МИКРА. Физиология микробов
 Скачать 1.37 Mb.
|
|
Физиология микробов - раздел микробиологии изучающий жизнедеятельность, питание, дыхание, рост и размножение бактерий и других прокариот. Изучение физиологии микробов лежит в основе разработке методов культивирования бактерий, получения чистых культур. Изучение физиологии патогенных бактерий важно для понимания патогенеза заболеваний, разработке новых методов диагностики, лечения и профилактики заболеваний. Изучение физиологии микробов привело к прорыву в понимании природы заболеваний, лечения и профилактике. В 1856 г. к доктору химии Луи Пастеру обратились за помощью французские виноделы. Приготовленное ими в чанах вино прокисало. Пастер нашел причину - палочковидные бактерии, которые сбраживали виноградный сахар до молочной кислоты, а не до спирта, как это делали дрожжи. Эти бактерии получили название молочнокислых, или лактобактерий. Но основное - Пастер открыл дыхание без кислорода - брожение. Луи Пастер в работе «Mémoire sur la fermentation alcoholique» доказал, что спиртовое брожение — не просто химическая реакция, как считалось ранее, а биологический процесс, производимый дрожжами. Это легло в основу промышленного виноделия МЕТАБОЛИЗМ – совокупность реакций жизнеобеспечения клетки, происходящих при участии биологических катализаторов – ферментов. КАТАБОЛИЗМ - энергетический метаболизм (расщепление питательных субстратов) АМФИБОЛИЗМ - промежуточный метаболизм (превращения веществ) АНАБОЛИЗМ - биосинтез на рибосомах (построение клетки) с затратой энергии АТФ ФЕРМЕНТЫ – высокоактивные биологически активные молекулы, способные к многократному взаимодействию с определенным субстратом. Простые ферменты состоят только из аминокислот – например, пепсин, трипсин, лизоцим. Сложные ферменты (холофермены) состоят из белковой части – Апофермента и небелковой части кофактора (простетической группы) Химически кофермент и простетическая группа – это витамины или комплексные соединения металлов. Полноценный белок называется ХОЛОЭНЗИМ. Апофермент и кофактор при объединении образуют холоэнзим. Если кофактор является органической молекулой, то он называется коферментом. СУБСТРАТ – питательные вещества, поступающие в клетку и участвующие в реакциях метаболизма, являющихся точкой приложения действия ферментов. Под действием ферментов субстраты расщепляются и образуются метаболиты – промежуточные или конечные продукты метаболизма, образуются в результате последовательных ферментных реакций. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД - метод диагностики инфекционных заболеваний бактериальной природы, основанный на выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных и др. свойств. Среды для культивирования микроорганизмов должны соответствовать условиям: быть питательными (СОДЕРЖАТЬ В ЛЕГКОУСВОЯЕМОМ ВИДЕ ВСЕ НЕОБХОДИМЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов – Рн ( Оптим среда для микроорганизмов это СЛАБОЩЕЛОЧНАЯ – 7,2 – 7,4) + БУФЕРНЫЕ СИСТЕМЫ, УТИЛИЗИРУЮЩИЕ ПРОДУКТЫ МЕТАБОЛИЗМА И ПОДДЕРЖИВАЮЩИЕ ПОСТОЯННУЮ ph) быть изотоничными ( ОСМОТ ДАВЛ клетки=ОСМОТ Давл раствора) 0,5% раствор NaCl быть стерильными (посторонние микроорганизмы мешают росту и развитию изучаемых колоний, изменяют свойства среды) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом быть по возможности унифицированным (содержать постоянное количество определённых ингридиентов) Питательные среды бывают Жидкие Полужидкие Плотные Жидкие среды готовят на основе пептона и мясного бульона. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар (Вальтер Хессе) или желатин (Роберт Кох) Агар-агар - полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар плавится при 80-100° С, застывает при 40-45° С. Желатин - белок животного происхождения. При 25-30° С желатиновые среды плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество - приин их росте среда разжижается. Также в качестве плотных сред используют картофель, свернутые яйца и свёрнутую сыворотку крови, среды с силикогелем SiO2 и керагенаном ( выводят из красных водорослей). Чащу используются сухие питат среды, растворимые в воде Порошкообразные Водорастворимые капсулы Гранулированные формы ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ В МИКРОБИОЛОГИИ. КЛАССИФИКАЦИЯ ПО НАЗНАЧЕНИЮ ПРОСТЫЕ СРЕДЫ - пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов, неприхотливых к составу, и применяются как основа для специальных питательных сред для более требовательных видов патогенов. Примеры: Мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, бульонный агар Хоттингена, питательный желатин и пептонную воду. СЛОЖНЫЕ СРЕДЫ - применяют в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых средах, прибавляя к простой среде кровь, сыворотку, углеводы. Примеры: кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон, асцитический бульон, асцит-агар и другие. УНИВЕРСАЛЬНЫЕ - на них микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно благодаря большому количеству питательных добавок – аминокислот, витаминов, факторов роста; для патогенов важно наличие компонентов крови – гемоглобина или гемина, менадиона, цельных или гемолизированных эритроцитов Примеры: кровяной агар, шоколадный агар. гемин-агар, синтетические среды.  Добавки к питательным средам: Базовая питательная среда (основа) Селективные  + Добавки (витамины, факторы роста, индикаторы, антимикробные компоненты) для выделения: Грамотрицательных анаэробов Плесневые грибы Клостридии Бациллы Неспоровых анаэробов Кампилобактерий Добавка с полимиксином Добавка с сульфадиазином и др. Неселективные  Компоненты: Пептон бактериологический Солодовый экстракт Соевый пептон Агар бактериологический Гемоглобин Гемин Казеиновый пептон Кровь Сыворотка СЕЛЕКТИВНЫЕ (ЭЛЕКТИВНЫЕ) СРЕДЫ - на них одни микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно, чем другие виды бактерий благодаря селективным добавкам (желчь, краски, антибиотики и др.), которые способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. Примеры: Грам (+) бактерии – трифенилметановые красители (кристаллический фиолетовый), хлористый натрий 7,5% для стафилококка, 1 % щелочная пептонная вода (Ph = 8) - для холерных вибрионов, сывороточные среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии, среды Плоскирева, Левина – для возбудителей дизентерии, Мюллера - для тифо-паратифозных бактерий (сальмонелл). ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ- группа сред, которые позволяют определить биохимические свойства микроорганизмов и провести их дифференциацию по видовой принадлежности. Принцип построения среды основан на том, что разные бактерии отличаются биохимической активностью и имеют разный набор ферментов, расщепляющих субстрат питательной среды. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств. В состав ДД среды входят: 1)Основная питательная среда, 2) определенный химический субстрат (отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма и 3)цветной индикатор (изменение окраски которого говорит о биохимической реакции и наличие данной ферментной системы) Примеры: Среды Гисса (пестрый ряд) с углеводами и индикатором, среда Эндо, Левина, Плоскирева, Ресселя.ма ДД среды 4 основные группы: Способность расщеплять белки Способность расщеплять углеводы и спирты Способность обесцвечивать красители Способность усваивать определенные вещества Среда Эндо – позволяет определить штаммы сбраживающие лактозу от штаммов, не обладающие таким свойством. Основные компоненты среды – питательный агар, углевод ЛАКТОЗА, основный фуксин, обесцвеченный сульфитом. Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы не сбраживающие лактозу образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида, он реагирует с сульфитом и образуется красная окраска соответствующей колонии. Среда Левина – среда с эозином и метиленовым синим, в качестве индикатора содержит эозин и метиленовый синий, исходно окрашена в черно-синий-цвет. Колонии, обладающие свойством брожения окрашиваюися в метиленовый синий. ХРОМОГЕННЫЕ СРЕДЫ – современная группа сред, которые позволяют выявить специфическую ферментативную активность микроорганизмов, характерных для группы или для отдельного вида микроорганизма. Включают хромогенные, флюорогенные субстраты для выявления специфических ферментативных активностей микроорганизмов, характерных для определённых колоний. Содержащийся фермент метаболизирует бесцветный хромогенный субстрат, образуя окрашенный продукт реакции. Хромогенная среда контрастно изменяет цвет при обнаружении исследуемого микроорганизма. ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДЫ - группа сред, которые предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов от момента взятия биоматериала до посева для диагностики. Среда не содержит питательных веществ, но содержит буферные системы, которые не дают бактериям активно размножатся, сохраняя их жизнеспособность до 72 часов. Это CVTR (вирусология) Эймса (аэробы и анаэробы) Кери-Блэйр (аэробы и анаэробы) Стюарт (прихотливые микроорганизмы) Ди-Ингли (нейтрализация антисептиков) ДВУХФАЗНАЯ СРЕДА – система с комбинацией 20\7 мл агара (МПА или сахарный агар(твёрдая фаза), омываемого 40\20 мл стерильный бульона. Бульонные среды богаты факторами роста, что позволяет выращивать как факультативные, так и облигатные анаэробы. Предназначены для быстрого и эффективного размножения гема культур и их предварительной идентификации. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ (КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ) МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ. ТЕХНИКА ПОСЕВА НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Посев производится на плотные или жидкие питательные среды. Посев производится с помощью бактериологической петли либо пастеровской пипетки. Все манипуляции связанные с посевом (пересевом) микробных культур производятся над (рядом) с пламенем горелки. Перед посевом, петлю, сначала, прокаливают над пламенем горелки, затем остужают (обычно о чистый край питательной среды), и только потом производят манипуляции. Варианты посева: Посев на жидкую среду Посев на скошенный агар Посев на плотную питательную среду Метод Коха (серийные разведения) последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме. Пастеровской пипеткой жидкий материал набирается и переносится в среду до истощения смеси бактерий, чтобы на плотной среде получить изолированные колонии разных типов. Виды посевов Сплошной посев (газоном) – когда в инокулеме мало микробов или нужно получить сплошной рост для постановки антибиотикограммы. Единичный сектор Спиральный посев ( используют ПРИБОР ДЛЯ СПИРАЛЬНОГО ПОСЕВА С АВТОМАТИЧЕСКИМ СЕРИЙНЫМ РАЗВЕДЕНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ВЗВЕСИ) Значение ПИГМЕНТОВ для бактерий Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов. Энергетическое депо для клетки. Пример: зеленый пигмент цианобактерий учувствует в фотосинтезе. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД Преимущества: Высокая чувствительность Высокая достоверность идентификации Возможность выбора препаратов для этиотропной терапии Возможность установления эпидемиологической взаимосвязи между разрозненными случаями заболеваний Определение чувствительности бактерии к антибиотику, что поможет подобрать необходимый препарат для этиотропной терапии. Недостатки: Большая продолжительность исследования (от 3-х дней до 2-х месяцев) Есть некультивируемые или трудно культивируемые возбудители Высокая стоимость исследования, связанная с подбором специальных и не всегда доступных: питательных сред, реактивов, оборудования Методы культивирования микробов Культивирование производят на различных средах в термостате при температуре 37 градусов, бактерии растут и размножаются, пока не израсходуют весь запас питательных веществ в среде и она не истощится, после чего клетки отмирают. Непрерывное культивирование- это метод при котором используется открытая система с возможностью подачи свежей питательной среды и вывода из реактора накопленной биомассы. Регулирование процесса проводится по принципу: хемостата – по лимитирующему субстрату , турбидостата – по биомассе Периодическое культивирование – метод, использующийся при классическом бактериологическом методе. Используется закрытая система. Питательные вещества не вводятся в систему и продукты обмена не убираются. Система проходит несколько стадий развития. Стадии развития
|