Клеточная инженерия растений. История создания метода
 Скачать 35.21 Kb.
|
|
Клеточная инженерия растений. История создания метода. Клеточная инженерия у растений заключается в получении растений из одной клетки, а также в генетических манипуляциях с изолированными клетками, направленными на преобразование их генотипов. Метод получения растений из одной клетки основан на способности тканей растений ряда видов к неорганическому росту на специальных искусственных средах, содержащих питательные вещества и регуляторы роста. При культивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываются способными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированных клеток, получивших название каллуса. Если затем каллус разделить на отдельные клетки и продолжить культивирование изолированных клеток на питательных средах, то из отдельных (одиночных) клеток могут развиться настоящие растения. Способность одиночных соматических клеток растений развиваться в настоящее (целое) растение, называют тотипотентностыо. Возможно, тотипотентность присуща клеткам всех листостебельных растений. Но пока она обнаружена у растений ограниченного круга. В частности, эта способность обнаружена у клеток картофеля, моркови, табака и ряда других видов сельскохозяйственных культур. Этот метод клеточной инженерии растений уже вошел в широкую практику. Однако растения, развившиеся из одной клетки, характеризуются генетической нестабильностью, что связано с мутациями их хромосом. Поскольку генетическая нестабильность дает разнообразные формы растений, они очень полезны в качестве исходного материала для селекции. Однако растения можно получить и из так называемых протопластов растительных клеток, под которыми понимают клетки, у которых искусственно с помощью гидролитических ферментов (пек-тиназы и целлюлазы) удалена клеточная стенка. Обычно протопласты получают из клеток листьев, корней, лепестков, прорастающей пыльцы, плодов и других структур растений. Способность протопластов давать начало растениям выявлена у очень большого количества видов. Получение растений из одной клетки или протопласта часто называют клональным микроразмножением. Главнейшее преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет резко сократить сроки размножения многих видов растений, а также очень быстро воспроизвести одно и то же растение в сотнях тысяч экземпляров, что имеет исключительно важное значение в селекционной работе и в получении посадочного материала, незараженного возбудителями болезней. Генетические манипуляции, связанные с растительными клетками, направлены на преобразование генотипов клеток растений, что достигают либо путем соматической гибридизации (получения гибридных клеток) либо путем переноса в клетки генетического материала, происходящего от других организмов. Во всех случаях исходным материалом являются протопласты клеток. 2.Культуры соматических клеток растений. Этапы каллусогенеза. В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования. Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток. Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора. Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поражения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа. Основные этапы получения каллусных культур Выбор экспланта. Двудольные травянистые. Однодольные травянистые. Зерновые культуры. Голосемянные. Каллусы двудольных растений могут быть легко получены из: отрезков стебля и корней; изолированных фрагментов паренхимы тканей клубня; сердцевины стебля; мезофилла листа; органов цветка (завязи, пыльцы) Каллусы однодольных растений обычно получают из: зародышей; отрезков основания стебля; корней. Подбор питательной среды, условий культивирования. Стерилизация растительного материала: престерилизация, стерилизация, постстерилизация. Изоляция эксплантов (минимальный критический размер экспланта). Перенос стерильных эксплантов на питательную среду. Герметизация Культивирование: наращивание первичного каллуса; субкультивирование – перенос трансплантана свежую питательную среду. В оптимальных условиях осуществляется через 3-4 недели. Отбор каллуса: для решения фундаментальных проблем биологии; для биотехнологических целей. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro можно разделить на 2 группы: вспомогательные технологии, вторая группа методов. Она ведет к самому, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений. Оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение м/у выбранными парами в естественных условиях. Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи котоҏыҳ или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. 3.Методы культивирования клеток и тканей растений Метод основан на выращивании (эксплантации) изолированных клеток, кусочков тканей, органов вне организма (in vitro). Различают клеточное, тканевое и органное культивирование. При клеточном и тканевом культивировании отдельные клетки или кусочки ткани выращивают погруженными в питательную среду. Такой способ позволяет сохранить морфологическую структуру культивируемых клеток, тканей. Культуры клеток дают возможность получить однородный клеточный материал в больших количествах. На клеточных культурах можно изучать физические и химические воздействия. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови. Для ее получения достаточно взять 1-2 мл венозной крови и добавить ее в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (белок бобовых растений). Он вызывает деление лимфоцитов. Продолжительность культивирования составляет 48-72 ч. Вторым методическим условием цитогенетических исследований является использованиеколхицина, разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы.Его добавляют в культуры клеток за 2-3 ч до окончания культивирования. Использование клеточных технологий растений в селекционных процессах. Клеточные технологии в селекции растений. Обогащение генофонда зерновых культур может быть достигнута при использовании огромных генетических ресурсов их дикорастущих сородичей. Найдены виды злаков с высокой устойчивостью к: болезням и вредителям, температурным и водным стрессам, засолению и высокой кислотности почв. В селекционной работе для преодоления межвидовой (или даже межродовой) несовместимости применяют методы: оплодотворения in vitro, культуру зародышей, возвратные скрещивания и другие современные приемы (Feldman, Sears, 1984). Генная инженерия растений создает совершенно новый механизм генетической изменчивости — трансгеноз, который в отличие от ранее существовавших (рекомбиогенез, мутагенез) характеризуется возможностью переноса отдельных генов. Правда, эта особенность затрудняет применение методов генной инженерии для улучшения ряда хозяйственно ценных признаков, наследуемых полигенно. Но уже получены химерные растения, несущие гены устойчивости к болезням, насекомым, гербицидам и др. Отдаленная гибридизация культурных злаков с дикорастущими сородичами имеет целью перенос единичных генов или небольших фрагментов хромосом от дикорастущих в геном культурных видов. Но для этого необходимо преодолеть барьер несовместимости — отсутствие конъюгации хромосом в мейозе. У пшеницы в хромосоме 5В были обнаружены гены, влияющие на конъюгацию хромосом, и, таким образом, выявлена возможность в определенной степени управлять этим процессом. В Мадридском университете (Испания) и Институте селекции общества Макса Планка (Кельн, ФРГ) для озимой ржи разработан метод прямого переноса генов, позволяющий получать трансгенные растения относительно простым способом in vivo, исключающим необходимость регенерации растений из клеточных. Наиболее широко работы ведутся с бактериями Azospirillum (Postgate, 1989). В серии опытов, проведенных в различных штатах Индии, инокуляция семян пшеницы, риса, сорго, проса ризосферными азотфиксаторами обеспечивала прибавки урожая зерна до 30% (Subba Rao, 1982. Более широкое практическое применение в настоящее время получило другое важнейшее направление современной биотехнологии — клеточная селекция как метод создания новых форм растений путем выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций в селективных условиях. Клеточная селекция является как бы развитием мутационной селекции, но реализуется на уровне единичных клеток с использованием техники in vitro, что придает ей, с одной стороны, более широкие возможности, а с другой стороны — создает значительные трудности из-за необходимости регенерации из отдельных клеток полноценных растений. Преимущество клеточной селекции перед традиционными методами состоит в: отсутствии сезонности в работе, возможности использования миллионов клеток при отборе, направленности селекции путем применения селективных сред, выполнении работ в лабораторных условиях С развитием культуры in vitro появилась реальная возможность более широкого использования гаплоидии в селекции сельскохозяйственных культур. Применение метода культуры клеток позволило осуществить регенерацию растений из генеративных клеток, содержащих гаплоидный набор хромосом. Стало возможным массовое получение гаплоидов. Практическое значение в селекции в настоящее время получили культура пыльников (андрогенез), завязей и семяпочек (гиногенез) и метод гаплопродюсера, который является разновидностью гиногенеза Использование клеточных и тканевых культур для ускоренного размножения ценных сортов растений. Микроклональное размножение. Клональное размножение - это использование техники ин витро для быстрого неполового получения растений, идентичных исходному. Обязательным условием клонального микро размножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах. Этому условию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения. Этапы и преимущества микроклонального размножения. Процесс клонального микро размножения можно разделить на несколько этапов: Выбор растения-донора, изолирование и стерилизация эксплапта, создание условии для его роста на питательной среде ин витро. Собственно, размножение путем: а) размножения черезкаллусную и суспензионную культуру; б) индукции образования адвентивных почек тканями листа, стебля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем, зачатками соцветий без образования ими каллусной ткани; в) стимуляции развития всех пазушных почек экспланта в результате подавления апикального доминирования как химическим путем, так и при микрочеренковании побегов. Укоренение размножаемых побегов и адаптация пробирочных растений к условиям ин витро. Выращивание извлеченных из культуральных сосудов растений в условиях теплицы в почве. Подготовка к реализации или высадке в поле. Преимущества клонального микроразмножения растений: Значительно более высокие коэффициенты размножения, достигающие миллиона растений в год, по сравнению с 5-100 растениями от одного, полученными обычными способами за этот срок. Миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножаемыми растениями, и позволяющая поддерживать на относительно небольшой площади в лабораторных условиях круглогодичный рост растений, что дает возможность планировать их выпуск к определенному сроку. Оздоровление посадочного материала oт нематод, грибов, бактерий и вирусов, вызывающих болезни растений. Возможность создания нужного для селекционера количества копий уникальных генотипов (линий, гибридов, мутантов, трансгенных растений). Возможность размножить и укоренить те растения, которые совсем не размножаются или плохо размножаются обычными способами, например, быстрое клональное размножение лучших экземпляров взрослых лесных деревьев, особенно хвойных. Таким образом, имеется реальная возможность создания «банка» или коллекции ценных форм оздоровленных сортов, а также редких и исчезающих видов растении путем длительного хранения пробирочных растении при пониженной температуре. Однако самой крупномасштабной областью применения клонального микроразмножения является быстрое размножение вновь созданных и уже существующих ценных хозяйственных сортов с целью получения массового оздоровленного посадочного материала, освобожденного от вирусной инфекции. Получение биологически-активных веществ из культивируемых клеток и тканей растений Благодаря способности изолированных из растения тканей и клеток к видоспецифичному синтезу вторичных метаболитов, исследования в этой области приобретают все большую актуальность. Таким образом, с каждым годом увеличивается количество культур, для которых подтверждены и оправданы разработки методов культивирования с целью внедрения их в промышленное производство. К таким культурам относятся, прежде всего, культуры-продуценты веществ с высокой биологической активностью. По данным китайского исследователя M. Kawamura, многие полученные в лабораториях культуры вполне успешно могут использоваться для внедрения в производство, так как их выращивание in vitro экономически эффективно по сравнению с промышленным способом получения биомассы растений, содержащих биологически активные вещества. Одной из первых культур-продуцентов БАВ можно по праву считать полученную M. N. Zenk а сотрудниками культуру барвинка розового (Catharanthus roseus) – продуцента двух алкалоидов: серпентина и аймалицина. На этом объекте были установлены основные условия получения культур-продуцентов веществ вторичного обмена. Данные, полученные в лаборатории M. N. Zenk'а, позволили выдвинуть гипотезу, которая была развита и дополнена авторами, работающими с другими видами растений. Были наработаны экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что для получения культур-продуцентов с высоким синтетическим потенциалом важно учитывать следующие особенности: отбирать растение, в котором содержание биологически активных веществ максимально по сравнению с другими особями этого вида; для инициации культуры тканей использовать органы растений, в которых происходит синтез и накопление данных веществ, что позволит разнообразить и обогатить состав конечных продуктов; при культивировании тканей в условиях in vitro необходимо учитывать такие условия как: наличие и состав источников углеродного питания; наличие в культуральной среде минеральных веществ: источников азота, фосфора, калия, серы, кальция и других макро- и микроэлементов; наличие витаминов и аминокислот, способствующих видоспецифичным синтезам БАВ; наличие и типы гормональных индукторов, поддерживающих способность клеток к делению и стимулирующих синтез вторичных метаболитов; наличие или отсутствие в среде кислорода или избытка углекислого газа; наличие освещения и предшественников конечных продуктов; рН среды и температура в культуральных помещениях. Благодаря сделанным открытиям в настоящее время во многих лабораториях мира ведутся исследования по культивированию соматических тканей в условиях in vitro для получения культур-продуцентов. Это обусловлено перспективой промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений их специализированного обмена и одновременного уменьшения антропогенного влияния на дикую природу, возможность получения фитомассы, не содержащей полютантов (гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и др.), управления процессом биосинтеза целевых продуктов и т.д. В настоящее время на стадии изучения способности к накоплению биологически активных веществ in vitro находится большое количество культур, полученных из растений с высокой биологической активностью. Кроме того, в культуре тканей и клеток растений считается возможным получение следующих вторичных метаболитов: стероидных алкалоидов Hollarhena antidysenterica (Poxb) Wall, проявляющих антибактериальную активность β-карболиновых алкалоидов гармалы обыкновенной (Peganum garmala L.), имеющих антибактериальную активность и влияющих на обменные процессы нервной и сердечно-сосудистой систем, а также на активность некоторых ферментов; стероидов в культуре тканей Dioscorea cauccasica. Имеется опыт получения кофеина в клетках Coffea arabica, различных фенолов и их полимеров в культурах чайного растения (Camellia sinensisL.) и культуре петрушки (PetroseleniumhortenseAuct.) 7. Использование растительных и животных клеточных культур для оздоровления и сохранения редких генофондов Возможность создания банка культур in vitro для длительного хранения генофонда редких и полезных растений является важнейшим достижением биотехнологии. Методические приемы, существующие на сегодняшний день, делятся на две группы. Одна из этих групп основывается на хранении культур без нарушения процесса роста, тогда как вторая – на хранении либо при замедлении роста, либо при полной его остановке. Первый подход является достаточно затратным, так как связан с частым субкультивированием растительного материала. Способ криоконсервации, требующий тщательной подготовки материала, добавления криоконсервантов, является еще более трудоемким и дорогим, и также требует наличия специального оборудования. Наиболее приемлемым в наших условиях является метод снижения температуры культивирования, за счет которого достигается увеличение промежутка между пассажами до 12–14 месяцев. Важно отметить, что способ хранения живых тканей при пониженных температурах не имеет негативных последствий для растений - регенерантов и даже способствует их более интенсивному росту после переноса в нормальные условия. С использованием метода культивирования тканей и органов растений в настоящее время создан ряд клеточных технологий, позволяющих получать ценные вторичные продукты метаболизма растений, такие, как: гликозиды, алкалоиды, некоторые другие биологически активные вещества, имеющие широкое применение в качестве лекарственных препаратов, пищевых красителей, ароматизаторов. Преимуществом создаваемых клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на плантациях растения) является: получение продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий и возможность культивирования клеток растений; оптимизация и стандартизация условий выращивания. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении: метаболизма и его регуляции в клетках и тканях, онтогенеза, генетики, растительной вирусологии и др. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную биологическую массу в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания является преимуществами такого моделирования. Применение методов культуры изолированных органов и тканей in vitro открывает большие перспективы для массового воспроизводства и сохранения ценного генофонда древесных и травянистых растительных форм с помощью клонального микроразмножения. За последние десять лет различными биотехнологическими лабораториями вводятся в культуру многие виды растений. Кроме того, создаются коллекции для их дальнейшего тиражирования, поскольку при клональном микроразмножении появляется возможность круглогодичного воспроизводства растений в требуемых количествах для целей интродукции, оздоровления и ювенилизации растительного материала. Таким образом, проблема сохранения генофонда может быть решена с помощью биотехнологических подходов. |