Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
 Скачать 1.38 Mb.
|
|
37. СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ 1) Платирование в агаре. Суть метода – смешивают суспензию протопластов с равным объемом 1-1,5% агара (45С). Разливают в чашки Петри слоем толщиной 1-3 мм. Инкубируют при определенной температуре. 2) культивирование в висячей/сидячей капле. Суть метода – с помощью автоматической пипетки распределяют протопласты по маленьким каплям (обычно в пределах 20-40 мкл) на крышке или на дне чашки Петри. Чашки запечатывают и хранят при высокой влажности. 3) культивирование в жидкой среде на агаре или агарозе Суть метода – суспензию протопластов с удвоенной плотностью распределяют поверх застывшей агаровой среды такого же объема. Запечатывают и 2-3 суток культивируют неподвижно, затем ставят на качалки. Можно вырезать блоки с вросшей в них культурой и перенести в жидкую среду на качалки. По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды, применяемые для их культивирования, подобны таковым для клеточных культур. Чаще всего используют среды Мурасиге и Скуга, Нагата и Такебе, Гамборга В5, Као и Миханлюка. Существенным их отличием является увеличение в 2-4 раза концентрации кальция и присутствие ос.мотиков. Температура, при которой культивируются протопласты, варьирует в значительной степени в зависимости от специфики вида. Например, для пшеницы это 22 °С, для другого представителя злаковых - росички кроваво-красной - 30 °С. Обычно протопласты не выдерживают даже незначительного отклонения от оптимальной температуры. Свет высокой интенсивности губительно действует на свежие выделенные протопласты. Оптимальные значения освещенности варьируют в широких пределах. Например, протопласты люцерны образуют колонии в абсолютной темноте, а протопласты немезии оптимально растут при освещенности 80 ОООлк. В процессе культивирования интактные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало каллусной ткани. Дальнейшая задача - получение из каллусной ткани растений-регенерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых. Однако успешно осуществляется регенерация растений из протопластов пасленовых и других культур. 38. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации. В отличие от обычной гибридизации, где сливаются половые клетки, в качестве родительских при слиянии протопластов используются диплоидные клетки растений. Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических. При физическом способе слияния протопластов, разработанном протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2 - 3 протопластов, либо цепочки из 5 - 6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов. Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са2+", которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 - 11, концентрация Са2+ 100 - 300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция - их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой. При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния - АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов. При слиянии протопластов можно выделить два процесса: адгезию и собственно слияние мембран. Адгезия — следствие определенных свойств поверхности протопласта. Она редко наблюдается, если протопласты суспендированы в растворе неэлектролитического осмотика, такого, например, как маннит или сахароза, без добавления катионов или с очень низкой концентрацией последних. 39. Установлено, что изменения в морфологии могут наблюдаться в процессе длительного культивирования каллусов. Например, для каллусных культур ячменя выявили семь основных морфологических типов клеток: 1) Гигантские, удлиненные, сильно вакуолизированные клетки, без явно выраженного ядра (200-400 мкм); 2) Молодые округлые паренхимные клетки без четко выраженного ядра (40-60 мкм); 3) Меристематические клетки (15-50 мкм); 4) Большие клетки с зернистой цитоплазмой и большими ядрами (50-100 мкм); 5) Мелкие меристематические клетки с сегментированным типом деления (15-20 мкм); 6) Трахеиды; 7) Паренхимные клетки. В каллусных культурах наблюдается гораздо большее разнообразие форм и размеров клеток, чем в суспензионных культурах. Морфологически гетерогенные каллусные ткани включают: - паренхимные клетки; - меристематические клетки; - некротические клетки; - отдельные клетки или зоны проводящей системы. Основной особенностью популяции соматических клеток является нестабильность генома клеток и их генетическая гетерогенность – появление в процессе культивирования полиплоидных, анеуплоидных клеток, клеток с хромосомными абберациями и генными мутациями. Причины генетической гетерогенности: 1. Генетическая гетерогенность исходного материала. 2. Нарушение коррелятивных связей при выделении экспланта. 3. Действие компонентов среды. Ауксины, особенно 2,4-Д – мутагены, цитокинины способствуют полиплоидизации. 4. Длительное субкультивирование, при котором накапливаются генетически измененные каллусные клетки. Генетическую гетерогенность клеток любой популяции не следует рассматривать как недостаток, более того, это, как правило, необходимое условие ее существования, основа адаптационных возможностей популяции. 40. Одной из особенностей культуры клеток является физиологическая асинхронность – в каждый момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Причины возникающей асинхронности: 1. Особенности вида, сорта, генотипа растения, особенности экспланта. 2. Стрессы культивирования (неоптимальная среда). 3. Изменение баланса эндогенных гормонов и концентрации в среде экзогенных гормонов в процессе выращивания. 4. Генетическая гетерогенность клеток и клонов. 5. Аномалии митотического цикла клеток in vitro. 6. Физические факторы (температура, свет, аэрация). К настоящему времени разработаны различные методы синхронизации клеток. Обычно для этого используют приемы, останавливающие клеточный цикл на границе его фаз. Например: 1) двукратное исключение из среды фосфора (в начале эксперимента и после определенного интервала времени); 2) введение в питательную среду 5-аминоурацила, который задерживает клетки на границе G1/S цикла, но и после удаления ингибитора деление клеток не начинается, пока в питательную среду не внесли фитогормоны. 3) использование 5-метилоксимочевины, которое наиболее удачно, данный подход позволяет накопить более 80% клеток на G1/S фазе клеточного цикла. Следует отметить, что синхронизировать популяцию можно лишь на небольшой промежуток времени. Через 3-4 недели, если не принимать специальных мер, популяция вновь становится асинхронной. В период лаг-фазы (1-3-е сутки) изменение ультраструктуры клетки свидетельствует об активной подготовке клетки к пролиферации. Изменяется поверхность ядра за счет инвагинаций, увеличивается количество рибосом, сгруппированных в полисомы, наблюдается присутствие многочисленных цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума и появление липидных капель, а также усиленное деление пластид. В фазе экспоненциального роста (10-е сутки) наиболее функционально активны пластиды и митохондрии. Митохондрии становятся конденсированными, в них появляется большое количество крист. В фазе стационарного роста значительно увеличивается вакуолизация клеток, эндоплазматический ретикулум становится агранулярным, свободные рибосомы обнаруживаются редко. В каллусных клетках гороха на стационарной фазе наблюдали появление осмиофильных капель, миелинподобных тел, как в цитоплазме, так и в вакуоли, накопление крахмала в пластидах и редукцию тилакоидной системы. 41, 43. Наиболее важная хар-ка Пп – её рост. Рост Пп клеток in vitro оценивают по числу составляющих её клеток / по их общей биомассе. Клетки in vitro проходят фазы ростового цикла, хар-ые для роста кл. высших Р. in vivo. Ростовой цикл / цикл выращивания – период от помещения инокулюма на свежую ПС до след-го субкульт-ия.Несмотря на морфол-ую и физиол-ую гетерогенность внутри Пп, рост клет. Культур описывается S-образной кривой. Фазы ростового цикла: Лаг-фаза – начальный период в ростовом цикле (клетки не размн-ся и не увел-ся в размерах). На протяжении этого периода в клетках происходят важные изменения, напр-ые на подготовку и вступление их в фазу активного деления (увел-ся поглощение и экскреция вещ-в, увел-ся V цит-мы и число органелл, повыш-ся сод-ие АТФ, ГТФ (Гуанозинтрифосфат / пуриновий нуклеотид), НАДФН2 (никотинамидадениндинуклеотидфосфата)), активизируется дыхание, полисомы свободные, нач-ся с-з ДНК). Логарифмич-ая фаза – огранич-ый период в ростовом цикле. Происходит экспоненц-ое (логарифм-ое) увел-ие кол-ва кл. за счёт их интенс-го деления, и как следствие – увел-ие сухого вещ-ва. Набл-ся цитолог-ие и метабол-ие изменения (исчезает вакуоль, увел-ся V цит-мы, гиалоплазма становится плотной, увел-ся число митох-ий и полирибосом, полисомы прикреплённые; набл-ся максимум с-за РНК и Б, дыхание активное, происходит с-з индуцибельных ферментов и пластидный с-з липидов, У, пуринов, терпенов). В течение поздней экспоненц-ой фазы набл-ся замедление клет. деления, увел-ие биомассы происходит за счёт растяжения клеток. Линейная фаза – очень короткая. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянная. Фаза замедления роста обусловлена истощением ПС (в основном источников углеводного, азотного и фосфорного питания). Размер клеток продолжает возрастать, но кол-во не изменяется. Увел-ся морфол-ая гетерогенность клеток и органелл. Цитолог-ие изменения (изменение числа органелл, изменение формы митохондрий и др.) М/т происходить выбросы этилена. Набл-ся с-з ферментов, начинается с-з «белков старения». Стационарная фаза – в ходе этого периода каллусная / суспензионная культура достигает максимума сухого веса. В культуральной среде накапл-ся прод-ты жезнед-ти кл, угнетающие рост культуры. В клетках резко ум-ся V цит-мы, вакуоль достигает максимальной вел-ны. Набл-ся разрушение органелл, резко падает активность дыхания. Повышается акт-ть оксидаз и гидролаз. Для того чтобы не наступила гибель клеток, необх-ма пересадка культуры на свежую ПС. Рост можно регул-ть различными фак-ми и оценивать по показателям (размер, объём, масса, число клеток, кол-во белка и ДНК). Тот / иной показатель исп-ся в зависимости от целей эксперимента. Переход клеток из одной фазы в др. контр-ся внутр-ми (продолж-ть растяжения, состояние кл.) и внеш-ми (состав ПС, уровень рН, сод-ие кислорода, темп-ра и т.д.) факторами. 42. К настоящему времени разработаны различные методы синхронизации клеток. Обычно для этого используют приемы, останавливающие клеточный цикл на границе его фаз. Например: 1) двукратное исключение из среды фосфора (в начале эксперимента и после определенного интервала времени); 2) введение в питательную среду 5-аминоурацила, который задерживает клетки на границе G1/S цикла, но и после удаления ингибитора деление клеток не начинается, пока в питательную среду не внесли фитогормоны. 3) использование 5-метилоксимочевины, которое наиболее удачно, данный подход позволяет накопить более 80% клеток на G1/S фазе клеточного цикла. Следует отметить, что синхронизировать популяцию можно лишь на небольшой промежуток времени. Через 3-4 недели, если не принимать специальных мер, популяция вновь становится асинхронной. 43=41 44. Дифференцировка клеток растений in vitro может происходить различными путями и в разной степени — от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. Выделяют следующие ее типы: 1. Наиболее простой вид дифференцировки – появление в каллусной ткани дифференцированных клеток, имеющих специфическое морфологическое строение и выполняющих особые функции. В отдельных случаях наблюдается возникновение эпи-бластов – клеток, депонирующих запасные вещества, а также вторичные метаболиты. 2. Гистологическая дифференцировка каллусных клеток (гистогенез) – образование в каллусе различных тканей. В каллусной ткани может проходить образование млечников, волокон, трихом; сюда же можно отнести образование элементов сосудистой системы – трахеи и трахеиды ксилемы, ситовидные трубки и клетки-спутницы флоэмы. 3. Органогенез – это дифференциация каллусных клеток в целые органы; превращение их в апексы стеблей или корней, флоральные элементы. 4. Соматический эмбриогенез – образование в каллусной ткани / суспензионной культуре эмбриоидов, т. е. зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. 45. Гистологическая дифференцировка (гистогенез) in vitro может осущ-ся по пути либо ксилемогенеза, либо флоэмогенеза. Для изучения процесса гистогенеза в основном используются каллусные культуры и экспланты сердцевины стебля, фрагменты клубней. Превращение каллусной кл. в проводящие эл-ты: вначале каллусная клетка увел-ся в размерах, становится полярной. В клет. стенке увел-ся кол-во гемицеллюлоз и умен-ся кол-во пектинов. Затем осущ-ся лигнификация клет-ых стенок, при этом возрастает активность фенилаланин-аммиаклиазы. Активность данного фермента достаточно хорошо коррелирует с интенсивностью процесса гистогенеза (можно исп-ть в кач-ве маркера). Превращение каллусной кл. в сосудистый эл-т определяют гормональные факторы, в основном ауксины. Впервые экспериментальное -во влияния ауксина на образование эл-ов проводящей с-мы в каллусе было выполнено франц. ботаником (прививал маленькие почки – источники с-за ауксина – на пов-ть культуры ткани корня цикория). Примерно через месяц в паренхимной ткани ниже привитых почек наблюдалось образование сосудистых узелков и пучков. Позже было показано прямое действие ауксина на ксилогенез. Вместо развивающейся почки на пов-ть каллуса помещали агаровый блок, сод-ий ауксин, и наблюдали развитие проводящих пучков. Эффект ауксина на дифференциацию проводящих эл-ов в каллусной культуре тесно связан с влиянием сахарозы. Низкие конц-ии сахарозы (2 %) вызывают преим-ное образование эл-ов ксилемы, а высокие (8 %) – флоэмы. Стимулирующее действие цитокининов на диф-ию трахеид в основном показано при наличии ауксина. Оптимальное соотн-ие ауксина и цитокинина для индукции гистогенеза изменяется в завис-ти от вида ткани. Исп-ие гиббереллина в качестве регулятора роста при культ-ии клеток и тканей in vitro чаще всего неэффективно, введение его в состав среды одновременно с ауксином оказывает активирующее действие на диф-ию трахеид. 46. Морфогенез в культуреinvitro принято делить на два типа: -образование монополярных органов: апексы; вегетативные побеги; побеги, развивающиеся как флоральные элементы; кончики корней; -образование биполярных органов, развивающихся как соматические эмбриоиды. Кроме того, различают прямой и непрямой органогенез. Прямой органогенез — это путь, при котором развитие корней, стеблевых и цветочных почек происходит непосредственно из клеток экспланта без образования каллуса. Примером прямого органогенезаinvivo иinvitro является образование стеблевых почек у льна. Так, если у 15-дневных проростков льна удалить верхушку стебля, то через определенный промежуток времени из эпидермальных клеток гипокотиля происходит образование многочисленных стеблевых почек. Позже одна из почек доминирует в развитии и дает полноценный стебель. Если сегмент гипокотиля льна размером примерно 15 мм поместить на агаризован- ную культуральную среду с фитогормонами, то развитие может получить до 170 проростков, формирующихся как из эпидермальных, так и из субэпидермальных клеток. Непрямой органогенез — путь формирования морфологических структур, приводящий к образованию корней, стеблевых и цветочных почек в каллусной культуре. На рис. 5.2 показаны возможные пути преобразования при культивировании изолированных растительных тканей и индукции морфогенеза.  |