Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
 Скачать 1.38 Mb.
|
|
83. Депонирование, т.е. приемы, позволяющие изменить кинетику роста культуры увеличить время между пересадками. Существует несколько способов лимитирования ростовых процессов. Среди них наиболее доступным и широко распространенным приемом является снижение температуры, при которой происходит культивирование. Выбор температуры определяется холодостойкостью вида растения. Так, для депонирования картофеля использовалась температура 9–10 °С, а как яблони 1 °С. Для культур обычно растущих при 20–25 °С рекомендуют использовать температуры 4–10 °С, а для культур, нормально растущих при температуре около 30 °С, – плюс 15–20 °С. Другой прием заключается в добавлении к среде для культивирования соединений, способных замедлять рост растений. В качестве таких регуляторов могут выступать вещества, оказывающие осмотическое действие на клетки (маннит, сорбит, сахароза в повышенных концентрациях) или вещества гормональной природы (абсцизовая кислота, гидразид малеиновой кислоты, диметилгидразид янтарной кислоты, хлорхолинхлорид). В редких случаях для депонирования культур используют снижение содержания кислорода – гипоксию. Например, условия гипоксии создают, применяя смесь 90 % азота и 10 % кислорода. Иногда уменьшают концентрацию кислорода и одновременно снижают атмосферное давление (до 0,5 мм рт.ст). Обычно время хранения культур с ограниченным ростом составляет около года. Возможности лимитирования роста имеют свои пределы. Снижение скорости роста ниже некоторой точки приводит к гибели культуры. Для того, чтобы полностью отказаться от пересаживания культуры, необходимо использовать такой способ хранения, при котором происходит полная остановка метаболизма. В микробиологии для этих целей используют липофильную сушку. Но данный способ не приемлем для культур тканей высших растений. Современные знания не позволяют перевести культуры в состояние покоя, наблюдаемое в обычных семенах. Единственным способом полного прекращения роста тканей высших растений является криосохранение, т.е. хранение при температуре жидкого азота или других достаточно низких температурах. 84. Криоконсервация, т.е. хранение при t жидкого азота или других достаточно низких t. Лишь при низких температурах гарантируется не только полное прекращение метаболических процессов, но и полная сохранность образца и всех его основных свойств. Сверхнизкие t обеспечивают длительное хранение биологических объектов, т.е. организацию криобанков, из которых в любое удобное время может получить необходимый материал: семена, пыльцу, меристемы, эмбриоиды и клетки. Трудности криосохранения растений связаны со спецификой растительных клеток. Растительные клетки имеют большие размеры, большие вакуоли и много воды. Образование льда и дегидратация являются основными факторами, способными привести клетку к гибели при замораживании. Обычно кристаллы льда вначале образуются в межклеточном пространстве, а затем внутри клетки. Их рост оказывает механическое воздействие на клетки, разрушая клеточные мембраны. Максимальная скорость роста кристаллов льда находится в пределах от –20 °С до –60 °С. При температуре –140 °С рост кристаллов льда совершенно прекращается. Кристаллизация льда затрудняется в присутствии криопротекторов. К ним относится гетерогенная группа соединений, которые действуют различными механизмами на повышение выживаемости клеток при замораживании(различные сахара, глицерин, этиленгликоль). Действие криопротекторов состоит в снижении точки замерзания воды. Они способны связывать внутриклеточную воду, повышать вязкость раствора, защищая таким образом клетку от механического и осмотического стресса. Их можно разделить на две группы: проникающие и непроникающие (декстран, полиэтиленгликоль). Выживаемость клеток растений при криосохранении зависит от таких факторов как способность к холодовому закаливанию, скорости снижения температуры и условий оттаивания. Работа по криосохранению культуры клеток состоит из следующих этапов: 1. подготовки культуры клеток;2. добавления криопротектора; 3. замораживания;4. хранения в жидком азоте;5. оттаивания; 7. удаления криопротектора;8. рекультивирования и регенерации растений. Методы криосхранения разработаны для суспензионных культур. Перед применением криосохранения необходимо выбрать наиболее подходящей фазы развития культуры. На этапе подготовки культуры к замораживанию ее культивируют в условиях, способствующих образованию мелких клеток и синхронизации их деления. Для суспензионных культур важным моментом подготовки является концентрирование. На следующем этапе осуществляется предварительное культивирование клеток с криопротектором. Подбор криопротектора проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Обычно их вносят в среду для культивирования, которую затем доводят до стандартного рН и стерилизуют перед добавлением к культуре. При использовании криопротекторов возникают определенные трудности, связанные с их добавлением и удалением. За исключением крайне быстро проникающих соединений, таких как метанол, добавление криопротекторов первоначально вызывает сжатие клеток. Затем по мере проникновения криопротектора клетка постепенно приобретает свою первоначальную форму. При удалении криопротектора процесс протекает в обратном направлении, и клетка, возвращаясь в изотонические условия, сначала разбухает, а затем постепенно восстанавливает свои нормальные размеры. Наряду с выбором криопротекторов очень важно найти оптимальную программу замораживания. В настоящее время известны два способа криосохранения: программное (медленное) и сверхбыстрое замораживание. При медленном постепенном замораживании t в интервале от 0 до –40 °С снижается со скоростью 0,5–1 °С в минуту. При быстром замораживании объект в ампуле с криопротетором погружается сразу в жидкий азот. Программное замораживание довольно широко применяется для сохранения растительных объектов. Для этого требуются специальные конструкции с рабочей камерой, охлаждаемой с запрограммированной скоростью введение паров жидкого азота. Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано. Последним этапом технологии криосохранения является оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то оттаивание должно быть проведено как можно быстрее. Оттаивание производят погружая ампулы в водяную баню с t 40°С, а иногда и 60°С и выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда. Для поддержания жизнеспособности легко ранимых после оттаивания образцов и возобновления их роста требуется тщательный уход. Культуры пересажваются на восстанавливающую среду без промывки с сохранением в клетках криопротекторов. Для определения жизнесопосбности клеток, тканей, органов и организмов после низкотемпературного хранения существует много специальных методов. 85. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей растений in vitro можно разделить на две группы по их использованию с целью создания растений с новыми полезными признаками. Первая группа методов – это технологии для облегчения и ускорения селекционного процесса. Вторая группа – технологии, предназначенные для создания генетического разнообразия исходных форм для селекции. Метод отдаленной гибридизации. Однако при использовании данного метода сталкивается с проблемой нескрещиваемости из-за прогамной и постгамной несовместимости. Прогамная несовместимость – физиологическая несовместимость партнеров при отдаленном скрещивании, проявляющаяся на этапе до оплодотворения. Она может быть обусловлена следующими причинами: 1. физиологическими (несоответствие во времени созревания пыльцы отцовского растения или отсутствие секрета рыльца пестика материнского растения); 2.морфологическими (различие партнеров по длине столбика пестика и пыльцевой трубки). Основной способ преодоления прогамной несовместимости – оплодотворение in vitro. Метод заключается в совместном культивировании пыльцы и неоплодотворенных семяпочек, которое может осуществляться двумя различными способами. В первом случае столбик пестика срезается, завязь помещается на питательную среду, и на нее наносят готовую пыльцу. Второй вариант данного метода предполагает вскрывание завязи и перенос на питательную среду кусочков плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на их поверхности культивируется готовая пыльца. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Постгамная несовместимость – несовместимость таксономически отдаленных партнеров, которая наблюдается после оплодотворения, и приводит к образованию щуплых невсхожих семян. Физиологические причины постгамной несовместимости заключаются в несоответствии темпов развития зародыша и эндосперма либо непригодности (токсичности) метаболитов тканей материнского растения для питания зародыша. Способ их преодоления – культивирование незрелых гибридных зародышей на питательной среде. Выращивание зародышей на искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ. Для культивирования недифференцированных зародышей требуются более сложные питательные среды, содержащие не только витамины и стимуляторы роста, но и дополнительные трофические факторы (набор аминокислот, необходимые сахара, осмотики типа сорбита и маннита). Таким образом, практические аспекты использования метода эмбриокультуры заключаются в следующем: 1. возможности получения межвидовых и межродовых гибридов; 2. сохранении важного для селекции материала путем культивирования in vitro изолированных семяпочек и потерявших всхожесть семян; 3. сокращении длительного селекционного процесса путем ускорения in vitro прохождения жизненного цикла растения; 4. получении из гибридной каллусной ткани сомаклональных вариантов. Экспериментальная гаплоидия. Применение их позволяет легче обнаружить рецессивные мутации, редкие рекомбинации, экспрессию введенного извне генетического материала. Анализ включает изучение взаимодействия генов и генетической изменчивости, определения групп сцепления, установления числа генов, действующих на количественные признаки, установление локализации полигенов. Гаплоиды также широко используются в селекционном процессе. Одно из важнейших направлений их применения заключается в возможности получения из гаплоидных клеток путем их обработкми колхицином полностью гомозиготных диплоидных растений. Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Получение сомаклональных вариантов. Уже в первых цитогенетических исследованиях культивируемых клеток было обнаружено их удивительное кариотипическое разнообразие. С разработкой техники получения растений–регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающихся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений. Сомаклональную изменчивость стали рассматривать как источник генетического разнообразия в создании новых форм растений. 86. Использование культур растительных клеток для сохранения генофонда высших растений. В настоящее время один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений представляет собой культивирование in vitro клеток, тканей и органов растений. Для сохранения генофонда могут быть использованы: протопласты; суспензионные культуры клеток; каллусные культуры; пыльца и пыльники; культуры меристем побегов; зародыши; асептически выращиваемые целые растения. Сейчас достаточно интенсивно разрабат-ся различные способы депонирования коллекций, т. е. приемы, позволяющие изменить кинетику роста кул-ры, увеличить время между пересадками. Депонирование коллекций — сохранение коллекций без частых пересадок. Существует несколько способов лимитирования ростовых процессов. Среди них наиболее доступным и широко распространенным приемом является снижение температуры, при которой происходит культивирование. Выбор температуры определяется холодостойкостью вида растения. Так, для депонирования коллекции картофеля использовалась температура 9—10 °С, тогда как яблони — 1 °С. Другой прием заключается в добавлении к среде для культивирования соединений, способных замедлять рост растений. В качестве таких регуляторов могут выступать вещества, оказывающие осмотическое действие на клетки (маннит, сорбит, сахароза в повышенных концентрациях). В редких случаях для депонирования коллекций используют снижение содержания кислорода — гипоксию. Обычно время хранения культур с ограниченным ростом составляет около года. Снижение скорости роста ниже некоторой точки приводит к гибели культуры. Для того чтобы полностью отказаться от пересаживания культуры, необходимо использовать такой способ хранения, при котором происходит полная остановка метаболизма. В микробиологии для этих целей используют липофильную сушку. Но данный способ не приемлем для культур тканей высших растений. Единственным способом полного прекращения роста тканей высших растений является криосохранение, т. е. хранение при температуре жидкого азота или других достаточно низких температурах. Сверхнизкие температуры обеспечивают длительное (десятки и сотни тысяч лет) хранение биологических объектов, т. е. организацию криобанков, из которых исследователь в любое удобное время может получить необходимый материал: семена, пыльцу, меристемы, эмбриоиды и клетки. В РАН криобанк был впервые организован в 1976 г. Для начала в качестве модельного объекта была использована морковь в виде молодой суспензии клеток. Был разработан метод замораживания специально по отношению к данному объекту, после чего к-ки сохранялись в жидком азоте при температуре -196 °С. Трудности криосохранения растений связаны со спецификой растительных клеток. Образование льда и дегидратация являются основными факторами, способными привести клетку к гибели при замораживании. Кроме того, кристаллы льда играют водоотнимающую роль, что приводит к значительной дегидратации клетки и возможной ее гибели от осмотического стресса. Кристаллизация льда затрудняется в присутствии криопротекторов. К криопротекторам относится гетерогенная группа соединений, которые действуют различными механизмами на повышение выживаемости клеток при замораживании. Наиболее известны такие криопротекторы, как ДМСО, различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении точки замерзания воды. Они способны связывать внутриклеточную воду, повышать вязкость раствора, защищая таким образом клетку от механического и осмотического стресса. Их можно разделить на две группы: проникающие (ДМСО) и непроникающие (поливинилпиролидон, декстрая, полиэтиленгликоль). Работа по криосохранению культуры клеток состоит из следующих этапов: подготовки культуры клеток; добавления криопротектора; замораживания; хранения в жидком азоте; оттаивания; удаления криопротектора; рекультивирования и регенерации растений В настоящее время известны два способа криосохранения: программное (медленное) и сверхбыстрое замораживание. При медленном постепенном замораживании температура в интервале от 0 до -40 °С снижается со скоростью 0,5—1 °С в минуту. При быстром замораживании объект в ампуле с криопротектором погружается сразу в жидкий азот. 87. Типы векторных систем для переноса генов Существует несколько типов векторных систем Вирусы (см 89). В качестве векторных систем могут также использоваться вирусы растений. Их нуклеиновые кислоты реплицируются и проявляют свои функциональные свойства (экспрессируют) в клетках растений-хозяев, где потенциал вирусов и воспринимающих клеток объединяется и реализуется в приумножении организованных частиц патогена. Существуют гибридные вектора, содержащие ДНК фага и плазмиды. К ним относятся, например, космиды и фазмиды. Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Фаговые частицы обеспечивают хорошее проникновение гибридной ДНК в клетку (путем инъекции), после чего происходит замыкание ДНК в кольцо по липким концам и репликация ее по плазмидному типу. Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды. Вироиды (см. 90) представляют собой однонитевые цепи ковалентно связанных кольцевых РНК, включающих 270—300 нуклеотидов, лишенных оболочки. Вироиды поражают виноград, картофель, и другие растения как по вертикали (через зародышевые клетки), так и по горизонтали (распространяются по растительному организму через клеточный сок или переносятся механически). Вироиды заражают персиситентно (не происходит выздоровления). Вызывают системную инфекцию, т.е. мигрируют из сайта внедрения в другие части растений, переносятся механически или через клеточный сок, через семена, пыльцу. Вироиды также связаны с ядерными фракциями растений и могут размножаться в ядрах. Плазмиды агробактерий (см. 88) В качестве векторов могут использоваться опухолеобразующие плазмиды бактерий. Виды Agrobacterium эволюционно родственны клубеньковым бактериям, относящимся к роду Rhizobium, и имеют много общих с ними черт. Взаимодействие видов Agrobacterium с растениями представляет особый интерес, так как при этом виде паразитизма один из партнеров специфически видоизменяет свойства хозяина, встраивая свои гены в его геном. Кроме того, это служит уникальным примером миграции ДНК прокариот в эукариотическую клетку. Хлоропласты и митохондрии содержат полноценную генетическую систему, то есть все компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации: ДНК, ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и белоксинтезирующий аппарат (рибосомы, т-РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы). |