Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений

• Название: 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
• Анкор: Шпоры культура клеток органов и тканей
• Дата: 19.09.2020
• Размер: 1.38 Mb.
• Имя файла: ККОИТ.docx
• Тип: Документы; #138687
• страница: 10 из 14

60. In vitro размножение растений это микроразмножение меристемой или другой изолированной тканью растения. В нашей стране и за рубежом данный метод применяют для размножения гвоздики, хризантемы, лилии, герберы, розы, орхидеи, фрезии, гладиолусов, антуриума, бегонии, астры, тюльпанов и др.

При помощи метода размножения in vitro получают высококачественный суперэлитный посадочный материал.

Меристема — ткань верхушечной части стебля.

Она играет особо важную роль в размножении, поскольку остается в здоровом состоянии даже в том случае, если все остальное растение заражено вирусом. Культивирование in vitro меристемы больного экземпляра дает возможность получить новое, здоровое растение и ускорить производство посадочного материала, свободного от вируса.

С исходного маточника снимают черенки. Под стереоскопическим микроскопом стерильным инструментом (пинцетом, скальпелем и др.) обнажают точку роста. Срезают верхушечную меристему с двумя зачаточными листочками и переносят в пробирки со специально подобранной питательной средой.

Пробирки маркируют и помещают в камеру искусственного климата. После разрастания меристемной ткани побеги без корней разделяют в стерильных условиях и переносят каждый в индивидуальную пробирку. Через определенное время растения из пробирок пересаживают в горшочки с субстратом.

Вместо меристемы используют и другой кусочек растительной ткани. С верхушки растения аккуратно срезают молодые листовые побеги и помещают в питательную среду, где развиваются каллюсы. После прохождения через несколько питательных сред развиваются молодые растения, пригодные для посадки в почву.

Подобные методы размножения растений достигли такого высокого уровня, что из одной клетки получают полноценное растение. Сейчас растения выращивают из протопластов (живых клеток, стенки которых разрушены), полученных из клеток листа. С молодого растения берут маленькие верхушечные листики, помещают их в раствор, содержащий комплекс ферментов, способных разрушать стенки клеток, и получают протопласты. Под действием раствора ферментов протопласты высвобождаются из клеточной оболочки и приобретают сферическую форму, защищая таким образом протоплазму.

Далее протопласты развиваются в питательной среде, где происходят их деление и образование новых клеточных оболочек. В этих условиях в течение двух недель каждый протопласт дает группу клеток или микрокаллюсов. В следующей питательной среде микрокаллюсы развиваются в каллюсы обычного размера, их клетки начинают делиться, образуя побег. В следующей питательной среде побег развивается в растение с корнями, которое высаживают в землю.

61.Процесс клонального микроразмножения можно разделить на несколько этапов: 1-выбор растения-донора, изолирование и стерилизация экспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitro; 2-собственно размножение; 3-укоренение размноженных побегов; 4-высадка растений-регенерантов в почву.

Третий этап является наиболее трудоемким, поскольку от него во многом зависит успех клонального микроразмножения. На данно этапе, как правило, меняют основной состав среды. Уменьшают в 2, а иногда и в 4 раза концентрацию минеральных солей в среде Мурасига и Скуга, снижают концентацию сахара до 0,5-1 % и полностьюисключают цитокинины, оставляя лишь ауксины. В качестве стимулятора корнеообразования индолилмасляная кислота (ИМК), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), или НУК (нафтилуксусная кислота). Укоренение микропобегов проводят 2 способами: 1-выдерживание микропобегов в течение 2-24 ч в стерильном концнтрированном растворе ауксина с последующими их культивированием на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка); 2-культивирование микропобегов в течение 3-4 недель непосредственно на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях.

Считается перспективным укоре­нение побегов, полученных in vitro, в стерильных субстратах при повышен­ной влажности либо в атмосфере ис­кусственного тумана. По способ­ности к укоренению in vitro представлен широкий ди­апазон данных — от легко укореняе­мых видов (земляника) до отсутствия укоренения (груша каллариана). Поэтому неудивительно, что многие считают успешное укоренение побегов in vitro ключевым этапом микроклонального размножения.

62. Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и их гибель. Это связано с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. При разработке методов клонального микроразмножения необходимо учитывать влияние генетических, физиологических, гормональных и физических факторов. Это связано с тем, что методика, разработанная для определенного клона одного вида не всегда может быть применена для размножения других представителей этого вида и тем более растений другого вида. Возраст первичного экспланта оказывает существенное влияние и на укоренение микропобегов, размноженных in vitro: с увеличением возраста исходного материала снижается способность побегов и черенков к укоренению. К физиологическим факторам: время (сезонность ) изоляции экспланта. Размер экспланта: чем меньше размер экспланта, тем меньшей регенерационной способностью он обладает, и наоборот, в экспланте большего размера увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других потагенов, что препятствует оздоровлению размноженных в культуре тканей растений. Гормональный баланс питательной среды – немаловажный фактор, влияющий на успех клонального микроразмножения. При высоком соотношении цитокининов к ауксинам происходит развитие пазушных меристем или образование адвентивных почек, при низком – индуцируется корнеобразование, при промежуточных значениях наблюдается образование и пролиферация каллуса. На клональное микроразмножение и рост растений также влияет кислотность питательной среды, интенсивность освещения, спектральный состав света, температурный режим.


63. Небольшой размер экспланта, применяемого для клонального микроразмножения, его поверхностная стерилизация, асептический перенос на питательную среду и субкультивирование в условиях, исключающих инфицирование, приводят к оздоровлению полученных растений от нематод, грибных и бактериальных патогенов. Но это недостаточно для оздоровления созданного посадочного материала от вирусов, вироидов, микоплазм. Вместе с тем именно вирусные болезни – причина потери от 10 до 50% урожая с\х культур, размножающихся вегетативно.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают t до 37 ⁰С путем ежедневного ее увеличения на 2 ⁰С. Помимо эффекта термотерапии, приводящего к освобождению растений от вирусов, выявлено также положительное воздействие высоких t на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, хризантемы, фрезии) в условиях in vitro.

Еще один способ, применяемый для освобождения растений от вирусов – хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, вирозола. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При использовании вирозола % безвирусных ратсений увеличивался до 80-100%.

Важное место принадлежит в работе диагностики зараженных растений. Наиболее чувствительным методом тестирования является ИФА, для которого требуется минимальное количество материала из любого органа растения.

64. Методы конроля вирус.инфекции у раст.в куль-ре кл.in vitro.

Выполн-ся на осн.3-х методов : м-д апикальных меристем, м-д термотерапии и химиотерапии. М-д апикальных меристем. Меристема – конус активно делящихся кл, распололж-х на кончике побегов или корней. Использ-т меристему побегов шириной 0,1 мм и длин.02-0,4мм. Основан, на том, что распределение вируса в раст.неравномерно и наименьшая концентрация наблюд.в зоне апикальной меристемы. Вычленение апикальной меритсемы и высадка ее на пит.среду приводят к снижению концентр.или полной элиминации вируса в дочернем раст.после его регенерации из апик.мери-мы. Факторы элиминации вируса в кул-ре меристемы – явл.размер меристемы. Поэтому для кажд.раст.подбира-ся оптимальный размер мерс-м, обеспечив-й выс.уовень элиминации вирусо и приемлемый выход раст.-регенератов. Испол.среды Мурасиге, Скуга подбирая гормон.состав.

Термотерапия. Предшествует вычленению апикальных меристем. Термотерапия (лечение зараженных вир-ми болезнями раст-й воздействуя на них повыш. Тепмпер-р). До конца не изучен механ-м. Предполаг-т причины эллиминации вирусов: инактивация имеющихся вирусов, увелич.темпов с-за вирус-х частиц с последующей деградацией, блокиров.с-за РНК вируса. Различные вирусы по- размому относя-ся к термотерапии. Использ.темпер-ра 36-38*, гдев течении первой недели темпер-ру измен-т от 25-37,путем ежедневного увелич. На 2*. Фотопериод 14-16часов в сутки, влажность 75-90%. Продолжите-ть термотерапии зависит от культуры,сорта, состава вирусов. Химиотерапия. Использ.хим.соед-й – ингибиторов вирусов, кот.добавл.в состав пит.среды. Часто примен-т 1-в-Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол 3 карбоксимид (виразол). По мере конценрац.усилив-я про-с элиминации вирусов.но при концентр. Выше 20-50мг/л умен.темп роста.

Применение методов оздоровления посадочного материала не гарантирует полной элиминации вирусов в раст. В технологиях произв-ва оздоровления матер-ла обязательными явл.контроль вир.инфекц.при клональном микроразмнож., меры по защите раст.от повторного инфецирования, т.к. оздоровительный матер-л не приобретает устойчивости к вирусу.

Наличие вируса в раст.матер-ле испол. методы: 1) электронной микроскопии 2)иммуноферментный.анализ.


65. Методы контроля генетич-й чистоты раст.в кул-ре in vitro

66 и 68. Методы контроля эмбриокультуры раст. in vitro. (+67 конец вопроса) Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой.

Преодолеть постгамную несовместим-ть поможет культура изолирова-х зародышей (эмбриокультура). Изоляцию и культивирование зародышей производят на различных этапах их развития. Различ.гетеротроф-. фазу развития, на котор.в зависимости от эндосперма и материнских тканей. И Афтотроф.фазу, зародыш синтезир-т необходим.для развития пит.в-ва., использ-я минеральные соли и сахарозу пит.сред-ы. Пит.средами для эмбриокуль-ры, среды Уайта, Мурасиге, Скуга, Гамборга. Концентрац.сахарозы %. Источник а/к – гидролизат казеина. Витам.гр.В, аскорб.к-та, биотин. Для культивир.незрелых зародышей доб.цитокинины и аукс. Культиврование изолиров-х зародышей как метод преодоления посг-ной несовмести-ти примен.при получении межвидовых, межрод-х, межподгрибных гибридов у более 30 родов: плодовые, зерновые, овощные кул-ры. В Нектор-х случ-х метод м/т модифицироваться введении промежуточного этапа получения каллуса и растений- регенерантов на его основе. Ме-дом Эмбриокул-ры получ-ны гибриды между трипсакум и кукурузой, гиб.подсолнечника, устойчивые к засухе, серой и белой гнилям,межвид.гибриды томатов, и т.д. Этот мед примен. для выращивания раст.из щуплых семян, для преодоления покоя семянпутем яровизации зародышей (тем самым сократить период их выращива-я). М-д эмбриок-ры использ-ся для культивирования гаплоидных зародышей.

Т.о.практические аспекты испол.метода эмбриокул-ры заключ.вслед.:

1) получ.межвид и межрод.гибридов. 2)сохр.для селекции матер-ла путем культивирования инвитро изолированных семяпочек и потерявших всхожесть семян; 3) сокращ.длительного селекцион-го проц-са путем ускорения инвитро прохождение жизненного цикла раст. 4) получ. Из гибридной каллусной тк самоклональных вариантов.

67. Осн.метод преодоления про- и пост- гамной несовместимости при скрещивании таксономически отдаленных видов.раст.

Понятия.Отдаленная гибридизация – скрещив.разных видов культурных и дикорастущих раст.

Программная несовместимость – физиологич. несовмести-ть патнеров, отд.гибрид., которая проявляется на этапе до оплодотворения. (несоответ-я по времени созревания пыльцы, отсут.секретов).

Различ.гетероморфную и гомоморф.несовместимость. Гетероморф. Связана с раличиями в морфологии цветков (длина тычинки и пестика – гетеростилия) Гомоморф. Несовместим. определ-ся взаимодейств-м отцовского гематофита и тканей столбика материнского организма. В итоге выльца не прорастает в столбик и оплодотв.не соверш-ся.

Выд-т прогамную (механизмы несовместимости проявля-ся до оплодотвор.) и пост- несовместим-ть (после оплодтвор). Для приодоления прогамной несовм-ти примен. оплодотв.in vitro. Использ. 2варианта оплодот-я:1) столбик пестика материн-го раст., кастрированного за 2-3дня до цветения, укорачивают в стерильных усл-х и завязь помещают в пит.среду. В день опыления из стериилизованнх пыльников отцовского раст.извлека-ся пыльца, кот.наносится в стерильных усл-х на срез завязи. 2) Завязь вскрывают и на пит.среду переносят кусочки плаценты с семяпочками, готовым к оплодотвор-ю. Оплодотворенные семяпочки увелич.в размерах в отличии от неоплодт-х. С использован-м этого метода было произведено опыление и получение жизнеспособнх семян при самоопылении у самонесовместимых видов семейтсва маковых, кукурузы, при опылении чужерод.пыльцы при отдаленной гибридизац.маковых, пасленовых. Исполь.для получ.межвидовых гибридов табака.

В проц-се отдал.гибридиз.м/т наблюд-ся явл. Постгамная несовмест-ти, выраженной в аномалиях развития гибридного организма на пути от оплодотвор-я до формир-я семян. Преодолеть несовместим-ть поможет кул-ра изолирован-х зародышей (эмбриокультура, + 66 вопрос)

68 +67+66. Культивирование незрелых гибридных зародышей (это преодоление постгамной несовместимости)
69.Экспериментальная гаплоидия;70.Преимущества и направления использования гаплоидов в селекции растений.

Под гаплоидами имеются в виду особи, несущие одинарный или гаплоидный набор непарных хромосом. В природе гаплоиды могут возникать спонтанно с частотой 1 гаплоид на 105-106 растений. Гаплоидные раст. отлич-ся меньшей высотой стебля, позднеспелостью, как правило, стерильны. Для восстановления исходного набора хромосом гаплоиды обрабат-ют колхицином, что позволяет получить фертильные растения, полностью гомозиготные по всем аллельным генам. Возможно и спонтанное восстановление ур-ня плоидности в проц. деления клеток. Гаплоидный ур-нь генотипа позволяет вести отбор рецессивных мутаций,кот. проявл-ся фенотипически. Все генетические «изъяны» организма на гаплоидном уровне обнаруживаются легче, чем на диплоидном. Кроме того, у гаплоидов не проявляются генетич. эффекты доминирования, но хорошо идентифицируются аддитивные и особенно эпистатические эффекты генов, что позволяет вести отбор ценных генотипов с такими эффектами.
Применение гаплоидов в селекции растен. позволяет решить следующ. задачи: 1)Быстрое получение константного нерасщепляющегося материала после гибридизации (в F2), гомозиготного по всем аллельным генам. В этом случае длительность селекционного процесса у самоопылителей сокращается на 3-4 года. 2)Эффективный отбор мутантов, т.к. при отсутствии явления доминирования все гены гаплоидов фенотипически проявляются и идет элиминация организмов, несущих летальные и полулетальные гены;
3)Получение моносомных линий и их использ-ние для ген. анализа и хромосомной инженерии;
Получение гаплоидов на основе методов культуры in vitro возможно 3 способами: андрогенез; гиногенез; партеногенез.

Андрогенез – развитие гаплоидных раст. на искусств. пит. среде из изолированных пыльников или микроспор.
Различ. прямой андрогенез, когда из пыльников развив-ся эмбриоиды, а затем растения;а также непрямой андрогенез, когда образованию эмбриоидов предшествует стадия формирования каллуса. Предпочтительнее прямой андрогенез, поскольку каллус может образовываться как из микроспор, так и из соматич. клеток пыльника. В последнем случае формируются гетерозиготные растения.

Андрогенез получил наибольшее распространение , он применяется более, чем для 250 видов растений, в том числе для таких хозяйственно ценных культур, как пшеница, рис, кукуруза, ячмень, люцерна, лен, апельсин, виноград,яблоня и др.
Гиногенез–развитие гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек.

Гиногенез получил меньшее распространение в сравнении с андрогенезом. Тем не менее он успешно применяется для получ. гаплоидов у сахарной свеклы, подсолнечника, картофеля, риса, пшеницы, кукурузы, ячменя, табака, хлопчатника. Этот метод может быть использован для получения гаплоидов у мужски стерильных растений. Для получения гиногенных гаплоидов исп-ют неопыленые завязи и семяпочки. Начало растению могут дать яйцеклетка, также синергиды и антиподы, а также окружающ. зародышевый мешок клетки соматических тканей (нуцеллус, интегумент). В этом случае регенеранты могут стать диплоидными или полиплоидными. Гиногенез аналогично андрогенезу может быть прямым и непрямым. В последнем случае эмбриоиды образ-ся из каллуса.

Партеногенез – развитие гаплоидов из гибридного зародыша, у кот. из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.
Суть метода получения гаплоидов на основе партеногенеза заключ-ся в гибридизации нескрещиваемых видов растений, в рез-те которой вследствие генетич. несовместимости происх. элиминация отцовских хромосом и начинает развив-ся гаплоидный зародыш. Наиболее успешно отработана методика такого получения гаплоидов у ячменя, где в качестве гаплопродюсера используют вид Hordeum bulbosum ( ячмень луковичный).