Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
 Скачать 1.38 Mb.
|
1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений.I этап (1878–1902 гг.) Немецкие исследователи:Габерландт, Фехтинг, Рехингер пытались культивировать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув значительных успехов, они высказали ряд идей и гипотез, подтвержденных позже. Фехтинг (1878) выявил наличие полярности у изолированных фрагментов стеблей, которые формировали в апикальной части почки, а в базальной – каллус или корни. Он пришел к выводу, что полярность свойственна как органам растения так и отдельной клетке. Рехингер (1893) определил min размеры эксплантов, способные продуцировать почки и регенерировать целые растения. С уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм, способность к регенерации переставала проявляться. Принципы культивирования кл-к (использование пит. сред и соблюдение асептических условий) сформулировал Габерландт(1902). Он пытался выращивать на пит. средах отдельные кл-ки, выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растений. II этап (1902–1922 гг.) создание первых пит. сред для культ-ния тканей животных. Гаррисон и Каррель разработали методику выращивания животных кл-к на пит. средах природного происхождения (плазма крови, зародышевая жидкость, лимфа). Попытки выращивания раст-х объектов на естественных пит. средах раст-го происхождения – работы Чеха и Прата (1927) – окончились неудачей. III этап (1922–1932 гг.). В 1922 заложен новый подход к методам культ-ния изолирова-нных кл-к и тканей растений в Германии Котте и в США Робинсоном. Они доказали необходимость использования для культ-ния меристематических кл-к, а также применения более сложных по составу культуральных сред. IV этап (1932–1940 гг.). Француз Готре и американец Уайт – родоначальники соврем-х методов культ-ния изолированных тканей и органов растений. Уайт показал, что корневая меристема может расти неограниченно долго во времени, если ее периодически пересаживать на свежую пит.среду. Он усовершенствовал состав пит.среды (среда Уайта, добавил в её витамины). Уайт показал способность к неограниченному росту при субкультивировании раст-х опухолей. Готре ввел в культуру новые объекты – каллусные ткани древесных растений камбиального происхождения и каллусные ткани запасающей паренхимы. Он предложил ввести в пит.среды ауксин, и заменить жидкую пит.среду на твердую – агаризованную. V этап (1940–1960 гг.). Увеличивается число видов растений, ткани кот-х культ-ются in vitro. Разработаны составы ряда пит-х сред, изучено значение макро- и микроэлементов, витаминов и стимуляторов роста раст-го происхождения. В 1955 г. Скуг и Миллер открыли цитокинины и показали их значение для пролиферации кл-к in vitro. VI этап (1960–1975 гг.). Разработка Коккингом (1960) метода получения изолир-ных протопластов из корней и плодов томата ферментативным путем и культ-ния их в контролируемых условиях. В 1970 г., Пауэром и сотр. – искусственное слияние протопластов, что открыло путь к созданию соматических гибридов. Разраб.метод микроклонального размножения. Открытие Гухом и Магешвари индукции адрогенеза при культ-вании изолированных пыльников и гиногенеза при культ-нии кл-к зародышевого мешка. Поиск возможностей выращивания одиночных кл-к, результат кот-го – разработка метода получения и выращивания клет. суспензий. Экспериментально доказана идея Габерландта о тотипотентности раст. клетки. В 1965 г. Вэсил и Хильдебрандт – получили из изолированной кл-ки табака нормально развивающееся и достигшее цветения растение. В 1971 г. получены растения-регенеранты табака – сомаклональные варианты исходной формы. VII этап (1975 г. – по настоящее время). Быстрое развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых раст-ных объектов и создание биотехнологий на их основе. Разработка методов электрослияния изолированных протопластов и разнообразных методов селекции гибридных кл-к значительно облегчила гибридизацию соматических кл-к растений. Методы мутагенеза и клеточной селекции, получение сомаклональных вариантов и экспериментальных гаплоидов используются для создания новых форм и сортов с/х растений. С использованием изолированных протопластов и генетических векторов на основе Ti –плазмид, электропорации и баллистического введения генов в клетки и ткани реципиентов стало возможным получение трансгенных растений. 2. Культура к-к, тканей и органов растений как основа биотехнологии Культуры изолированных клеток и тканей в биотехнологии следует рассматривать в нескольких направлениях: Получение экономически ценных БАВ; Клональное размножение растений; Получение оздоровленных растений; Ускорение селекционного процесса; Генетическое улучшение растений; Сохранение генофонда редких видов. Первое из них связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Эта особенность широко используется для создания технологий промышленного получения БАВ. Помимо биосинтеза важных соединений, культивируемые клетки способны к биотрансформации, т.е.превращению дешевых предшественников в ценный конечный продукт. Второе направление – это использование культуры изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала. Этот метод, названный клональным микроразмножением растений, позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год. Сейчас разработаны рентабельные биотехнологии получения посадочного материала хозяйственно ценных оздоровленных сортов картофеля,винограда, овощных, плодовых, декоративных растений и лесных пород. Таким путем создается система безвирусного растениеводства. Третье направление – использование изолированных клеток и тканей в селекции растений. Метод культуры тканей открывает новые возможности для расширения генетического базиса, для облегчения и ускорения селекционного процесса, а также для конструирования принципиально новых форм растений. Криосохранение культивируемых клеток является еще одним направлением их использования в биотехнологии. Это означает длительное хранение штаммов клеток растений при температуре жидкого азота (–196 ˚С) в целях создания банка генов редких и исчезающих видов, ценных селекционных объектов и штаммов-продуцентов веществ вторичного происхождения. Отрасли народного хозяйства, в которых используются культивируемые клетки растений: медицина– производство лекарственных препаратов; химическая промышленность –получение БАВ, биоскрининг химпрепаратов; агропромышленный комплекс – с/х биотехнология: размножение и оздоровление растений, генетическое улучшение растений, сохранение генофонда.Т. о., в настоящее время прогресс в растениеводстве, фармакологии, пищевой, парфюмерной, легкой, химической промышленности теснейшим образом связан с дальнейшим развитием клеточных технологий растений и их ускоренным внедрением в народное хозяйство. 3. Условия асептики при культ-нии раст-х объектов in vitro Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей явл-ся соблюдение строгой стерильности. Стерилизации должны подвергаться операционная комната, в которой производят изоляцию и посадку культур, одежда и руки работающего персонала, посуда, используемая для культивирования объектов, все необходимые инструменты и материалы, питательные среды, объекты культивирования. Ламинар-бокс широко используется для стерильных пересадок при работе с культурой тканей. В ламинар-боксах асептика достигается подачей стерильного воздуха в рабочий объем. Ламинар-боксы оснащены УФ лампами, обеспечивающими стерилизацию внутренней поверхности. Однако даже после этого рабочую поверхность перед использованием желательно протереть 70 %-ным этанолом или 20 %-ным водным раствором фенола. Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или фольгу, инструменты стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 С в течение 1,5–2 ч. Непосредственно перед работой в боксе инструменты стерилизуют еще раз, помещая в фарфоровый или стеклянный стакан с 96 %-ным спиртом и обжигая каждый из них в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции. Перед повторным использованием его снова следует обработать спиртом и обжечь. Питательные среды, не содержащие термолабильных веществ,стерилизуют автоклавированием при давлении 0,5–1 атм. Продолжительность стерилизации зависит от объема среды в сосуде. Культуральные сосуды со средой объемом 25–50 мл стерилизуют в течение 15–20 мин, объемом 2–4 л – в течение 30–40 мин. Другим способом стерилизации может быть дробная стерилизации – тиндализация, которую проводят при температуре 100 С и атмосферном давлении. Среду кипятят в течение 10 мин, затем охлаждают ее и повторяют эту процедуру дважды с промежутком в одни сутки. Для стерилизации растворов с термолабильными соединениями (растительные экстракты, белки, аминокислоты, витамины, антибиотики, некоторые стимуляторы роста), которые разрушаются при автоклавировании, применяют метод холодной стерилизации. Для этой цели термолабильное вещество обрабатывают этиловым эфиром, который затем удаляют при пониженной температуре, твердый остаток растворяют в стерильной воде и в стерильных условиях добавляют к остальной ранее простерилизованной среде. Второй способ заключается в фильтровании растворов через стерильные микроскопические фильтры с диаметром пор 0,22–0,45 мкм, задерживающие вирусы и бактерии. Простерилизованные компоненты добавляют в проавтоклавированную охлажденную до 40 С основную среду. 4. Методы стерилизации растительного материала при введении в культуру in vitro. Раст-ные ткани могут служить источником заражения, т.к. на их поверхности находится эпифитная микрофлора. Для поверхностной стерилизации раст-ные экспланты стерилизуют растворами соединений, сод-щих активный хлор (хлорамином, гипохлоритом кальция и натрия, сулемой), бром (бромной водой), диацидом, перекисью водорода, спиртом, антибиотиками. При выборе стерилизующего агента необходимо учитывать следующее: стерилизующее вещество должно губительно действовать на все микроорганизмы, но минимально повреждать раст-ные ткани; вид стерилизующего вещества, его конц-ция и длительность применения зависят от плотности и чувствительности ткани, кот. должна быть стерилизована; стерилизующее вещество должно легко удаляться из ткани промыванием стерильной дистиллированной водой или подвергаться разложению. При правильном выборе стерилизующего вещества степень инфицирования тканей не превышает 1–3 %. Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиком. Антибиотики также используются для подавления роста микроорганизмов в суспензионных культурах, стерилизации нежных тканей и корончатогалловых опухолей. Т.к. антибиотики являются термолабильными веществами, их стерилизуют методами фильтрования и добавляют в охлажденную среду. Перед стерилизацией ткани, ее предварительно моют в мыльном растворе и ополаскивают дистиллированной водой, а затем погружают на неск. секунд в 70 %-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1–2 мин. Обработка тканей этанолом перед помещением их в стерилизующий раствор, кроме собственного стерилизующего действия спирта, повышает действие стерилизующих веществ. Очищенный и промытый в дистиллированной воде растительный материал помещают в стерилизующий раствор и отмечают время начала стерилизации. По истечении времени стерилизации раст-ный материал промывают тремя порциями стерильной воды, выдерживая по 10–15 мин в каждой. Если в результате неудовлетворительной стерилизации культура тканей загрязнена быстрорастущими микроорганизмами, то такое заражение легко обнаруживается уже на 2–3 сутки после посадки. Инфицирование культур, растущих на агаризованной среде, легче выявляется, если культуральный сосуд просматривать на свет. Заражение раст-ной ткани проявляется в виде ореола из бактериальных микроорганизмов вокруг ткани на поверхности агара или помутнения агара непосредственно под тканью. Если инфицирована пит.среда, то колонии микроорганизмов или грибов распред-ся в толще агарового слоя. Зараженная суспензионная культура мутнеет, приобретая цвет разбавленного молока. В худшем случае ткань может быть загрязнена медленно растущими микроорганизмами или спорами. При этом заражение не проявляется в первые дни после посадки эксплантов, а обнаруживается только при последующем размножении ткани или субкультивировании ее на свежую пит.среду. 5. Типы питательных сред для культивирования растительных клеток и тканей in vitro. Компоненты сред: макроэлементы; микроэлементы; источники углерода; витамины; регуляторы роста. Минеральная основа пит. сред для культ-ния изолированных клеток и тканей должна включать все необходимые макроэлементы (азот, фосфор, серу, калий, кальций, магний, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.). Т.к. питание большинства культивируемых тканей явл-ся гетеротрофным, то обязат. компонентом пит. сред явл-ся источник углерода и энергии (сахароза и глюкоза, в конц-циях 20–40 г/л.) Сахароза при стерилизации сред гидролизуется до более доступных к усвоению моносахаридов. В настоящее время получены клоны клеток-автотрофов, обладающих значительной интенсивностью фотосинтеза, и разработаны условия их культ-ния, что позволяет поддерживать автотрофный рост в течение 5–7 пассажей. Но для нормального роста хлорофиллоносных тканей также необходимы углеводы. В состав большинства пит. сред входят витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновая кислота, пиридоксин, аскорбиновая кислота. Регуляторы роста – фитогормоны: ауксины и цитокинины. Исходя из различий в потребностях ауксинах и цитокининах, ткани: растущие на средах только с ауксинами (экспланты корней топинамбура, цикория); требующие для роста введение в среду только цитокининов (культура корешка белого турнепса); ткани, для роста кот-х необходимы и ауксины и цитокинины (больш-во культ-мых тканей); ткани, растущие на средах с раст-ми экстрактами сложного состава; опухолевые ткани, способные расти на средах без регуляторов роста. Для роста большинства тканей в условиях in vitro необходимы и ауксины, и цитокинины. В качестве ауксинов для получения и поддержания культур тканей чаще всего используются ИУК(индолилуксусная кислота) в концентрации 1–30 мг/л, НУК (нафтилуксусная кислота) в конц-ции 0,1–2 мг/л, 2,4-Д в конц-циях менее 1 мг/л. В качестве источников цитокининов в средах используют кинетин, зеатин, БАП(бензиламинопурин). БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. В каждом конкретном случае оптимальное их соотношение опред-ся экспериментальным путем.Из гиббереллинов в составе сред используют гибберелловую кислоту. Абсцизовую кислоту применяют при культ-нии протопластов. Пит. среды могут включать и антиоксиданты: аскорбиновую кислоту, глутатион, дитиотриэтол, диэтилтиокарбамат, поливинилпирролидон. Для приготовления тв-дых пит.сред в качестве уплотняющего вещества используют агар-агар в конечной концентрации 6–10 г/л. Он образует с водой гель, плавящийся при 100 С и затвердевающий при 45 С. В то же время в составе агара обнаружены витамины и другие факторы роста. В последнее время нашли применение и другие гелеобразующие вещества: гельрит, биогели. Большинство культур изолированных тканей растет на средах с рН 5,5–5,8. Обычно рН готовой среды устанавливается с помощью 10 %–ного или 1 н раствора KOH или NaOH или 1 н HCI перед автоклавированием. Однако надо учитывать, что после автоклавирования рН среды может снижаться в результате гидролиза сахарозы. 6. Среда WPM Среда применяется при культивировании invitro хозяйственно ценных сортов древесных растений, которые относятся к трудно черенкуемым традиционным способом, и выращивания качественного стандартного посадочного материала для создания плантационных насаждений, полезащитных полос, лесных угодий. Микрочеренкование осуществляют на питательной среде WPM - Woody Plant Medium, со сниженным содержанием БАП - бензиламинопурин 0,2 мг/л и добавлением ГК - гиббереллиновой кислоты 0,2 мг/л. Компоненты / среда WPM NH4 NO3 400 Ca(NO3)2 x 4H2 O 386 MgSO4x 7H2 O 370 NaH2 PO4x H2 O - CaCl2x 2H2 O 96 KH2 PO4 170 К2 SO 4 990 (NH4)2SO4 - (мг/л) Предлагаемый способ выращивания посадочного материала осуществляют следующим образом. 1 этап - Заготовка побегов, изоляция эксплантов и получение асептических жизнеспособных культур. 2 этап - Индукция развития основного пазушного побега на первичных эксплантах. Простерилизованные побеги с одной пазушной почкой в вертикальном или слегка наклонном положении помещают по одному в культуральные сосуды с питательной средой WPM (среда № 1) с добавлением 6-БАП (6-бензиламинопурина) 0,5 мг/л, ГК (гиббереллиновая кислота) 0,2 мг/л. Для увеличения количества индуцированных побегов рекомендуется рекультивирование первичных эксплантов с отрезанным пазушным побегом на среде WPM со сниженным содержанием БАП - 0.2 мг/л и добавлением ГК 0.2 мг/л. 3 этап - Укоренение изолированных побегов и их мультипликация (клональное микроразмножение) в условиях in vitro. Сформировавшиеся пазушные или индуцированные дополнительные побеги изолируют и переносят на среду для спонтанного укоренения WPM или 1/2 WPM (с уменьшенным содержанием макросолей) без гормонов. |