Экранная библиотека скрининга фагов для идентификации взаимодействующих партнеров по белкам
Абстрактные
Фаговый дисплей представляет собой универсальный метод высокопроизводительного скрининга, используемый для понимания и улучшения химической биологии, будь то производство человеческих моноклональных антител или идентификация взаимодействующих белковых партнеров. Большинство клеточных белков действуют согласованным образом либо путем стабильных, либо переходных взаимодействий. Такие взаимодействия могут быть опосредованы распознаванием мотивов небольшой аминокислотной последовательности на поверхности белка. Отображение фагов может сыграть решающую роль в идентификации таких мотивов. В этом отчете описывается использование фагового дисплея для идентификации мотивов высокой аффинной последовательности, которые могут быть ответственны за взаимодействие с белком-мишенью (приманкой).
Ключевые слова
Отображение фагов Протеин-белковые взаимодействия Высокопроизводительный скрининг Случайный комбинаторный подход
Загрузить протокол PDF
Springer Nature разрабатывает новый инструмент для поиска и оценки протоколов. Выучить больше
1. Введение
Первичные транскрипты эукариотических мессенджеров РНК подвергаются обширным процессам обработки перед их переносом в цитоплазму. Одним из таких событий является добавление хвоста poly (A), широко называемого полиаденилированием или 3'-концевой обработкой. Это событие связано с сложным взаимодействием цис-элементов и транс-действующих белковых факторов [1, 2, 3, 4]. Хотя идентифицированы белковые факторы, которые выполняют полиаденилирование in vitro, этот процесс связывается и интегрируется с другими стадиями биогенеза мРНК in vivo, включая транскрипцию, сплайсинг и терминацию транскрипции [5, 6] посредством белково-белковых взаимодействий. Документация таких взаимодействий не только поможет понять механизм полиаденилирования в более широком контексте экспрессии генов, но также поможет понять регулирование процессов обработки, опосредуемых стимулами развития или клеточной передачи сигналов [6].
Фаговый дисплей представляет собой комбинаторную методику, используемую для идентификации мотивов с высоким сродством к пептиду, которые могут опосредовать белково-белковые взаимодействия. Этот метод влечет за собой выражение и представление всех / большинства возможных комбинаций аминокислот данной последовательности (определенной длины) в виде слияния с белком оболочки бактериофага, как правило, нитевидным фагом, таким как M13. В идеальном случае одна из 20 аминокислот заменяет каждую аминокислоту в заданном положении указанной последовательности случайным комбинаторным образом, чтобы генерировать библиотеку пептидов, представленную фагом. Скрининг такой библиотеки приведет к выбору нескольких пептидных мотивов, которые проявляют высокое сродство к поверхности (эпитопы) белка наживки. Дисплей фага создает физическую связь между фаго-отображаемыми пептидными последовательностями (данной библиотеки) с ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность в пептиде. Таким образом, секвенирование ДНК, соответствующей области слияния белка фагового покрытия, скажет нам последовательность выбранного пептида сродства.
Этот процесс выбора аффинности пептидов, отображаемых фагом, называется панорамированием. Панинирование включает инкубацию библиотеки, содержащей фаг, с иммобилизованным целевым белком (обычно покрытым пластинкой), смыванием несвязанного фага и элюированием специфически связанного фага. Элюированный фаг усиливают и проводят через повторные раунды циклов панорамирования / амплификации, чтобы обогатить пул в пользу пептидов, которые связываются с высокой специфичностью. Связанные пептиды характеризуются секвенированием ДНК либо после каждого раунда, либо после нескольких циклов отбора. Смит [7] с использованием нитевидного фага в качестве экспрессионного вектора изначально представил эту концепцию. С тех пор было опубликовано несколько вариантов метода и связанных с ним приложений (включая исследование белково-белковых взаимодействий) библиотеки фагового дисплея [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18] , Дисплей фага считается одним из универсальных инструментов, используемых для идентификации новых белково-белковых взаимодействий [19]. С помощью фагового дисплея мы смогли идентифицировать точки контакта белка с белком между некоторыми факторами полиаденилирования Arabidopsis [20].
Нитевидный фаг М13 является наиболее часто используемым вектором, потому что, помимо прочего, фаг может переносить вставки генов в несущественных областях, белки оболочки способны отображать чужеродные пептиды без потери инфекционности и могут накапливаться в высокой концентрации в инфицированном бактериальном хосты, как резюмировано Кехо и Кей [21]. Наиболее часто используемыми белками оболочки являются pIII и pVIII в виде слияний или N-концевых слияний с целевой пептидной библиотекой. Однако N-концевые слияния с pIII более толерантны к большим вставкам.
Случайные библиотеки пептидов, выраженные как N-концевые слияния pIII, являются наиболее часто используемыми библиотеками фагового дисплея. Длина пептида может варьироваться от 6 до 43 аминокислот, когда выражается как N-концевое слияние [22]. Структурные ограничения на пептиды также могут быть наложены для получения строгой специфичности последовательности, фланкируя последовательность пептида парой остатков цистеина [23, 24]. Коммерческие библиотеки отображения фагов доступны от различных поставщиков, включая New England Biolabs, Create Biolabs, EMD Millipore и Lucigen. Также могут быть созданы пользовательские библиотеки пептидов и описаны практические советы для их построения [25].
В этой главе описывается адаптация фагового дисплея с использованием коммерческой библиотеки M13. Эта адаптация была использована для идентификации нового белково-белкового взаимодействия в полиаденилирующем комплексе Arabidopsis [20], а также более широкой библиотеки пептидов, которая взаимодействует с другими субъединицами фактора полиаденилирования Arabidopsis (B. Addepalli, S. Rao, KP Forbes et al. , неопубликованные результаты).
2 Материалы
Используйте деионизированную воду (чувствительность 18 МОм см при 25 ° С) и аналитические реагенты для подготовки всех растворов. Автоклав и хранить все реагенты при комнатной температуре (если не указано иное). Соблюдайте все правила утилизации отходов и безопасности при подготовке и утилизации материалов.
1. 1.
E. coli-штамм Rosetta ™ 2 (DE3) для экспрессии рекомбинантных белков
2. 2.
Буфер для лизиса: 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF).
3. 3.
Буфер с высокой концентрацией соли: 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 2 М NaCl, 1 мМ ЭДТА.
4. 4.
Буфер для элюции глутатиона (ГЭБ): 20 мМ восстановленного глутатиона, 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0)
5. 5.
Буфер для элюции мальтозы (MEB): 20 мМ мальтозы, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5)
6. 6.
LB: Растворить 10 г Bacto Tryptone, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl в воде и отрегулировать объем до 1 л. Автоклав в узкой горловинной колбе или бутылке и хранить при комнатной температуре.
7. 7.
Смесь IPTG-Xgal: Смешать 1,25 г IPTG (изопропил-D-тиогалактозид) и Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид) в 25 мл диметилформамида (ДМФА). Хранить раствор в темноте при -20 ° C.
8. 8.
Пластины LB-IPTG-Xgal: LB средний + 15 г / л агар (технический или Bacto). Автоклав, охлаждают до <70 ° C, добавляют 1 мл IPTG / Xgal и выливают в чашки Петри. Хранить пластины при температуре 4 ° C в темноте.
9. 9.
Верхний агароз: Растворить 10 г Bacto Tryptone, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 1 г MgCl2 • 6H2O на 1 л воды и добавить 7 г агарозы. Автоклав, распределить в аликвотах по 100 мл. Хранить в твердом состоянии при комнатной температуре, расплавить среду по мере необходимости.
10. 10.
Раствор тетрациклина: растворить 20 мг на мл этанола. Хранить в темноте при -20 ° C. Перед использованием вихрь.
11. 11.
LB-Tet или соответствующий антибиотик. Пластины: LB-среда + 15 г / л агар (технический или Bacto-сорт). Автоклав, охлаждают до <70 ° C, добавляют 1 мл раствора тетрациклина после встряхивания и выливают в чашки Петри. Хранить пластины при температуре 4 ° C в темноте.
12. 12.
Буфер-связывающий буфер: 0,1 М NaHCO3 (pH 8,6).
13. 13.
Блокирующий буфер: 0,1 М NaHCO3 (рН 8,6), 5 мг / мл BSA, 0,02% NaN3. Фильтр стерилизовать, хранить при 4 ° C.
14. 14.
TBS: 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl. Это также может быть приготовлено в виде раствора 10 ×. Автоклав и хранить при комнатной температуре.
15. 15.
TBST: TBS + 0,1% Tween-20 (об. / Об.)
16. 16.
ПЭГ / NaCl: 20% полиэтиленгликоль-8000, 2,5 М NaCl. Автоклав, хранить при комнатной температуре.
17. 17.
Раствор элюции фага: 0,2 М Глицин-HCl (рН 2,2), 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA)
18. 18.
Раствор нейтрализации: 1 М Трис-HCl (pH 9,1)
19. 19.
Агароза, молекулярная биология
20. 20.
TBE: 45 мМ Трис-борат, pH 8,0, 1 мМ Na-EDTA.
3 Методы
3.1. Подготовка белковых белков (см. Примечание 1)
1. 1.
Растите 10 мл ночной культуры трансформированных клеток Rosetta с соответствующей рекомбинантной плазмидой (см. Примечания 1 и 2, см. Главу 9 для более подробной информации).
2. 2.
Используйте 1-3 мл вышеуказанной ночной культуры, чтобы инокулировать от 200 мл до 1 л бульонной среды LB с соответствующими количествами антибиотика и расти при 37 ° С в течение 3-5 часов. Нарисуйте 1 мл культур для измерения OD при 600 нм между этими периодами времени.
3. 3.
Как только OD600 достигает 0,7-0,8, индуцируют продуцирование слитого белка путем добавления 120-200 мкл 1 М IPTG, чтобы получить конечную концентрацию 0,6-1 мМ для культуры 200 мл. Оптимальное время и температура индукции определяются эмпирически для каждого белка. Обычно достаточно 2-3 ч индукции при температуре от 25 до 37 ° С.
4. 4.
После индукции собирают клетки центрифугированием в течение 5 мин при 6000 × g и ресуспендируют в 5 мл буфера для лизиса. Клетки могут быть заморожены при -80 ° С для длительного хранения на этой стадии.
5. 5.
Нарушать клетки ультразвуком (три всплеска, 30 с в каждой в холодной комнате) и удалять мусор путем центрифугирования (12 000 × г / 15 мин). Клетки также можно осторожно лизировать лизоцимом (2 мг / мл) при 4 ° С перед центрифугированием.
6. 6.
Пропустите лизат через фильтр 0,42 мкм для удаления частиц (см. Примечание 3).
7. 7.
Упакуйте 1-2 мл объема слоя соответствующей смолы (глутатион-сефароза для GST, амилоза для MBP) в одноразовой колонке (аналогично колонкам полипрепаратов # 731-1550EDU, Bio-Rad) и уравновешивают 10 объемами лизисного буфера ,
8. 8.
Пропустите отфильтрованные экстракты через смолу, чтобы обеспечить связывание белка с матрицей столбцов; поток может проходить через столбец, еще раз, чтобы максимизировать выход. Затем сначала промывают колонку 5 мл лизиса, затем 15 мл промывочного буфера и 10 мл буфера для лизиса (см. Примечание 4).
9. 9.
Элюируйте слитые белки с 1-3 мл соответствующего буфера (GEB для GST-слияния, MEB для слитых белков MBP). Собирают фракции 250-500 мкл и оценивают путем измерения поглощения при 280 нм.
10. 10.
Диализные очищенные слитые белки при 4 ° С в течение 12 ч с подходящим буфером для расщепления меток (см. Примечание 5), если необходимо, или буфер связывания с пластинкой, если белок будет использоваться непосредственно для скрининга библиотеки фагов. (См. Примечание 6 для дальнейших комментариев относительно чистоты белка.)
3.2. Типизация фагов (см. Примечание 7)
1. 1.
Единичную колонию подходящего штамма-хозяина E.coli (см. Примечание 8) использовали для инокуляции 10 мл LB и инкубации при 37 ° С при энергичном встряхивании до состояния средней фазы (OD600 0,5)
2. 2.
Расплавьте верхнюю часть агарозы в микроволновой печи и распределите 3 мл (по одному на каждое разведение фага) в стерильные пробирки для культивирования. Агарозу можно хранить в расплавленном состоянии при 45 ° С до использования.
3. 3.
Пластинки LB / IPTG / Xgal, используемые для фагования фага (по одному для каждого разведения), предварительно нагреваются при 37 ° C, чтобы обеспечить быстрый рост бактерий-хозяев.
4. 4.
Обычно десятикратные серийные разведения фага выполняются в LB. Предпочтительные диапазоны разбавления включают в себя 108-1011 для амплифицированных супернатантов культуры фага и 101-104 для неэкранированного пеннирующего элюата. Всегда делайте ставку на использование свежего кончика пипетки для каждого разведения, а также используйте аэрозольные стойкие наконечники пипеток, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
5. 5.
После того, как штамм-хозяин, инокулированный в LB (стадия 1), достигает средней логарифмической фазы, распределяет 200 мкл культуры в микроцентрифужной пробирке для каждого разведения фага.
6. 6.
Для каждой распределенной культуры добавьте 10 мкл разбавленного фага, быстро вихрь и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
7. 7.
Перенесите инфицированные клетки в верхнюю агарозу в культуральную трубку, поддерживаемую при 45 ° C, быстро встряхните содержимое и вылейте на предварительно нагретую пластину LB / IPTG / Xgal и позвольте ей равномерно распределить, наклоняя пластину.
8. 8.
Охлаждают содержимое планшета в течение 10 минут, чтобы затвердевать агароза, а затем выдерживают перевернутые пластины в течение ночи при 37 ° C.
9. 9.
Подсчитайте синие бляшки на каждой пластинке, особенно те, которые имеют около 102 бляшек. Фаговый титр получают путем умножения каждого числа с коэффициентом разбавления для данной пластины и обозначается как единицы образования бляшек (pfu) на 10 мкл.
3.3 Фаговое панорамирование
1. 1.
Принесите очищенный белок приманки (подзаголовок 3.1) до концентрации 0,1 мкг / мкл в пластинчатом связующем буфере. Используйте это для покрытия отдельных лунок стерильных 12-луночных планшета из полистирола; для этого добавьте около 700 мкл раствора белка в каждую лунку и многократно закручивайте, чтобы полностью промочить поверхность (см. Примечание 9).
2. 2.
Инкубируйте планшет с белковым раствором в течение ночи при 4 ° С с легким перемешиванием в увлажненном контейнере (обернутый влажными бумажными полотенцами в застежку-молнию). Пластины можно хранить при температуре 4 ° C в этом контейнере до готовности для панорамирования.
3. 3.
Осторожно и быстро вылейте раствор и поверните пластину на чистое бумажное полотенце, чтобы удалить остаточные капли (см. Примечание 10).
4. 4.
Поверните пластины «правая сторона вверх» и заполните каждую колодец блокировочным буфером. Инкубируйте при 4 ° C в течение 1 часа.
5. 5.
Осторожно и быстро отбросьте блокирующий буфер и поверните пластину на чистую бумажную салфетку, чтобы удалить остаточные капли (см. Примечание 10).
6. 6.
Повторно инвертируйте планшет и промывайте каждую лунку, покрывая днище и боковые стороны скважины TBST и осторожно закручиваясь. Отмените промывочный раствор и поверните пластину на чистое бумажное полотенце, чтобы удалить остаточные капли (см. Примечание 10). Быстро перейдите к следующему шагу, чтобы избежать сушки внутреннего пространства.
Для каждой лунки, которая была покрыта белком-приманкой, разбавить приблизительно 2 × 1011 фаг (10 мкл оригинальной библиотеки набора PhD, если она получена из Новой Англии Biolabs), в 700 мкл TBST (см. Примечание 11). Добавьте это к хорошо покрытой лунке и качайте осторожно при комнатной температуре в течение 1 часа.
8. 8.
После 1 ч связывания тщательно и быстро вылейте раствор и переверните пластину на чистую бумажную салфетку, чтобы удалить остаточные капли (см. Примечание 10). Повторно инвертируйте планшет и промывайте каждую лунку, покрывая днище и боковые стороны скважины TBST и закручивая. Отмените промывочный раствор и поверните пластину на чистое бумажное полотенце, чтобы удалить остаточные капли (см. Примечание 10).
9. 9.
Элюируйте связанный фаг, добавив 700 мкл раствора для фагового элюирования и мягко покачиваясь в течение <10 мин. Перенесите элюированный раствор в микроцентрифужную пробирку и нейтрализуйте 105 мкл нейтрализующего раствора.
10. 10.
Усиливают элюированный фаг, добавляя элюат к 20 мл логарифмической культуры выбранного штамма-хозяина фага (см. Примечание 8). Инкубируйте при 37 ° C в течение 4,5 ч при энергичном встряхивании.
11. 11.
Перенесите культуру в конце инкубации в центрифужную пробирку и центрифугу в течение 10 мин при 10000 × g. Восстановите супернатант до новой центрифужной трубки и повторите центрифугирование в течение 10 мин при 10000 g.
12. 12.
Перенесите 80% супернатанта в новую пробирку и добавьте 1/6 объема ПЭГ / NaCl. Инкубируйте при 4 ° C в течение 1-18 часов.
13. 13.
Центрифугируют осажденный фаг при 4 ° С в течение 15 мин при 10000 × g. Декантируют супернатант и кратковременно центрифугируют трубку. Удалите остаточный супернатант с помощью небольшой пипетки.
14. 14.
Ресуспендируют гранулу в 1 мл TBS и центрифугируют суспензию при 6000 × g в течение 5 мин при 4 ° С для удаления остаточных клеток.
15. 15.
Перенесите супернатант в микроцентрифужную пробирку и повторно осадите фаг с 1/6 объема ПЭГ / NaCl. После инкубации на льду в течение 45-60 мин центрифугируют в течение 10 мин при 10000 × g. Декантируют супернатант и удаляют последние следы остаточного супернатанта с помощью микропипетки.
16. 16.
Ресуспендируют гранулу в 200 мкл TBS и добавляют NaN3 до конечной концентрации 0,02%. Удалите нерастворимый материал с коротким вращением с максимальной скоростью в микроцентрифуге.
17. 17.
Оцените тигр фага, как описано в подзаголовке 3.2.
18. 18.
Повторите шаги 1-17 этого раздела до тех пор, пока не будет достигнута желаемая степень обогащения (см. Примечание 12).
19. 19.
Определите титр конечного элюата; эти бляшки могут непосредственно использоваться для секвенирования (см. Примечание 13). Хранить элюат при температуре 4 ° C.
3.4. Характеристика очищенного аффинностью фага
1. 1.
Если это не было сделано, амплифицируйте очищенный фаг, как описано в подзаголовке 3.3, этап 10. Для этого разбавьте ночную культуру хозяина E.coli (см. Примечание 8) в 100 раз в LB и добавьте 10 мкл незакрепленный элюатный фаг до 1 мл разбавленной культуры. Инкубируйте при 37 ° C со встряхиванием в течение 4,5-5 часов.
2. 2.
Перенесите культуры в микроцентрифужную пробирку и осадите клетки в течение 30 с с максимальной скоростью в микроцентрифуге. Перенесите 80% супернатанта (избегая клеточного осадка) в свежую микроцентрифужную пробирку. Это усиленный запас (см. Примечание 14).
3. 3.
Полученная библиотека, присутствующая в этом усиленном материале, может характеризоваться секвенированием с высокой пропускной способностью (см. Примечание 15). Для этого амплифицируйте 1 мкл запаса в 25 мкл ПЦР-реакции с использованием праймеров, которые предназначены для амплификации этой части фагового генома, который включает вставленные чужеродные последовательности ДНК (фиг.1, см. Примечание 16).
Открыть картинку в новом окне
рисунок 1
Иллюстрация общей конструкции праймера для характеристики фагового аффинно очищенного. Наверху изображен мультфильм о структуре нитчатого фага (например, М13). Субъединица белка оболочки, вокруг которой построена комбинаторная библиотека (такая как pIII субъединица M13), показана коричневой. Отдельные пептиды, присоединенные к субъединице белка оболочки, представлены в виде красных или зеленых символов. Под иллюстрацией фага изображены последовательности ДНК, окружающие местоположение тех, которые кодируют различные пептиды; цветовое кодирование соответствует таковому для белков, показанных выше. ПЦР-праймеры, полученные из последовательностей белка оболочки, представлены в виде стрелок (см. Примечание 16) и праймеры, используемые для адаптации продуктов ПЦР для высокопроизводительного секвенирования в виде гибридных стрелок, причем синие сегменты представляют последовательности адаптивных последовательностей адаптеров (цветная цифра онлайн)
4. 4.
Отделите продукты ПЦР на агарозном геле и запустите в TBE (см. Примечание 17). Гель-очистите продукты амплификации с помощью соответствующего набора (см. Примечание 18). Например, следуйте инструкциям (точно) для системы очистки геля Qiagen и элюируйте очищенный продукт в 50 мкл буфера для элюции поставщика.
5. 5.
Добавьте 1 мкл очищенного продукта ПЦР в 25 мкл ПЦР-реакционную смесь, содержащую праймеры, предназначенные для добавления адаптеров с высокой пропускной способностью для секвенирования на продукты ПЦР (см. Примечание 16). Умножайте эти продукты на минимальное количество циклов (5-15, в зависимости от концентрации продукта ПЦР, полученного в s
2. 2.
Рекомбинантные плазмиды, которые кодируют меченые слитые белки, трансформируются в клетки Rosetta ™ 2 (DE3) для производства белка. Эти клетки подают тРНК для перевода редких кодонов, чтобы обеспечить улучшенную экспрессию эукариотических белков.
3. 3.
Фильтрация помогает поддерживать равномерный поток на последующих этапах хроматографии без забивания колонок.
4. 4.
Моющие растворы могут быть подвергнуты скринингу на присутствие целевого белка приманки с помощью SDS-PAGE, если это необходимо. Это помогает определить оптимальную процедуру для разных белков.
5. 5.
Если желательно, аффинная метка (GST или MBP) может быть расщеплена с использованием подходящего фермента (агароза тромбина / тромбина в случае GST-слияния, фактор Xa для MBP в соответствии с рекомендациями производителя) и подвергается второму аффинному хроматографированию для удаления тег близости.
6. 6.
Чистота белка наживки, особенно те, из которых была расщеплена бирка, может быть дополнительно усилена ионообменной хроматографией. Хотя детали будут варьироваться в зависимости от характера приманки (и поэтому здесь не описываются), общий подход будет включать выбор подходящей колонки (анион или катионный обмен) и очистку приманки с линейным градиентом (0,025- 2 М) NaCl в буфере для лизиса. Белоксодержащие фракции обычно идентифицируют, контролируя поглощение при 280 нм, и чистоту белка подтверждают SDS-PAGE. Фракции с чистым белком наживки объединяют и диализуют против пластинчатого связующего буфера.
7. 7.
Необходимо оценить тигр фага для приобретенной или подготовленной библиотеки дисплеев и продолжить раунды обогащения для взаимодействующего фага. Это удерживает множественность инфекции (МВД) менее 1. Низкое МВД необходимо для обеспечения того, чтобы каждая бляшка содержала только одну последовательность ДНК.
8. 8.
Прочный штамм F + (коммерческие штаммы типа ER2738 из New England Biolabs https://www.neb.com/products/e8100-phd-7-phage-display-peptide-library-kit) с быстрым темпом роста идеально подходит для M13. Бактерии-хозяина необходимо высевать на носитель, чтобы он был выбран для фактора F. Кроме того, для инокуляции среды для амплификации и поддержания фага необходимо использовать отдельные колонии, а не глицериновый запас.
9. 9.
Достаточное смачивание пластины необходимо для обеспечения оптимального связывания белка с пластиной из полистирола.
10. 10.
Скорость на этом этапе важна. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать повторной инверсии и другой обработки пластины после первоначальной инверсии и установки на бумажное полотенце.
11. 11.
Если слитый белок будет использоваться непосредственно для панорамирования, то фаг сначала инкубируют с белком тега (GST, MBP или другим подходящим белком) в течение 15 минут перед добавлением к пластинам из полистирола с покрытием, покрытым белком.
12. 12.
Последовательные раунды панорамирования могут быть выполнены с 109 pfu входного фага на этапе 7, если титр текущего элюатного фага слишком низок. Как правило, достаточно трех раундов панорамирования, чтобы можно было идентифицировать взаимодействующие пептиды.
13. 13.
Плиты с бляшками, которые следует использовать для секвенирования, не следует инкубировать при 37 ° C в течение более 18 часов; более длительный период приводит к удалению и другой потере фага.
14. 14.
Кратковременное хранение для этого составляет 4-5 недель при 4 ° C. Запасы следует разбавлять стерильным глицерином 1: 1 для длительного хранения при -20 ° C.
15. 15.
Приспосабливая усиленную библиотеку для высокопроизводительного секвенирования ДНК, устраняется трудоемкий и дорогостоящий процесс характеризации отдельных фаговых клонов. Население вставок в очищенном фаге может быть адаптировано для секвенирования с использованием любого из нескольких современных платформ путем повторной амплификации продуктов ПЦР в течение 10-15 циклов с использованием гибридных праймеров, которые состоят из адаптеров, специфичных для платформы, фланкирующих специфичные для фага библиотеки последовательности. Эта стратегия проиллюстрирована на рисунке 1. Этот подход легко адаптируется для секвенирования на инструментах 454, Ion Torrent и MiSeq. Важно отметить, что для полной характеристики обогащенной библиотеки фагов требуется всего несколько тысяч однострочных последовательностей, состоящих из 100 нц (или меньше).
16. 16.
ПЦР-реакции используют стандартные протоколы и ферменты из многих источников. «Стандарт», а также ферменты с горячим стартом. Грунтовки предназначены для усиления вставки. Для библиотек M13 pIII (как описано здесь) праймеры представляют собой 5'-AAAGCCTCTGTAGCCGTTGC-3 '(прямой праймер) и 5'-AGCCACCACCCTCATTTTCTC-3' (обратный праймер). Чтобы адаптировать продукты ПЦР для высокопроизводительной последовательности, к 5'-концам этих прямых и обратных праймеров добавляются соответствующие адаптеры последовательности, как показано на фиг.1. Конкретные последовательности здесь не приводятся, но могут быть получены от поставщика последовательности или основного объекта. (Различные последовательности будут использоваться для наиболее распространенных платформ - Miseq, Ion Torrent и 454.)
17. 17.
Концентрация агарозы для этих гелей будет определяться размером интересующих продуктов ПЦР. Обычно используют 1% (мас. / Об.) -2% (мас. / Об.) Гелей.
18. 18.
Гель-очистка продуктов ПЦР может быть в |
Скачать 28.15 Kb.