в возрасте старше 4 месяцев (ближе к 6 месяцам), имеет большее диагностическое значение, в первую очередь, потому, что концентрация ВИЧ в это период возрастает. На информативность результатов этой реакции в ранние сроки может влиять путь заражения ребенка (внутриутробно, перинатально или при грудном вскармливании), который, естественно, определяет и срок заражения. Вполне понятно, что у детей, заразившихся при грудном вскармливании, результаты исследования ПЦР, взятые в первые дни жизни, скорее всего, будут отрицательными. Таким образом, складывается впечатление, что применение ПЦР для выявления ВИЧ-инфекции у детей тоже пока не является очень надежным способом ранней диагностики, и, возможно, не имеет такого большого прикладного будущего, как ожидалось. Мы полагаем, что ко всем детям, родившимся от ВИЧ инфицированных матерей, необходимо применять меры профилактики, например, химиопрофилактику ВИЧ-инфекции, а тем более, отмену грудного вскармливания, независимо от предварительных результатов ПЦР. Специалисты США рекомендуют превентивную антиретровирусную терапию для профилактики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей ВИЧ инфицированных матерей без специальных ссылок на результаты ПЦР-диагностики (10). Вероятно, противоретровирусная химиопрофилактика ВИЧ-инфекции может влиять на эффективность диагностики, так как при ней уровень концентрации ВИЧ, естественно, может снижаться ниже определяемого уровня.
Впрочем, реакции типа ПЦР уже нашли свое место в диагностике ВИЧ-инфекции. Сейчас они успешно используются для прогнозирования течения заболевания и оценки эффективности терапии, определения количественных показателей присутствия ВИЧ в биологических жидкостях, о чем мы подробнее пишем в следующих главах.
При ВИЧ-инфекции могут наблюдаться такие неспецифические изменения лабораторных показателей, как снижение количества CD4-лимфоцитов, увеличение процентного содержания CD8-лимфоцитов, повышение уровня бета-2-микроглобина, неоптерина, возрастание количества иммуноглобулинов и другие. Обнаружение этих признаков является дополнительным свидетельством в пользу диагноза ВИЧ-инфекции. Однако эти изменения могут отсутствовать при определенных стадиях ВИЧ-инфекции (см. ниже), иметь индивидуальные колебания у разных пациентов, встречаться при других заболеваниях.
Как уже было подчёркнуто выше, диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два последовательных этапа, имеющих самостоятельные цели:
Установление собственно диагноза ВИЧ-инфекции, то есть определение состояния инфицирования ВИЧ.
Установление клинического диагноза, то есть определение стадии и характера течения ВИЧ-инфекции.
Своевременная констатация состояния инфицированности ВИЧ имеет большое значение для проведения противоэпидемических мероприятий и ведет к важным правовым и социальным последствиям. Уже при возникновении малейшего подозрения на заражения ВИЧ часто необходимо принимать некоторые неотложные меры по предупреждению возможного распространения ВИЧ, например, исключить возможность переливания подозрительной на заражение крови. При обнаружении ВИЧ-инфицированного он отстраняется от донорства, подвергается консультированию, которое может снизить дальнейшее распространение ВИЧ. Проводимое при его выявлении эпидрасследование позволяет выявить пути передачи ВИЧ, которые в некоторых случаях (например, при внутрибольничных вспышках) можно быстро прервать. Эпидрасследование выявляет другие источники инфекции, а также и лиц, подвергающихся риску заражения, которые в свою очередь подвергаются обучению или другим формам воздействия, снижающим вероятность распространения инфекции.
Установление клинического диагноза проводится с целью оказания адекватной состоянию больного медицинской помощи. Эта помощь должна включать в себя не только медикаментозную терапию, но и психологическую поддержку. Последнее мероприятие также имеет некоторое противоэпидемическое значение.
Независимо от цели, диагностика ВИЧ-инфекции осуществляется путем комплексной оценки данных клинического обследования, результатов эпидемиологического расследования и лабораторных исследований.
При этом, в первое время по возникновении подозрения на обнаружение случая ВИЧ-инфекции, как у инфекциониста, так и эпидемиолога может просто не хватать данных для вынесения окончательного диагноза. Результаты всех лабораторных исследований могут быть получены только через несколько недель, а полные эпидемиологические данные могут быть и вовсе никогда не получены. Достаточно часто у опытных специалистов возникают сомнения в ценности или достоверности лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Иногда диагностическое решение приходится принимать и при отсутствии возможности провести даже клинический осмотр, не говоря уже о возможности провести полное клиническое обследование.
|
Скачать 180 Kb.