микроб 14. Кишечная палочка. Возбудители брюшного тифа, сальмонеллёзных токсикоинфекций. Микробиологическая диагностика
 Скачать 2.93 Mb.
|
|
Кишечная палочка. Возбудители брюшного тифа, сальмонеллёзных токсикоинфекций. Микробиологическая диагностика. 1. Общая характеристика семейства Enterobacteriaceae. Энтеробактерии (лат. Enterobacteriaceae) — семейство грамотрицательных палочкообразных споронеобразующих бактерий, факультативные анаэробы. Бактерии этого семейства являются наиболее частыми возбудителями кишечных инфекций. Их объединяет ряд общих признаков. Это короткие, не образующие спор, палочки с закругленными концами, подвижные (перитрихи) или неподвижные, некоторые имеют капсулы. Аэробы или факультативные анаэробы. Характерна отрицательная окраска по Граму. Хорошо растут на обычных питательных средах с мясном экстрактом. На большинстве плотных сред энтеробактерии образуют круглые выпуклые блестящие S- (гладкие) колонии, а также часто обусловленные потерей капсулы плоские, неровные и зернистые R- (шероховатые) формы. Для них характерна ферментация глюкозы (и других углеводов) с образованием кислоты и газа. По отношению к лактозе их делят на лактоза- ферментирующие и лактоза - неферментирующие. Каталаза - положительны, восстанавливают нитраты в нитриты. Семейство энтеробактерий включает более 20 родов, объединяющих более 100 видов бактерий, обитающих в почве, на растениях, входящих в состав микробных биоценозов кишечников животных и человека. Наибольшее значение для человека имеют рода Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus, Klebsiella и др. Для дифференциации родов используют в основном биохимические признаки, для классификации внутри родов и видов - изучение антигенной структуры (О-, Н- и К- антигенов). О- антиген представлен липополисахаридами (ЛПС) наружной мембраны. Штаммы, лишенные О- антигена, образуют R- колонии и обычно авирулентны. Н- антиген - термолабильные белки, имеются только у подвижных (имеющих жгутики) видов. К- антиген - термостабильные полисахариды капсулы и наружной оболочки. В патогенезе поражений, вызываемых энтеробактериями, имеют значение ЛПС (эндотоксин, освобождающийся при разрушении бактерий), различные энтеротоксины, факторы инвазивности и адгезии (жгутики и др.), ферменты патогенности. 2. Микробиология эшерихиозов: культуральные свойства, биохимические свойства, антигенная структура. Escherichia coli – Грамотрицательные, подвижные (перитрихи), образующие микрокапсулу, не образующие спор, короткие палочки Культуральные свойства Является факультативным анаэробом, хорошо растет на простых питательных средах при 37°С и рН 7,2-7,6. Образует гладкие, слегка приподнятые, блестящие, полупрозрачные колонии на плотных питательных средах. в жидких питательных средах образует диффузную мутность и осадок Escherichia coli на мясо-пептонном агаре образуют гладкие, выпуклые, блестящие, полупрозрачные S- колонии Escherichia coli – Лактозоположительные малиново-красные колонии с металлическом блеском на среде Эндо лактозоположительные колонии розового цвета на агаре Мак-Конки темно-фиолетовые колонии на (EMB- агаре ( Eosin Methylene Blue ) (Среда Левина) Негемолитические колонии на кровяном агаре Биохимические свойства Обладает высокой биохимической активностью. Расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу с образованием кислоты и газа. Образует индол Не образует сероводород Некоторые биовары (лактозоотрицательные E.coli) не расщепляют лактозу Антигенная структура • О-антиген состоит из липополисахаридного комплекса и располагается в клеточной стенке. По этому антигену кишечные бактерии делятся более чем на 170 серогрупп. • К-антиген расположен по сравнению с О-антигеном более поверхностно, поэтому живые культуры кишечной палочки не обладают способностью к агглютинации с Оантителами. К-антиген состоит из типов А, В и L, различающихся по чувствительности к температуре и химическим веществам. Каждый штамм имеет только один тип К-антигена. У эшерихий обнаруживают до 100 разновидностей К-антигена, относящихся к типу В. • Н-антиген связан со жгутиками и обнаруживается только у подвижных штаммов. По этому антигену эшерихии делятся на 75 серотипов  3. Классификация энтеропатогенных кишечных палочек: энтеротоксигенные, энтероинвазионные, энтеропатогенные, энтерогеморагические. 4. Факторы патогенности энтеропатогенных кишечных палочек.     5. Бактериологический метод диагностики колиэнтеритов. Диагностика кишечных эшерихиозов (колиэнтеритов) Цель: выделение чистой культуры эшерихии и отличие ее от условнопатогенных представителей нормальной микрофлоры кишечника. Метод: бактериологический. Материал для исследования: фекальные массы. Схема работы: 1-й этап - посев на среду Эндо (Левина); 2-й этап: а) обнаружение окрашенных колоний, микроскопия их по Граму; б) предварительная дифференциация патогенных эшерихии от условнопатогенных (постановка РА на стекле со смесью сывороток к патогенным серогруппам); в) положительно реагирующая в РА колония отсевается на среду Олькеницкого; 3-й этап; а) учет изменения среды Олькеницкого (посинение и разрыв всей среды); б) определение чистоты выделенной культуры; в) определение серовара патогенной эшерихии (путем постановки РА с отдельными ОК-сыворотками на стекле и в пробирках с живой (определение К-антигена) и убитой кипячением (определение О-антигена)культурой; г) проба на индол, подвижность и чувствительность к антибиотикам. Серологический метод - постановка РА с сывороткой больного (на 2-ой неделе заболевания). 6. Микробиология брюшного тифа, паратифов: биохимические свойства, антигенное строение, резистентность, факторы, патогенности. Сальмонеллы являются возбудителями брюшного тифа, паратифов А, В, С и других сальмонеллезов. Морфологические и тинкториальные свойства Сальмонеллы представляют собой короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 0,7-1,5x2-5 мкм Сальмонеллы подвижны за счет перитрихиально расположенных жгутиков На поверхности сальмонелл располагаются пили (ворсинки, фимбрии), служащие для адгезии бактерий к клеткам макроорганизма Сальмонеллы не образуют спор. Некоторые виды сальмонелл (в частности, S. typhi и S. paratyphi C) имеют микрокапсулу Сальмонеллы размножаются поперечным делением Культуральные и биохимические свойства Сальмонеллы являются факультативными анаэробами. Он хорошо растут в аэробных условиях на простых питательных средах при температуре от 4С до 45С и рН 4,1-9,0. Оптимальная температура для роста сальмонелл равна 37ОС. На МПА сальмонеллы образуют серо-белые слегка выпуклые колонии R- и S-формы с голубоватым оттенком диаметром 2-4 мм Вокруг колоний S. schottmülleri на МПА образуется слизистый приподнятый вал, проявляющийся на 2-5 сутки хранения культуры при комнатной температуре. Этот признак используется в дифференциальной диагностике сальмонелл. Дифференциально-диагностическими плотными питательными средами для сальмонелл являются среды Эндо, Плоскирева, Левина, висмут-сульфитный агар (ВСА). В частности, на среде Эндо сальмонеллы формируют серо-белые (бесцветные) или розоватые лактозоотрицательные колонии На среде Плоскирева сальмонеллы также образуют серо-белые (бесцветные) мутноватые лактозонегативные колонии На среде Левина вырастают слегка голубоватые или серо-белые колонии. На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы образуют черные колонии с ртутным блеском (рисунок 20), окруженные черным ободком прокрашенной среды (возбудитель брюшного тифа) или колонии темно-зеленого цвета (паратифозные бактерии). Этот признак является характерным для сальмонелл. В жидких средах сальмонеллы вызывают диффузное помутнение. Сальмонеллы ферментируют глюкозу до кислоты и газа (S. typhi при разложении углеводов не образует газа), продуцируют сероводород, не разлагают лактозу и сахарозу, не разжижают желатин, не образуют индол. Ферментацию углеводов и образование сероводорода можно выявить на среде Клиглера (двухсахарном агаре, содержащем глюкозу и лактозу) или среде Олькеницкого (трехсахарном агаре, содержащем глюкозу, лактозу и сахарозу). В частности, готовая среда Клиглера имеет оранжево-красный цвет. Разложение глюкозы и образование сероводорода сопровождается почернением столбика агара с сохранением красного цвета “язычка” среды Готовая среда Олькеницкого также имеет красный цвет. Ферментация глюкозы проявляется изменением цвета столбика среды на желтый с сохранением красного цвета “язычка” среды. Наличие черного преципитата на границе столбика и скошенной части указывает на то, что сальмонеллы продуцируют сероводород Резистентность Сальмонеллы в воде открытых водоемов, в почве и в комнатной пыли сохраняются до 3 месяцев. Они хорошо переносят низкие температуры, способны размножаться при температуре 4оС. При нагревании до 56°С сальмонеллы погибают через 45-60 минут, при температуре 70оС они погибают через 5-10 минут, при кипячении - мгновенно. Растворы дезинфицирующих веществ (5% фенол, 3% хлорамин, 3% лизол, этиловый спирт) убивают сальмонеллы в течение 2-3 минут. К большинству антибиотиков 16 сальмонеллы чувствительные. Однако в настоящее время отмечается неуклонный рост штаммов, обладающих резистентностью к антибиотикам. В последние годы в странах Азии полирезистентные штаммы возбудителя брюшного тифа составляют до 80% выделенных культур. Антигенная структура Сальмонеллы обладают соматическим О-антигеном и жгутиковым Н-антигеном. Некоторые сальмонеллы обладают Vi-антигеном Соматический О-антиген локализуется в клеточной стенке сальмонелл. Он представляет собой терминальную S-цепочку повторяющихся сахаров, связанных с R-ядром липополисахарида. Терминальные повторяющиеся единицы полисахарида располагаются на поверхности клетки в виде микроворсинок. О-антиген термостабильный, выдерживает кипячение в течение 2,5 часов, инактивируется формалином. Каждый О-антиген сальмонелл обозначается цифрой. В соответствии с содержанием тех или иных О-антигенов все сальмонеллы распределяются на серологические группы, которые обозначаются прописными буквами латинского алфавита (A, B, C, D и т. д.). В каждую серогруппу входят сальмонеллы с одним или несколькими идентичными О-антигенами. Например, серогруппа В включает сальмонеллы с О-антигенами 1, 4, 5 и 12, но специфичным для этой серогруппы является О-антиген 4. Почти все заболевания у человека вызваны сальмонеллами групп А, В, С, D и E. Жгутиковый Н-антиген представляет собой белок (флагеллин). Он может существовать в двух фазах: первой (специфической) и второй (неспецифической). Н-антигены первой фазы характерны для определенного вида сальмонелл, а антигены второй фазы встречаются у представителей разных видов. Это связано с тем, что синтез Н-антигена кодируется двумя независимыми генами. Функционирование одного гена исключает работу другого. Поэтому в каждой клетке может быть синтезирован только одна фаза Н-антигена. Первая фаза обозначается строчными латинскими буквами, вторая фаза - цифрами. Капсульные К-антигены содержат некоторые серовары сальмонелл, имеющие микрокапсулу. Разновидностью К-антигена сальмонелл является Vi-антиген, который имеется у возбудителя брюшного тифа. По химической структуре он представляет собой мукополисахарид. Vi-антиген обладает выраженной 17 иммуногенностью, поэтому используется при производстве брюшнотифозных вакцин. Этот антиген является рецептором для бактериофагов. При анализе вспышек брюшного тифа с целью определения источника инфекции с помощью набора Vi-фагов устанавливают фаговар S. Typhi. Vi-антиген может препятствовать агглютинации сальмонелл О-сыворотками. Факторы патогенности сальмонелл К факторам патогенности сальмонелл относятся токсины, пили, белки наружной мембраны, резистентность к фагоцитозу и Vi-антиген. Сальмонеллы разных видов и подвидов обладают разным набором токсинов. Эндотоксин выделяется при разрушении бактериальной клетки. Он вызывает развитие лихорадки в случае бактериемии, вызванной сальмонеллами. Некоторые сальмонеллы, особенно сальмонеллы животного происхождения, образуют белковые термостабильный и термолабильный энтеротоксины, которые схожи с холерным энтеротоксином и LТ-токсином энтеротоксигенных кишечных палочек. Цитотоксины (шигаподобные токсины) угнетают синтез белка энтероцитами. Пили (ворсинки, фимбрии) способствуют адгезии бактерий на клетках слизистой оболочки кишечника. У сальмонелл идентифицировано несколько типов фимбрий, участвующих в адгезии и колонизации (Fim, Lpf, Pef). Фимбрии 1-го типа Fim связываются с D-маннозными рецепторами на поверхности разных клеток. Длинные полярные фимбрии Lpf связываются с поверхностью клеток пейеровых бляшек. Тонкие фимбрии Pef связываются с ворсинками энтероцитов. Факторы инвазии (белки наружной мембраны) обеспечивают сальмонеллам трансцитоз через М-клетки слизистой оболочки кишечника. Резистентность к фагоцитозу позволяет сальмонеллам сохраняться и размножаться внутри фагоцитов. Vi-антиген препятствует фагоцитозу. Факторы патогенности сальмонелл кодируются генами, расположенными на хромосоме. Особое значение имеют гены, расположенные в двух классах локусов: гены, кодирующие поверхностные структуры (ЛПС, жгутики, фимбрии), и специфические гены патогенности, кодирующие факторы, которые видоизменяют физиологию клеток хозяина или защищают бактерию от антимикробных систем хозяина. В геноме сальмонелл описано несколько участков генов, кодирующих их патогенные свойства. Эти участки обозначаются как “островки патогенности” (Salmonella pathogenicity island, SPI). 7. Эпидемиология брюшного тифа т паратифов.  8. Фазы патогенеза брюшного тифа и паратифов: стадия вторжения (пищеварительная, дягиставная), фаза инвазии, фаза бактериемии, фаза паренхиматозной диффузии, аллерговыделительная стадия, выздоровления.  В развитии болезни четко выявляются следующие стадии: 1) стадия вторжения. Возбудитель через рот проникает в тонкий кишечник; 2) через лимфатические пути сальмонеллы проникают в лимфоидные образования подслизистой оболочки тонкого кишечника (пейеровы бляшки и солитарные фолликулы) и, размножаясь в них, вызывают лимфангоит и лимфаденит (своеобразные брюшно-тифозные гранулы); 3) бактериемия — выход возбудителя в большом количестве в кровь. Стадия бактериемии начинается в конце инкубационного периода и может (в отсутствие эффективного лечения) продолжаться в течение всей болезни; 4) стадия интоксикации наступает вследствие распада бактерий под действием бактерицидных свойств крови и высвобождения эндотоксинов; 5) стадия паренхиматозной диффузии. Из крови сальмонеллы поглощаются макрофагами костного мозга, селезенки, лимфатических узлов, печени и других органов. В большом количестве возбудитель брюшного тифа накапливается в желчных ходах печени и в желчном пузыре, где он находит благоприятные условия для своего размножения и где бактерицидные свойства крови ослаблены влиянием желчи; 6) выделительно-аллергическая стадия. По мере формирования иммунитета начинается процесс освобождения от возбудителя. Этот процесс осуществляют все железы: слюнные, кишечника, потовые, молочные (во время кормления ребенка), мочевыделительная система и особенно активно — печень и желчный пузырь. Выделяющиеся из желчного пузыря сальмонеллы опять поступают в тонкий кишечник, откуда часть их выделяется с испражнениями, а часть вторгается вновь в лимфатические узлы. Вторичное внедрение в уже сенсибилизированные узлы вызывает в них гиперергическую реакцию, которая проявляется в виде некроза и образования язв. Эта стадия опасна возможностью прободения стенки кишечника (язв), внутреннего кровотечения и развития перитонита; 7) стадия выздоровления. Процесс заживления язв происходит без возникновения обезображивающих рубцов на местах, очистившихся от некротических налетов. 9. Постинфекционный иммунитет при брюшном тифе и паратифах.  10. Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов, бактериологический метод: гемокультур, копрокультур, уринокультур. Метод: бактериологический. Материал для исследования фекальные массы. Схема работы (выделение гемокультуры); 1-й этап - посев 10 мл венозной крови в среду Рапопорта; 2-й этап; а) учет среды Рапопорта (покраснение среды без газа в поплавке -возбудитель брюшного тифа, покраснение с газом в поплавке -возбудители паратифов или сальмонеллезов); б) микроскопия роста; в) пересев на среды Левина или Плоскирева; 3-й этап; а) обнаружение бесцветных колоний на этих средах; б) микроскопия колоний: в) пересев на среду Олькеницкого; 4-й этап: а) учет роста на среде Олькеницкого (см. выше); б) определение чистоты выделенной культуры; в) установление антигенной структуры. Сначала в РА на стекле с монорецепторными сыворотками к О-антигенам (для группы А - Q2, группы В - 04, 5; группы Д - Н-О9), затем в такой же реакции с сыворотками к специфическим антигенам (в пределах данной группы); г) определение дополнительных биохимических и морфологических свойств (разложение индола, подвижность); д) определение чувствительности к поливалентным видоспецифическим бактериофагам; е) определение чувствительности к антибиотикам. Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов (метод гемокультуры). 1. Произвести посев 5 мл крови в 50 мл 10% желчного бульона. 2. Произвести высев с желчного бульона на среду Эндо (из колбы с демонстрационным материалом); 3.Оценить результаты посева на среде Эндо (по демонстрационной чашке); 4. Произвести посев лактозонегативной колонии на скошенный агар для накопления чистой культуры; 5. Учесть результаты биохимической активности выделенной культуры; 6. Произвести серотипирование выделенной гемокультуры путем постановки реакции агглютинации с сальмонеллезными агглютинирующими сыворотками. 7. Дать заключение. 11. Серологический метод диагностики брюшного тифа и паратифов: реакция Видаля, РПГА.   12. Микробиология пищевых токсикоинфекций: немикробного происхождения, микробного происхождения.  13. Сальмонеллёзы – классификация. Клиническая классификация сальмонеллеза (1, 2, 3, 4. 12, 13) Гастроинтестинальная форма - гастритический вариант - гастроэнтеритический вариант - гастроэнтероколитический вариант Генерализованная форма - тифоподобный вариант - септикопиемический вариант Бактериовыделение - острое - хронической - транзиторное Формы сальмонеллёза по типу и локализации поражений: гастроинтестинальная (локализованная) — очаг инфекции формируется в желудочно-кишечном тракте и не выходит за его пределы; генерализованная — инфекция распространяется по организму; бактерионосительство — инфекция «затаилась» в организме и либо никак не проявляет себя, либо периодически рецидивирует. 14. Серологическая классификация сальмонелл по Кауфману и Уайту.   15. Резистентность сальмонелл, факторы патогенности.   16. Особенности эпидемиологии сальмонелл.  17. Особенности патогенеза и клиники сальмонеллёзов.  18. Лабораторная диагностика пищевых токсикоинфекций сальмонеллёзной этиологии: бактериологический, биологический, серологический. 1. Бактериологический метод. Позволяет выявить наличие возбудителя в калах и взятых из различных источников питания пробых. В лаборатории изучают колонии бактерия на питательной среде, определяют количество возбудителя в материале. На это уходит несколько дней. Для выявления возбудителя выполняют посев материала на питательные среды, содержащие субстраты и условия для культивирования сальмонеллы. Например, это может быть питательная среда Раппорта-Вассермана, питательная среда по Лебоффу, Драпера Люкса и др. Наличие сальмонеллы в выбранном материале (например, в калах) определяется посевом на питательную среду и выращиванием колоний. Выращенные колонии идентифицируются с помощью различных методов, например культурально-морфологическим (цвет, форма, рисунок поверхности), биохимическим (на основе различия в биохимических свойствах) или молекулярно-генетическим (метод пЦР). 2. Биологический метод. Оценивают способность к бактериям вызывать болезнь у животных путем выявления патогенности бактерий на животных пробых. Выявление патогенности сальмонеллы проводится на животных (обезьянах, мышах, крысах, курицах и других животных) путем введения определенной дозы возбудителя в организм животного и наблюдения за развитием инфекции. Из биологических методов в настоящее время в основном используются методы, основанные на применении генно-инженерных штаммов сальмонеллы. 3. Серологический метод. Диагностика сальмонеллеза наличия антител проводится на основе обнаружения в сыворотке пациента специфических антител (IgM, IgG, IgA) или антигена на поверхности сальмонеллы. Общим методом служит реакция капельной агглютинации (РКА), которая основана на принципе связывания антител с антигенами сальмонеллы. В качестве эталонного материала для сравнения свойств и признаков выделенных возбудителей могут служить референтные образцы бактерий, хранящиеся в специализированных отделах лабораторий. |