11 срс микро. (копия) (копия). Кафедра Микробиология, вирусология и иммунология
 Скачать 1.97 Mb.
|
Кафедра «Микробиология, вирусология и иммунология»Прикладная иммунология. Молекулярнобиологические методы: гибридизация, ПЦР,секвенирование ДНКПодготовила: Калита Л. В. Группа:В ЖМОА 09-20 Приняла: Кадырбаева Б. Ш. План: Прикладная иммунология Молекулярнобиологи ческиеметоды Гибридизация ДНК ПЦР секвенирование ДНКПрикладная иммунология – один из разделов иммунологии, которая применяет достижения фундаментальной науки на практике. Прикладная иммунология занимается вопросами разработки методов исследования, основанных на иммунологически феноменах, их апробации, внедрения и использования в различных областях науки и промышленности. Молекулярно-биологический метод позволяет изучать нуклеотидную последовательность ДНК и непосредственно исследовать генотип. Этот метод дает исчерпывающую информацию о генотипе человека и позволяет делать выводы о его признаках и возможных признаках его потомков. Это самый эффективный и быстроразвивающийся метод. Любой человек может произвести молекулярно-биологический анализ и узнать риск развития большинства генетических заболеваний Этот метод позволяет установить риск развития и негенетических заболеваний, таких как сахарный диабет, артериальная гипертензия, и заранее начать их профилактику. Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Гибридизация НК Многие этапы анализа рекомбинантной ДНК основаны на комплементарности взаимодействия цепей нуклеиновых кислот - необходимом условии синтеза ДНК и РНК. Путем нагревания или обработки щелочью двухцепочечную ДНК разделяют на отдельные цепи (денатурированная ДНК). Денатурированную ДНК инкубируют в условиях, обеспечивающих гибридизацию нуклеиновых кислот, то есть повторное образование двухцепочечных молекул путем спаривания нуклеотидов комплементарных цепей. Эта реакция настолько специфична, что гибрид одноцепочечной молекулы ДНК с комплементарной цепью (РНК или ДНК) можно выявить, даже если кДНК составляет лишь одну десятитысячную часть от общего количества ДНК. Метод позволяет различить полностью и частично гомологичные последовательности. ПЦР Основу метода составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. Первоначально проводят отжиг термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Затем среду охлаждают и вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции применяют синтетические праймеры олигонуклеотиды, состоящие из нуклеоти-дов (например, дезоксинуклеотидтрифосфат), взаимодействующие с окончаниями последовательностей и образующие последовательности в оснований. Затем в среду вносят термостабильную tag-полимеразу (по названию бактерии Thermits aquaticus), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праимеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; поскольку tag-полимераза термостабильна, то необходимость в её повторном внесении отсутствует (рис ). ПЦР позволяет получить большие количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза. Метод полимеразной цепной реакции ( ПЦР ) лежит также в основе ДНК-идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и пр. Секвенирование ДНК К концу 60-х годов Ф.Сэнгером были разработан метод секвенирования РНК, получаемой с ДНК- матрицы при помощи РНК-полимеразы. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: "плюс- минус" метод Первым методом прямого ферментативного секвенирования ДНК стал метод, предложенный Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтри фосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирование короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар. Гибридизация (лат. hubrid - скрещивание) нуклеиновых кислот - спаривание одноцепочечных цепей нуклеиновых кислот за счет взаимодействия комплементарных пар А-Т (U) и G-С нуклеотидов для создания помесных гибридных двухцепочечных молекул ДНК (из двух чужеродных) как весьма чувствительный метод выявления определенных (специфических) последовательностей в ДНК или РНК. Заключение В настоящее время известно огромное количество всевозможных инфекционных заболеваний человека.Возбудители этих заболеваний настолько быстро эволюционируют и легко приспосабливаются к изменяющимся условиям среды,что диагностировать их становиться сложнее.Именно поэтому наряду с традиционными морфологическими,иммунологическими и биохимическими методиками применяются и молекулярно-биологические в диагностики для получения более точных результатов. Спасибо за внимание !! |