Биология клетки. Биология 1. К настоящему времени Вы заработали баллов 0 из 0 возможных
 Скачать 45.09 Kb.
|
Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканейДля изучения химического состава биологических структур - локализации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма применяют специальные методы исследования. Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и органов - ДНК, РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для контроля специфичности реакции часто применяют соответствующие ферменты. Например, для выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин - краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах. Сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать локализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях. Для изучения макромолекул клеток используют очень чувствительные методы с применением радиоактивных изотопов и антител, позволяющие обнаружить даже небольшое содержание молекул (менее 1000). Радиоактивные изотопы при распаде ядра испускают заряженные частицы (электроны) или излучение (например, гамма-лучи), которые можно зарегистрировать специальными приборами. Радиоактивные изотопы используют в методе радиоавтографии. Например, с помощью радиоизотопов 3Н-тимидина исследуют ДНК ядра, с помощью 3Н-уридина - РНК. Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в разных структурах. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов (например, фосфора 32Р, углерода 14С, серы 35S, водорода 3Н) или меченных ими соединений. Радиоактивные вещества в гистологических срезах обнаруживают с помощью фотоэмульсии, которую наносят на препарат и затем проявляют. В участках препарата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки (треки). Этим методом можно определять, например, скорость включения меченых аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и др. Методы иммунофлюоресцентного и иммуноцитохимического анализа. Применение антител. Антитела - защитные белки, вырабатываемые плаз-моцитами (производными В-лимфоцитов) в ответ на действие чужеродных веществ (антигенов). Количество различных форм антител достигает миллиона. Каждое антитело имеет участки для «узнавания» молекул, вызвавших синтез этого антитела. В связи с высокой специфичностью антител в отношении антигенов они могут быть использованы для выявления любых белков клетки. Метод основан на реакциях антиген-антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный состав, который глав- ным образом определяется белками. Для усиления специфичности реакции применяют моноклональные антитела, образуемые линией клеток, - клонами (одна линия - один клон), полученной методом гибридом из одной клетки. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью и в неограниченных количествах. Антитела можно использовать для изучения антигенов как на световом, так и на ультраструктурном уровнях с помощью электронного микроскопа. В клинической диагностике широкое применение получили методы иммуногистохимии на парафиновых срезах. Предложено большое количество молекулярных маркеров и методов обнаружения белков промежуточных филаментов, пролиферативных, дифференцировочных и апоптозных белков в клетках. Для стандартизации обработки препаратов используется иммуностейнер - устройство, с помощью которого все операции проводятся без вмешательства со стороны исследователя. Методы иммунофлюоресцентного и иммуногистохимического анализов широко и эффективно используются в научных исследованиях и в лабораторной диагностике. Продукты реакции можно окрашивать флюоресцирующими красителями и выявлять в люминесцентном микроскопе или использовать специальные наборы реактивов, которые окрашивают исследуемые белки, и анализировать препараты с помощью светового микроскопа. Эти методы применяются для изучения процессов дифференцировки клеток, выявления в них специфических химических соединений и структур. Методы позволяют с высокой точностью охарактеризовать функциональное состояние клеток, выявить гистогенетическую принадлежность и трансформацию клетки при онкологических заболеваниях. Фракционирование клеточного содержимого. Фракционировать структуры и макромолекулы клеток можно различными методами - ультрацентрифугированием, хроматографией, электрофорезом. Подробнее эти методы описаны в учебниках биохимии. Ультрацентрифугирование. С помощью этого метода клетки можно разделить на органеллы и макромолекулы. Вначале разрушают клетки осмотическим шоком, ультразвуком или механическим воздействием. При этом мембраны (плазмолемма, эндоплазматическая сеть) распадаются на фрагменты, из которых формируются мельчайшие пузырьки, а ядра и органеллы (митохондрии, комплекс Гольджи, лизосомы и пероксисомы) сохраняются интактными и находятся в образующей суспензии. Для разделения вышеуказанных компонентов клетки применяют высокоскоростную центрифугу (80 000-150 000 об./мин). Вначале оседают (седи-ментируются) на дне пробирки более крупные части (ядра, цитоскелет). При дальнейшем увеличении скоростей центрифугирования надосадоч-ных фракций последовательно оседают более мелкие частицы - сначала митохондрии, лизосомы и пероксисомы, затем микросомы и мельчайшие пузырьки и, наконец, рибосомы и крупные макромолекулы. При центрифугировании различные фракции оседают с различной скоростью, образуя в пробирке отдельные полосы, которые можно выделить и исследовать. Фракционированные клеточные экстракты (бесклеточные системы) широ- ко используют для изучения внутриклеточных процессов, например для изучения биосинтеза белка, расшифровки генетического кода и др. Хроматография широко используется для фракционирования белков. Электрофорез позволяет разделить белковые молекулы с различным зарядом при помещении их водных растворов (или в твердом пористом матрик-се) в электрическом поле. Методы хроматографии и электрофореза применяют для анализа пептидов, получаемых при расщеплении белковой молекулы, и получения так называемых пептидных карт белков. Подробно эти методы описаны в учебниках биохимии. Изучение химического состава живых клеток. Для изучения распределения веществ и их метаболизма в живых клетках используют методы ядерного магнитного резонанса и микроэлектродную технику. Ядерный магнитный резонанс позволяет изучать малые молекулы низкомолекулярных веществ. Образец ткани содержит атомы, которые характеризуются способностью поглощать энергию на различных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для данного образца составит его спектр ЯМР. В биологии сигнал ЯМР от протонов (ядер водорода) широко используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и др. Для изучения макромолекул внутри живой клетки часто применяют изотопы 3Н, 14С, 32Р для получения сигнала ЯМР и слежения за его изменением в процессе жизнедеятельности клетки. Так, изотоп фосфора используется для изучения мышечного сокращения - изменений содержания в тканях АТФ и неорганического фосфата. Изотоп углерода позволяет с помощью ЯМР исследовать многие процессы, в которых участвует глюкоза. Использование ЯМР ограничено его низкой чувствительностью: в 1 г живой ткани должно содержаться не менее 0,2 ммоль исследуемого вещества. Преимуществом метода является его безвредность для живых клеток. Микроэлектродная техника. Микроэлектроды представляют собой стеклянные трубочки, заполненные электропроводящим раствором (обычно раствор КС1 в воде), диаметр конца которых измеряется долями микрометра. Кончик такой трубочки можно вводить в цитоплазму клетки через плазмолемму и определять концентрацию ионов Н+, Na+, К+, С1-, Са2+, Mg2+, разность потенциалов на плазмолемме, а также производить инъекцию молекул в клетку. Для определения концентрации конкретного иона используют ионселективные электроды, которые заполняют ионообменной смолой, проницаемой только для данного иона. Микроэлектродную технику применяют для изучения транспорта ионов через специальные ионные каналы (специализированные белковые каналы) в плазмолемме. При этом используют микроэлектрод, который плотно прижимают к соответствующему участку плазмолеммы. Этот метод позволяет исследовать функцию одиночной белковой молекулы. Изменение концентрации ионов внутри клетки можно определить с помощью люминесцирующих индикаторов. Например, для изучения внутриклеточной концентрации Са2+ используют люминесцентный белок акварин (выделен из медузы), который излучает свет в присутствии ионов Са2+ и реагирует на изменение концентрации последнего в пределах 0,5-10 мкмоль. Синтезированы также флюоресцентные индикаторы, прочно связывающиеся с Са2+. Создание различных новых типов внутриклеточных индикаторов и современных способов анализа изображений позволяет точно и быстро определять внутриклеточную концентрацию многих низкомолекулярных веществ. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ В настоящее время наряду с качественными методами разработаны и применяются количественные гистохимические методы определения содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность количественных гистохимических (в отличие от биохимических) методов исследования заключается в возможности изучения концентрации химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей. Цитоспектрофотометрия - метод изучения химического состава клетки, основанный на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения монохроматического света, которая зависит от концентрации вещества, производится определение его содержания в клетке. Так, например, определяется содержание ДНК в ядре, РНК и суммарного белка в цитоплазме и др. Цитоспектрофлюориметрия - метод количественного изучения внутриклеточных веществ по спектрам их флюоресценции или по интенсивности флюоресценции при облучении препарата заранее выбранной длиной световой волны (цитофлюориметрия). При этом используются флюорохромы, количественно связывающиеся с веществами клетки (ДНК, РНК, белками и др.). Современные микроскопы - цитофлюориметры позволяют обнаружить в различных структурах малые количества вещества (до 10-14-10-16 г) и оценить локализацию исследуемых веществ в микроструктурах. Интерферометрия. Этот метод позволяет оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетках. С помощью этого метода, например, можно установить суммарное содержание белков в живых и фиксированных клетках. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ СТРУКТУР Полученные изображения микрообъектов в микроскопе, на экране дисплея, на электронных микрофотографиях могут подвергаться специальному анализу - выявлению морфометрических, денситометрических параметров и их статистической обработке. Морфометрические методы позволяют определять с помощью специальных сеток (Е. Вейбеля, А. А. Глаголева, С. Б. Стефанова) число любых структур, площади их сечений, диаметры и др. В частности в клетках могут быть измерены площади ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазматические отношения и др. Существуют ручная морфометрия и автоматизированная морфометрия, при которой все параметры измеряются и регистрируются в приборе автоматически. Все большее распространение получают автоматизированные системы обработки изображений (АСОИз), позволяющие наиболее эффективно реализовать перечисленные выше количественные методы для изучения клеток и тканей. При этом аналитические возможности количественной микроскопии дополняются методами анализа и распознавания образцов, основан- ными на обработке с помощью электронно-вычислительных машин (ЭВМ) информации, извлекаемой из изображений клеток и тканей. По существу можно говорить об устройствах, не только усиливающих оптические возможности зрительного анализатора человека, но и многократно расширяющих его аналитические возможности. Это позволяет получать новую информацию о не выявляемых ранее процессах, моделировать и прогнозировать их развитие в клетках и тканях. Вместе с тем участие в эксперименте ЭВМ требует от исследователя нового подхода к его проведению, владения навыками составления алгоритмов процесса исследования, точности рассуждений и в конечном итоге повышения научно-методического уровня исследования. Таким образом, применение новых методов исследований в гистологии, цитологии и эмбриологии позволяет выяснить общие закономерности организации тканей и клеток, структурные основы биохимических процессов, определяющих функцию конкретных структурных компонентов клетки. |