Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
 Скачать 1.38 Mb.
|
|
71.Сомаклональная вариабельность растительных клеток и её использование в биотехнологии В ряде исследований установлено, что сомаклональная изменчивость растений проявляется по различным качественным и количественным признакам (биохимическим, физиологическим, морфологическим и др.) Многие сомаклональные варианты, превосходящие исходные сорта по хозяйственно-ценным признакам (урожайность, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, качество и др.), представляют большой интерес для селекционеров. Генетический анализ мутаций в соматических клетках показал, что мутации могут быть рецессивными, доминантными, кодоминантными. Мутанты могут быть гомо-или гетерозиготными. Мутации могут касаться как моно-, так и полигенных признаков и иметь место в различных хромосомах. Частота мутаций может быть достаточно высокой (например, у томата она может составлять около одного мутанта на каждые 20-25 растений-регенерантов). В.А. Сидоров (1990) изучал сомаклональную изменчивость среди протоклонов картофеля, полученных от сорта Зарево. Было получено 320 растений, изученных в полевых условиях. Лишь 20 % протоклонов оказались идентичны исходной форме. Около половины растений регенерантов оказались тетраплоидными, в то время как остальные – анеу- и миксоплоидными формами. Спектр изменчивости среди растений - регенерантов был намного шире при обработке протопластов мутагеном. Ряд форм превышал исходный сорт по урожаю клубней, их количеству и массе, а также содержанию сухого вещества, крахмала и сырого протеина. Методами клеточной селекции получены линии кукурузы, устойчивые к гельминтоспориозу; картофеля – к альтернариозу, фитофторозу, парше, с более высокой урожайностью, повышенным содержанием протеина и крахмала; линии люцерны с повышенным содержанием метионина; линии люцерны, табака, картофеля, пшеницы, риса, устойчивые к повышенному содержанию в почве солей; формы томата, устойчивые к фитофторозу. Необходимо применить сомаклональную изменчивость для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам. Причинами проявления сомаклональной изменчивости могут быть : 1. Наличие генетической изменчивости в соматической ткани, используемой в качестве экспланта для введения в культуру in vitro; 2. Переход растительных клеток в виде каллуса , суспензии или протопластов в недифференцированное состояние; 3. Длительное выращивание в культуре in vitro; 4. Использование специфических компонентов среды или фитогормонов. Сомаклональная изменчивость может проявляться в следующих формах: 1. Цитогенетическая изменчивость ( полиплоидия, анеуплодия, транслокации, делеции, инверсии, дупликации); 2.Генетическая изменчивость , связанная с мутациями генов ядра и цитоплазмы, транспозонами, амплификацией и редукцией генов, активацией ранее репрессированных генов, соматическим кроссинговером; 3. Негенетическая изменчивость ( элиминация вируса , эпигенетические изменения). На проявление сомаклональной изменчивости сильно влияют генотип, орган растения, используемый в качестве экспланта, условия культивирования и регенерации растений. 72.Тотипотентность растительной клетки Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипотентности. Тотипотентность (лат. Totus - весь, potentia - сила) - это свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма. У растений в природных условиях (in vivo) тотипотентность могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому - вегетативное размножение, в том числе наблюдаемое в результате развития растений из клеток листьев бегонии, узумбарской фиалки или каланхое. Тотипотентность у растений реализуется и при заживлении ран. В этом случае на раневой поверхности растений в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса (лат. callus - толстая кожа, мозоль). Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и органов. Однако в природных условиях растения ряда систематических групп тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению. Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипотентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот переход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующему делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к повторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фитогормонов. 73. Стволовые клетки растений. Стволовые клетки – это незрелые (окончательно не сформированные) клетки организма, предназначенные для образования и замены зрелых клеток тканей и органов. Стволовые клетки растений также называют камбиальными. Местонахождение - меристематические ткани (в зародыше семени, в проростке растения, в кончике корня) Результатом деятельности стволовых клеток является рост и формирование органов. Регуляторы – фитогормоны, некоторые ионы, электропотенциалы, свет и гены. Стволовые клетки растений действуют в течение всей жизни, полностью сохраняют тотипотентность. Получение стволовых клеток растений: 1 способ - Биотехнологический - в «биореакторах» 2 способ - Природный – из почек, проростков, молодых корешков и побегов Мутагенез и клеточная селекция растений в культуре in vitro Клеточная селекция in vitro. Одна из наиболее сильных сторон культуры клеток растений в создании технологий для сельского хозяйства – это возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций осуществлять клеточную селекцию in vitro. В настоящее время наиболее активно развиваются такие направления проведения клеточной селекции как отбор клеток устойчивых к гербицидам, засолению, экстремальным температурам, патогенам, клеток, характеризующихся повышенным синтезом незаменимых аминокислот и др. Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объектов исследования используются каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. В качестве исходного материала для селекции могут выступать культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, а также культура изолированных зародышей. Однако удобнее использовать клеточные сусупензи или изолированные протопласты. Преимущество этих объектов состоит в быстром росте культуры и равномерном действии селективного фактора на все клетки. Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы: 1.Прямая (позитивная) селекция – наиболее простой способ отбора мутантов, поскольку резистентные клетки могут быть отобраны в большом количестве по их способности расти в присутствии ингибитора, в то время как чувствительные клетки гибнут. 2.Непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели неустойчивых делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений. 3.Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны. 4.Визуальная селекция и неселективный отбор – способы, при которых вариантная линия может быть идентифицирована визуально или с помощью биохимических методов. Прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется для выделения клеток, устойчивых к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам. Получение устойчивых линий – процесс длительный. Он включает многочисленные циклы выращивания и пересадки клеток на среды, содержащие селективный фактор.. Основная сложность, часто возникающая при работе с линиями клеток растений, отобранных по принципу устойчивости к ингибиторам роста – нестабильность этого признака, которая проявляется после того как снимается давление отбора. Чтобы проверить стабильность признака необходимо получить, по крайней мере, две культуры для каждой из отобранных линий, одна из которых 74пассируется в присутствии, а другая – в отсутствии селективного фактора. И только после повторного возвращения к селективным условиям отбирают стабильные клоны, из которых пытаются регенерировать растения. Получение растений– регенерантов, а также гибридологический анализ подтверждают генетическую природу признака, а не адаптационный его характер. Устойчивость клетки и растения к селективному фактору может совпадать и не совпадать. В частности, клеточная устойчивость может быть только частью общего механизма, работающего в целом растении, как это наблюдается при создании устойчивости к засолению Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для таких факторов как низкие температуры, гербициды, высокие концентрации алюминия. Гибридизация соматических клеток (межвидовая и межродовая) и её роль в селекционном процессе Соматическая гибридизация. Это метод получения гибридных растений в результате слияния протопластов, изолированных из соматических клеток родительских форм. Т.к. для слияния протопластов не существует барьеров, то на уровне протопластов могут быть объединены несовместимые при половом размножении виды растений. Принципиальное отличие соматических гибридов, полученных методом слияния протопластов, от гибридов, полученных половым путем, состоит в том, что при половом скрещивании цитоплазматические гены передаются в большинстве случаев только от материнского растения, а при соматической гибридизации – двуродительски. Т.е. слияние протопластов способствует объединению двух различных цитоплазм, и в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. При слиянии двух протопластов истинная гибридная клетка образуется, если сливаются ядра. Клетка, в которой слияние ядер не произошло, называется гетерокарионом. Гибрид, несущий гены ядра только одного родителя наряду с цитоплазматическими (внеядерными) генами от обоих либо одного из родителей, называется цитоплазматическим (цибридом). Значение соматической гибридизации заключается в том, что она позволяет обойти проблему половой несовместимости у растений, облегчает перенос между разными видами внеядерных генетических элементов (митохондриальных и хлоропластных ДНК), а также обеспечивает возможность получения необычных сочетаний ядерных и цитоплазматических генов. Соматическая гибридизация включает 4 этапа: 1) выделение протопластов; 2) их слияние; 3) отбор и регенерацию гибридов; 4) анализ растений–регенерантов. Изолированные протопласты за то короткое время, за которое они не образовали клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние может быть спонтанным (особенно в случае использования протопластов, изолированных из молодых тканей или суспензионных культур). Эффективность слияния повышается под действием различных индукторов. Для индукции слияния протопластов используют химический и электрический методы. Химический метод заключается в добавлении к суспензии протопластов веществ, стимулирующих слияние. Химическим индуктором слияния протопластов также является поливиниловый спирт. Преимущества - простота исполнения. При этом могут сливаться протопласты, различающиеся по форме и размерам. Недостатки - в результате обработки индукторами часть протопластов повреждается и погибает. Кроме того, зачастую сливаются не два, а большее количество протопластов, образуя нежизнеспособные гибриды. Метод электрослияния протопластов - в специальную камеру, в которой создается неоднородное электрическое поле, помещают протопласты. В камеру вводят электроды и в этих условиях протопласты выстраиваются в цепочку между ними. Преимущества – высокая эффективность, быстрота, возможность регуляции процесса слияния. Но требует дорогостоящего оборудования. При использовании химических индукторов и обычного варианта метода электрослияния протопластов возможна агрегация и слияние протопластов как разных видов, так и одного и того же вида, т.е. происходит образование как гетерокарионов, так и гомокарионов. В связи с этим важным этапом получения соматических гибридов является отбор продуктов гетероплазматического слияния от протопластов родительских форм, а также продуктов слияния протопластов одного и того же вида. Цибриды и явление цитоплазматической мужской стерильности Помимо соматической гибридизации существует еще один близкий по своей сути способ получения растений с новыми полезными признаками – это цибридизация. Цибридизация представляет собой способ введения важных цитоплазматических генов. При этом цибридные растения содержат цитоплазму обоих партнеров, ядро – одного. Разработаны следующие способы получения цибридов: слияние изолированного протопласта с цитопластом; слияние протопласта реципиента с протопластом, ядро которого инактивировано облучением и не способно к делению; микроинъекция; перенос с помощью липосом. Благодаря цибридизации был осуществлен перенос генов, несущих признаки устойчивости к гербицидам, а также цитоплазматической мужской стерильности. Цитоплазматическая мужская стерильность — явление полной или частичной стерильности андроцея высших растений, причиной которого является наличие особой мутации в митохондрионе, т.е. в геноме митохондрий. Генетическая трансформация растений Центральным компонентом генно-инженерной технологии является набор приемов для переноса генов из одной биологической системы в другую. Уже созданы универсальные системы, позволяющие клонировать гены микроорганизмов, животных и растений, встраивать их в способную к переносу конструкцию и эффективно вводить ее в клетки растений. К наиболее важным проблемам, для решения которых осуществляется генетическая трансформация растений, относятся повышение устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам, улучшение качеств запасных белков зерна, повышение эффективности азотфиксации и расширение круга культурных растений, способных к симбиотической фиксации азота, а также создание сверхпродуцентов биологически активных веществ. Процесс трансформации начинается с выбора интересующего исследователя гена. Выбранный ген ставится под контроль регуляторного участка ДНК – промотора. В качестве промотора чаще всего используется регуляторный участок гена 35S белка из генома вируса мозаики цветной капусты. Большой интерес представляют так называемые индуцибельные промоторы, которые актививруют транскрипцию введенных генов в ответ на действие специфического индуктора (свет, повышенная температура, действие патогена). Для удобства контроля за процессом трансформации в переносимую конструкцию обычно включают маркерные гены, по экспрессии которых можно судить о том, произошло встраивание чужеродного гена в геном реципиента или нет. Маркерными часто являются гены устойчивости к различным антибиотикам или гербицидам. В этом случае трансгенные организмы отбирают на селективных средах, содержащих эти вещества в летальных концентрациях. Используют также репортерные гены, экспрессия которых не дает клетке селективных преимуществ, но приводит к изменению фенотипа трансгенного растения. В настоящее время широко используемым репортерным геном является ген β– глюкуронидазы (GUS). 78.Основные направления в создании трансгенных растений Получение трансгенных растений является на данный момент одной из перспективных и наиболее развивающихся направлений агропроизводства. Существуют проблемы, которые не могут быть решены такими традиционными направлениями как селекция (подробнее см. раздел "Селекция"), кроме того, что на подобные разработки требуются годы, а иногда и десятилетия. Создание трансгенных растений, обладающих нужными свойствами, требует гораздо меньшего времени и позволяет, как говорится, "творить чудеса". Например, при создании сортов, устойчивых к засухе, были получены трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона. В России получены трансгенные сорта картофеля, клевера, томатов и других важнейших сельскохозяйственных культур. Создание трансгенных растений в настоящее время развиваются по следующим направлениям: Получение сортов с/х культур с более высокой урожайностью. Получение с/х культур, дающих несколько урожаев в год (например, в России существуют ремантантные сорта клубники, дающие два урожая за лето). Создание сортов с/х культур, токсичных для некоторых видов вредителей (например, в России ведутся разработки, направленные на получение сортов картофеля, листья которого являются особо токсичными для колорадского жука и его личинок). Создание сортов с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (например, были получены устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона). Создание сортов растений, способных синтезировать некоторые белки животного происхождения (например, в Китае получен сорт табака синтезирующий лактоферрин человека). Создание новых форм сортов, облегчающих их дальнейшую переработку (например, недавно в интернете, появилось сообщение о работах, финансируемых производителями соков, направленных на создание специального вида апельсинов без кожуры, косточек и внутренних пленок - одним словом большая "капля сока" в тонкой оболочке). Таким образом, создание трансгенных растений позволяет решить целый комплекс проблем, как агротехнических и продовольственных, так и технологических, фармакологических и т.д. |