Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений

• Название: 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
• Анкор: Шпоры культура клеток органов и тканей
• Дата: 19.09.2020
• Размер: 1.38 Mb.
• Имя файла: ККОИТ.docx
• Тип: Документы; #138687
• страница: 3 из 14

16. Гиббереллины: метаболизм и транспорт, физиологическое действие

Растения риса часто поражаются грибом-аскомицетом, половая форма к-ого носит название Gibberella fujikuroi, а конидиальная — Fusarium moniliforme. Пораженные этим грибом молодые растения усиленно вытягиваются и полегают. Эта болезнь в Японии получила название «бакане» (бешеные всходы). В 1912 г. японский ботаник Савада высказал предположение, что симптомы этого забол-ия обусловлены действием хим. соед-ия, выделяемого паразитом. В 1926 г. его ученик Куросава установил, что активное вытягивание стебля растений риса действительно индуцирует хим. в-во, содержащееся в культуральной жидкости гриба. В 1938 г. японские исслед-ли Ябута и Сумики выделили эти 2 соединения, к-ые они назвали гиббереллинами А и В. Вскоре было устан-но, что гиббереллин А идентичен гибберелловой кислоте (ГК₃). Ее структ. формулу установили в 1954 г. англ. бихимики Кросс и Куртис.

Дальн. развитие исслед-ий гиббереллинов как фитогормонов определило открытие, сделанное в 1956 г. америк. физиологом Лангом. Он установил, что ряд розеточных растений, к-ым для перехода к стрелкованию необх-мы низкие положит. температуры и длиннодневный световой период, могут образовать цветонос и зацвести в обычных усл-иях, если их обработать гиббереллином. Т. обр., он впервые показал, что гиббереллины так же, как и условия среды, могут оказывать влияние на развитие растит. орг-ма. У высших растений гиббереллины впервые были обнаружены Мак-Милланом. Из незрелых семян фасоли Phaseolus multiflorus в 1960 г. им был выделен первый «растительный» гиббереллин, к-ый оказался идентичным гиббереллину ГА₁, полученному ранее из гриба G. fujikuroi.

В наст. время известно более 110 гиббереллинов, многие из к-ых не обладают физиолог. акт-тью в растениях. Считают, что практически весь спектр гиббереллинов можно обнаружить в грибных к-рах, при этом для каждой их них имеется специф. набор этих гормонов.

В связи с большим кол-вом гиббереллинов их стали обозначать символом ГА (в англояз. литературе GА) / просто А с цифрой справа внизу — порядк. номером, к-ый присваивается каждому новому соед-ию по мере открытия и идентификации. Согласно этой номенклатуре, н-р, акт. формы гиббереллинов обозн-ся как A₁ (ГА₁), А₄ (ГА₄) и ГА₃. Гиббереллин ГА₃ называют гибберелловой кислотой (ГК).

Гиббереллины предст-ют собой тетрацикл. дитерпеновые к-ты и по кол-ву углер. атомов в молекуле раздел-ся на 2 группы. Около половины из них содержит 20 углер. атомов, что свойственно дитерпенам, и относится к С₂₀-гиббереллинам (энт-гибберелланам), другая половина утрачивает 1 атом углерода и относится к C₁₉-гиббереллинам.

Синтез. Гиббереллины синтезир-ся в молодых, интенсивно растущих тканях растений — молодых листьях, частях цветков, формир-ся семенах, верхушке корня. В меньших кол-вах гиббереллины образ-ся в зрелых, но еще не закончивших рост листьях. Наибольшее кол-во гиббереллинов сод-ся в незрелых семенах и плодах.

Гиббереллины синтезир-ся, как и все изопреновые соед-ия, из ацетил-СоА через мевалоновую кислоту и геранилгераниол. Непоср-ым предш-ком гиббереллинов является энт-каурен. Синтез гиббереллинов идет в 3 этапа. На 1-м этапе за счет р-ии циклизации геранилгераниолпирофосфат превращается вначале в копалилпирофосфат, а затем в энт-каурен.

2 фермента — циклазы, катализ-ие этот процесс, прис-ют в пропластидах меристематич. тканей побегов, но их нет в хлоропластах. Поэтому в зрелых хлоропластах процессы 1-го этапа синтеза гиббереллинов идти не могут. 2-й этап связан с последоват-ым окислением энт-каурена до ГА₁₂-альдегида с участием монооксигеназ, к-ые исп-ют цитохром Р450 в своих р-иях: Энткаурен → Энт-кауренол → Энт-кауренал → Энт-кауреновая кислота → Энт-7а-гидроксикауреновая кислота → ГА₁₂-альдегид.

Ферменты эти локализ-ны в ЭПР. На 3-м этапе ГА₁₂-альдегид окисляется с образ-ием первого гиббереллина — ГА₁₂, а затем и др. гиббереллинов (в т.ч. и физиол-ки активного ГА₁): ГА₁₂-альдегида → ГА₁₂ → ГА₅₃ → ГА₄₄ → ГА₁₉ → ГА₂₀ → ГА₁

Больш-во р-ий заверш. этапа происх-ит в цитоплазме и связано с процессами гидроксилирования, катализ-го разл. растворимыми диоксигеназами. Передвижение гиббереллинов по растению осущ-ся пассивно по сосудам флоэмы.

Сущ-ют свободные и связанные формы гиббереллинов. Больш-во связанных форм образуется за счет ковалентных связей гиббереллинов с моносахаридами. Особенно их много в семенах. Связанные гиббереллины часто служат запасной и трансп. формами гормона.

Физиологическая роль. Наиболее характерный эффект, к-ый гиббереллины вызывают в растениях,— это удлинение их стебля. Гиббереллины также увеличивают кол-во междоузлий, индуц-ют цветение и образ-ие партенокарпических (бессемянных) ягод, регулируют пол растений, активируют завязывание и разв-ие плодов, стимул-ют процессы прорастания семян.

Особенно эффектные ответные р-ии получены при изучении роста мутантов- карликов и розеточных форм растений, обрабат-ых гиббереллином. Финней изучал действие гиббереллина ГА₁ на рост карликовых мутантов кукурузы. Обработка ГА₁ не влияла на рост норм. растений, но резко стимул-ла удлинение стебля карлика, у к-ого был нарушен гиббереллиновый обмен. Аналогичный эффект наблюдали Витвер и Баковэк при обработке гиббереллином длиннодневных растений, к-ые в условиях короткого дня находились в розеточной форме. Гиббереллин индуц-л образ-ие гигантского цветущего стебля.

Удлинение стебля под действием гиббереллинов достигается за счет резкой активации процессов деления и растяжения клеток интеркалярных меристем. Ауксины на этот процесс не оказывают влияния. В свою очередь гиббереллины не действуют (/ оказывают слабый эффект) на рост изолированных междоузлий / колеоптилей, сильно реагирующих на обработку ауксином. Предполагается, что гиббереллины осущ-ют специф. регуляцию клет.цикла на этапе перехода от фазы G₂ к митозу.

Состояние покоя многих семян может быть преодолено обработкой гибберелловой кислотой (ГК). В ходе прорастании семян ГК контролирует, по крайней мере, 3 процесса: рост зародыша, размягчение слоев эндосперма, окруж-их зародыш, и мобилизацию запасных пит. в-в эндосперма. Обработка ГК повышает секрецию алейроновым слоем прорастающих семян злаков многочисл. гидролаз и их активность, особенно α-амилазы. Поэтому в пивоварении для ускорения получения солода ячмень обрабатывают ГК.
ЭТО НЕ ЗНАЮ ИЛИ НУЖНО!!!

Механизм действия гиббереллинов. Основным объектом в физиологических и молекулярно-генетических исследованиях механизма действия гиббереллинов служит изолированный алейроновый слой клеток эндосперма злаков. Главной моделью, к-ую используют для выяснения молекулярного механизма действия гиббереллинов, является процесс синтеза и секреции алейроновым слоем α-амилазы — фермента, расщепляющего крахмал. Алейроновый слой составляют клетки с толстыми клеточными стенками, окружающими крахмалистый эндосперм и содержащими много белковых тел. В ходе прорастания зерновки и на ранних этапах развития проростка под действием гиббереллинов происходит активация ферментов, к-ые гидролизуют крахмал и запасные белки эндосперма. В результате образуется много растворимых сахаров и аминокислот, перемещающихся к зародышу.

Следует особо отметить, что ГК стимулирует синтез и секрецию только α-амилазы. Другие гидролазы (например, рибонуклеаза, β-1,3-глюканаза) синтезируются в алейроновом слое независимо от гиббереллина. Гиббереллины контролируют только процесс их секреции клетками алейронового слоя в крахмалистый эндосперм. Эти факты свидетельствуют о том, что процессы синтеза гидролитических ферментов и их секреции идут (регулируются) независимо друг от друга.

Гидролиз крахмала осуществляется α- и β -амилазами. Продуктом гидролиза α -ами-лазы являются олигосахариды, содержащие остатки глюкозы; β -амилаза расщепляет эти олигосахариды до дисахарида мальтозы, к-ая под действием мальтазы пре-вращается в глюкозу. Фермент α-амилаза секретируется в крахмалистый эндосперм как алейроновым слоем клеток, так и щитком (семядолей зародыша злаков, к-ая граничит с эндоспермом зерновки). Большинство из вышеперечисленных процессов контролируется гиббереллинами, к-ые синтезируются в зародыше и транспортируются вначале в крахмалистый эндосперм, а затем в алейроновый слой эндосперма.

Получены убедительные доказательства того, что именно ГК обеспечивает регуляцию экспрессии гена α-амилазы. В промоторной зоне гена α-амилазы ряда злаков выделена высококонсервативная последовательность из 200-300 п.н., к-ая необходима для регулирования экспрессии гена ГК и к-ая обеспечивает специфичность именно к этому фитогормону. Этот участок называют GARC — гиббереллинрегулируемым комплеком. В этот комплекс входят 3 специфические нуклеотидные последовательности (бокса), необходимые для гиббереллинового ответа — пиримидиновый бокс, ТААСААА- и ТАТССАС-последовательности. За чувствительность гена α-амилазы к ГК отвечает ТААСААА-бокс, к-ый получил название GARE — гиббереллинотвечающего элемента. GARE самостоятельно может обеспечивать чувствительность гена α-амилазы к ГК. Два других бокса — пиримидиновый и ТАТССАС — также необходимы для полноценного ответа на гиббереллин. Эти три бокса, объединенные в GARC (гиббереллинрегулируемый комплекс), и являются мишенью соответствующих факторов транскрипции, образующихся в ответ на гиббереллин.



Установлено, что одним из ранних генов, активируемых гиббереллинами, является ген MYB, продуктами к-ого являются ДНК-связывающие белки, относящиеся к семейству MYB-белков, найденных у насекомых, дрожжей и растений. MYB-белки являются транскрипционными факторами, к-ые регулируют процессы роста и развития. Предполагается, что именно MYB-белок является тем транскрипционным фактором, к-ый связывается с промотором гена α-амилазы и запускает синтез этого фермента. Местом взаимодействия MYB-белка с промоторной частью гена α-амилазы является GARC-последовательность нуклеотидов.

MYB-белки также участвуют в регуляции экспрессии других генов, регулируемых ГК, например тех, к-ые кодируют ряд ферментов синтеза антоцианов. К числу таких ферментов относятся халконсинтаза, халконизомераза и дегидрофлавонол-4-редуктаза. Однако пока не получено доказательств того, что продукты MYB-генов участвуют в регуляции удлинения стебля и цветения — самых характерных эффектов, вызываемых гиббереллинами в растениях.

Наиболее эффективным способом выявления возможных рецепторов ГК и механизма передачи гиббереллинового сигнала является изучение мутантов, у к-ых повреждена система ответных реакций на обработку этим гормоном. В процессе скрининга было выделено два основных типа таких мутантов: нечувствительные к ГК карлики и растения с сильно удлиненными и утонченными побегами (из-за так называемой slender-мутации).

Получен ряд карликовых мутантов, например d8 (dwar f) на кукурузе и gai (GA- insensitive) на арабидопсисе, к-ые нечувствительны к обработке ГК. Когда ген GAI был клонирован, оказалось, что его продуктом является фактор транскрипции, к-ый в отсутствие гормона функционирует как репрессор на пути трансдукции гиббереллинового сигнала. ГК снимает эту репрессию. Однако при повреждении гена GAI могут появляться не только ГК-нечувствительные карлики, но и ГК-нечувствительные великаны.

У ГК-нечувствительпого карлика мутация gai затрагивает только ту часть, к-ая отвечает за взаимодействие с гиббереллином. Из-за повреждения участка связывания с гормоном белок GAI продолжает работать как репрессор даже в присутствии ГК — растение превращается в ГК-нечувствительного карлика. Если же повреждения затрагивают участки, отвечающие за саму репрессию, то белок GAI перестает функционировать как репрессор и теряет спос-ть подавлять транскрипцию, растение при этом превращается в ГК-нечувствительного великана.

Из числа slender-мутантов особого внимания заслуживает spy (spindly) мутант арабидопсиса. Продукт гена SPY также является белком-репрессором, к-ый в отсутствие гормона подавляет процессы, запускаемые ГК. Предполагается, что белок, кодируемый геном SPY, представляет собой особую N-ацетилглюкозаминтрансферазу — фермент, к-ый катализирует реакцию гликозилирования белков. Эта реакция может приводить к потере активности белков / блокировать их фосфорилирование. Влияние ГК заключается в снятии репрессирующего эффекта SPY-белка. Таким образом, GAI- и SPY-белки функционируют как репрессоры гиббереллинового ответа. Присутствие гиббереллина снимает эту репрессию. Известны и другие ГК-регулируемые гены, кодирующие как репрессоры, так и активаторы гиббереллинового сигнала.

Еще одним важным элементом проведения гиббереллинового сигнала являются ионы Са²⁺. Через 1-4 ч после обработки ГК конц-ия ионов Са²⁺ в цитоплазме клеток алейронового слоя возрастает. Полагают, что ионы Са²⁺ и кальцийсвязывающий белок кальмодулин участвуют в гиббереллининдуцируемой секреции α-амилазы и других гидролаз. В 1996 г. Гилрой предположил, что ГК-индуцируемая экспрессия гена α-амилазы не зависит от ионов Са²⁺, в то время как ГК-активируемая секреция α-амилазы осуществляется кальций-зависимым путем.
17. Этилен: метаболизм и транспорт, физиологическое действие

Впервые участие этилена в регуляции роста растений установил в 1901 г. в Санкт-Петербургском университете Нелюбов, к-ый обнаружил, что светильный газ, содерж-ий этилен, вызывает у этиолир. проростков гороха т.н. «тройной ответ»: замедление растяжения стебля, его утолщение и горизонтальную ориентацию — диагравитропизм. В 1910 г. Коусинсом было устан-но, что летучее в-во, выделяемое спелыми апельсинами, ускоряет созревание бананов, к-ые хранятся вместе с ними. В 1924 г. Денни показал, что преждевр. созревания апельсинов, бананов и др. плодов можно добиться обработкой этиленом. В 1934 г. Гэйн с коллегами идентифицир-ли этилен химически как норм. продукт метаболизма растений (он сод-ся в газообр. пр-тах метаболизма яблок) и, исходя из его физиолог. эффектов, впервые назвали его гормоном. В дальнейшем выяснилось, что этилен способны выд-ть не только плоды, но также листья, цветки, облиственные стебли, корни и семена.

Этилен образ-ся покрытосем. и голосем. растениями, папоротниками и зелеными водорослями, мхами (Sphagnum squarrosum, Polytrichum juniperinum, Funaria hydrometrica), нек-ыми видами грибов (Mucor heminalis, Penicillium corylophillum, P.digitatus, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Candida vartiovatia) и бактерий (Anacystis nidulans, Pseudomonas solanacearum, Escherichia coli).

Синтез этилена и цикл Янга. Этилен может синтезир-ся практ-ки во всех частях растит. орг-ма, однако более активно он образ-ся в меристемат. тканях и в зоне узлов. Поскольку синтез этилена индуц-ся при стрессовых возд-иях (затопление, охлаждение / высокие температуры, патогены, засуха), его иногда называют стрессовым гормоном.

В 1964 г. Либерман и Мэпсон показали, что разл. ткани растений спос-ны превращать ₁₄С-метионин в ¹⁴С-этилен. Однако окончательно механизм синтеза этилена удалось установить только через 15 лет, когда был выявлен его непоср-ый предш-к. Очень важным этапом в расшифровке пути синтеза этилена в растит. тканях стала работа Адамса и Янга, в к-ой они показали, что превращение метионина в этилен осущ-ся через синтез 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК), к-ая является непоср-ым предш-ком этилена и образ-ся из S-аденозилметионина.

Превращение S-аденозилметионин а в АЦК осущ-ет локализованный в цито-плазме фермент АЦК-синтаза. Гены, контролир-ие синтез АЦК-синтазы, активи-руются при разл. стрессовых возд-иях (механические повреждения, резкие колебания температуры, засуха, анаэробиоз), а также гормон. сигналами (ауксин и сам этилен). Последний этап синтеза этилена требует наличия кислорода и катализ-ся ферментом АЦК-оксидазой, к-ая преобразует АЦК в этилен. Однако в этилен превращ-ся не вся АЦК, часть ее может образ-ть очень устойчивую конъюгированную форму — N-малонил-АЦК.

Поскольку метионин явл-ся единственным ист-ком для синтеза этилена, дол-жен сущ-ть механизм постоянного пополнения запасов этой серосод-ей аминокислоты. Таким ист-ком в клетках растений служит цикл Янга, в ходе к-ого CH₃-S-группа, остающаяся от метионина после синтеза АЦК, вновь исп-ся для его образ-ия. Процесс синтеза этилена резко ускоряется в собранных плодах, при таких поврежд-их возд-иях, как засуха, затопление, охлаждение и механ. повр-ие, а также под возд-ием ауксина. Поэтому необх-мо иметь в виду, что нек-ые ауксиновые эффекты м/б опосредованы изменением сод-ия этилена.

С др. стороны, известно, что этилен способен угнетать процесс полярного тр-та ауксина и т. обр. влиять на распред-ие ауксина в растениях. С угнетением полярного тр-та ИУК связаны такие эффекты этилена, как старение органов, опадение листьев, цветков и плодов.

Физиологическая роль. Спектр физиол. процессов, контролир-ых в растении этиленом, очень широк и включает созревание плодов и старение тканей, прорастание семян и рост клеток растяжением, развитие цветков и эпинастию, образ-ие корневых волосков и защиту от патогенов. Этилен участвует в ответных р-иях растит. орг-мов на разл. стрессовые возд-ия (резкие колебания t, анаэробиоз, засуха, механ. повр-ия), а также способен включать ряд эл-тов в системе защиты растений от патогенов — синтез ферментов, разруш-их клет. стенку грибов и фитоалексинов.

В обиходе термин «созревшие плоды» предполагает их готовность для употр-ия в пищу. Для растения же созревание означает готовность семян и плодов для распр-ия. В ходе созревания плодов происходит расщепление эл-тов клет. стенок, гидролиз крахмала, исчезн-ие орган. кислот и фенольных соед-ий (включая таннины) и накопление сахаров. Этилен ускоряет эти процессы, и поэтому его часто называют гормоном созревания.

Одной из хар-ых особ-тей нек-ых фруктов, к-ые быстрее созревают при обработке этиленом, является усиление дыхания перед созреванием, называемое климактерическим. У таких плодов за усилением дыхания следует резкая активация синтеза этилена. Этот процесс идет в автокаталит. режиме, поскольку устан-но, что обработка плодов этиленом активирует его синтез и вызывает еще большее повышение сод-ия этого гормона в тканях при созревании. Климактерические плоды: яблоки, груши, сливы, бананы, авокадо, манго, персики, томаты. Если же в процессе созревания интенс-ть дыхания в тканях не изменяется, такие плоды называются неклимактерическими (цитрусовые, виноград, вишня, ананас, клубника и др.).

Наиболее хорошо изученной физиолог. р-ией растений на этилен является «тройной ответ», т.е. замедление роста в длину стебля, его утолщение и гори-зонтальный рост. Эти ответные р-ии показаны для всех двудольных растений, а также для колеоптилей и мезокотилей злаков.

Замедление удлинения стебля под действием этилена происходит из-за его утолщения, вызванного изодиаметрическим ростом клеток. При этом число клеток и их конечный объем не отличаются от таковых у растений, к-ые не были обработаны этиленом. При возд-ии этилена меняется напр-ие роста клетки с продольного на поперечное. Этот эффект объясняется тем, что этилен изменяет ориентацию (на 90°) микротрубочек кортикального слоя цитоплазмы и целлюлозных микрофибрилл в клет. стенке. Хорошо известно, что напр-ие растяжения растит. клеток определяется ориентацией кортикальных микротрубочек и микрофибрилл целлюлозы, к-ые обычно ориентир-ся поперек продольной оси растягивающейся клетки.

Важную роль этилен выполняет в процессе прорастания семян двудольных растений. Верхняя часть формирующегося побега этиолир. проростков двудольных растений имеет форму крючка из-за того, что растяжение клеток в его верхней части идет интенсивнее, чем в нижней. Такая форма облегчает продв-ие проростка через почву и защищает от повреждения его нежную апикальную меристему. Процесс формир-ия крючка и поддержания его за счет асимметрич. роста контролир-ся этиленом. Интенс-ть синтеза этилена максимальна в зоне изгиба и возрастает при механ. раздражении крючка при продв-ии и трении его о почвеные частицы. Как только этиолир. проросток выходит из почвы на свет, происх-т быстрое снижение скорости синтеза этилена и крючок распрямляется.

У многих видов растений перед прорастанием семян резко возрастает сод-ие этилена. Устан-но, что экзогенная обработка этиленом спос-ет прекращению покоя и ускоряет прорастание семян злаков и разв-ие почек у древесных растений, активирует рост клубней картофеля и луковичных.

Еще одной функцией этилена является индукция эпинастии, т. е. опускания листьев в результате того, что скорость роста клеток на верхней стороне черешка выше, чем на нижней. Не все растения способны совершать эпинастические движения в ответ на обработку этиленом.

Очень характерным процессом, к-ый активирует этилен, является ускорение старения листьев. Другой тип фитогормонов — цитокинины — тормозят этот процесс. Помимо листьев, этилен также ускоряет старение цветков и плодолистиков. Если же цветки обработать ингибиторами синтеза / действия этилена, их цветение будет происходить более длит. время. Обработка этиленом также спос-на влиять на форм-ие пола у двудомных растений, стимулируя, н-р, у огурцов образ-ие большего числа женских цветков.

Этилен является осн. регулятором опадения листьев — процесса активного отделения листа от ветви без повр-ия ее живых тканей. Опадение листьев обусловлено образ-ием зоны отделения у основания черешка, вдоль к-ой лист отделяется от ветви. Отделит. зона может также формир-ся перед опадением цветков и плодов. В зоне отделения образуется 2 слоя клеток: отделительный слой, по к-ому происходит разлом, и защитный слой, к-ый предохраняет обнажающуюся при опадении листа поверхность от высыхания и внедрения патогенов.