Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений

• Название: 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
• Анкор: Шпоры культура клеток органов и тканей
• Дата: 19.09.2020
• Размер: 1.38 Mb.
• Имя файла: ККОИТ.docx
• Тип: Документы; #138687
• страница: 9 из 14

53.Использование иммобилизованных растительных клеток в биотехнологическом производстве

Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории:

1.Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате. Например, клетки Catharanthus roseus, Digitalis lanata в альгинатных, агарозных шариках, в желатине и т.д. Метод предполагает обволакивание клеток одной из различных цементирующих сред – альгинат, агар, коллаген, полиакриламид.

2.Адсорбция клеток на инертном субстрате. Клетки прилипают к заряженным шарикам из альгината, полистирола, полиакриламида. Метод применялся в экспериментах с животными клетками, а также клетками Saccharomyces uvarum, S. cerevisiae, Candida tropicalis, E. coli.

3.Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения об экспериментах с различными линиями клеток человека, эритроцитами крови барана, адсорбированными на покрытой белком агарозе.

4.Ковалентное связывание с другим инертным носителем типа КМЦ. Очень редко применяется, известна удачная иммобилизация для Micrococcus luteus.

В последнее время интерес к иммобилизации клеток растений значительно возрос, это связано с тем, что иммобилизованные клетки имеют определенные преимущества перед каллусными и суспензионными культурами при использовании их для получения вторичных метаболитов.

Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ:

1. Клетки, иммобилизованные в или на инертном субстрате, образуют биомассу гораздо медленнее, чем растущие в жидких суспензионных культурах.

2. Кроме медленного роста иммобилизация клеток позволяет им расти в тесном физическом контакте друг другом, что благоприятно отражается и на химических контактах.

3. Регулировать выход вторичных метаболитов можно также, изменяя химический состав окружающей среды.

Изменение состава среды для каллусной и суспензионной культуры сопровождается определенными физическим манипуляциями с клетками, что может привести к повреждению или загрязнению культур. Эти трудности можно преодолеть, используя циркуляцию больших объемов питательной среды вокруг физически неподвижных клеток, что позволяет осуществлять последовательные химические воздействия.

4. В некоторых случаях возникают проблемы с выделением идиолитов.

При использовании иммобилизованных клеток относительно легко осуществляется обработка их химическим веществами, индуцирующими высвобождение требуемых продуктов. Это также снижает ингибирование по типу обратной связи, которое ограничивает синтез веществ вследствие накопления их внутри клетки. Культивируемые клетки некоторых растений, например, Capsicum frutescens выделяют вторичные метаболиты в окружающую среду, а система иммобилизованных клеток позволяет отбирать продукты без повреждения культур. Таким образом, иммобилизация клеток способствует легкой изоляции идиолитов.


54.Клональное микроразмножение растений: общие принципы и основные этапы

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2^оС, +10^оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/лНа первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов. 

Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием  цитокининов (5—10  мг/л)  происходит  постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последую­щая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивиро­вание на агаризованной среде без гормонов или непосредствен­но в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответ­ственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).
55. Клональное микроразмножение плодово-ягодных растений

Клональное микроразмножение – это использование техники in vitro для быстрого получения неполовым путем растений, идентичных исходному.

Наибольшее распространение для микроразмножения плодовых и ягодных культур получил метод пролиферации придаточных побегов. Для снятия эффекта апикального доминирования в этом случае исполь­зуются цитокинины. Процесс происходит по описанной ранее схеме и имеет некоторые особенности, связанные со спецификой культур.

На этапах 0 и 1 важными являются предподготовка растения, пра­вильный выбор сроков взятия эксплантов (период выхода из состояния п о коя иктивной вегетации). На этих этапах проводится оздоровление посадочного материала, для чего применяют метод апикальных мерис­тем в сочетании с термотерапией. Для термотерапии плодовых культур используют однолетние саженцы, которые культивируют в термокамерах при температуре 38 ± 1 °С, относительной влажности 70-80%, освещен­ности 5-6 тысяч люкс, длине дня 16 часов в течение 5-11 недель. После термотерапии срезают верхушки побегов, промывают водой 2 часа, сте­рилизуют в 0,1 %-ном растворе сулемы 6-12 минут, промывают стериль­ной дистиллированной водой и вычленяют под микроскопом в лами- нар-боксах апикальные меристемы размером до 0,5 мм. Меристемы культивируют на модифицированных средах Мурасиге, Скуга. Для ини­циации роста побегов из меристем используют цитокинины (чаще всего 6-БАП в концентрации 0,1-1мг/л). Физические условия культивирования – температура 22-26, освещённость-2,5-5 тыс. люкс, влажность-70-75%.

На этапе 2 задача-размножение побегов. Для увеличения эффекта размножения побеги пересаживают на среду, содержащую 1-3 мг/л 6-БАП. Под воздействием повышенных концентраций цитокининов активизируется пробуждение почек в пазухах листьев, закладка и проростание дополнительных почек.

На этапе 3 побеги укореняют, для чего концентрацию среды Мурасиге, Скуга уменьшают наполовину, содержание сахарозы - _до 20 г/л Для индукции ризогенеза используют индол ил масляную кислоту в кон­центрации 0,5-1 мг/л. Длительность корнеобразования может составлять

3-6 недель.

На этапе 4 проводится адаптация микрорастений в нестерильных ус­ловиях. Пробирочные растения после укоренения высаживают в сте­рильный субстрат, состоящий из смеси торфа, песка, перлита и почвы, который стерилизуют при температуре 85-90°С в течение двух часов. Субстрат насыпают в горшочки или ящики, которые устанавливают в теплице. Для адаптации растения в теплице укрывают пленкой в течение 10-14 дней для поддержания высокой влажности. Через 5-8 дней после посадки растения подкармливают раствором Мурасиге, Скуга, разбав­ленным в 4-8 раз, или раствором Кнопа. После адаптации растения вы­саживают для создания маточника в теплицу или открытый грунт в нача­ле или середине вегетации.

56. Клональное микроразмножение древесных растений.

ОСИНА Питательные среды: Для выращивания регенерантов осины из первичного экспланта и получения каллусной культуры осины использовали питательную среду с минеральными солями по прописи Мурасига и Скуга с добавлением витаминов, сахарозы и фитогормонов в различных концентрациях и соотношениях. При получении регенерантов осины из первичного экспланта в качестве ауксинов изучали действие НУК (0,02 мг/л) и ИМК (для укоренения микропобегов) (2 мг/л), а в качестве цитокининов – БАП (0.5; 0,1 мг/л). Для получения каллусной культуры осины в качестве ауксинов использовали 2,4-Д (2,5 мг/л) и НУК (,5 мг/л), а в качестве цитокининов-цитодеф(2,0 мг/л) и БАП (0,5 мг/л). Для регенерации растений из каллусной ткани использовали питательную среду WPM, содержащую ауксин Индолилуксусную кислоту (0,5 мг/л) и цитокины – 2ip (20мг/л) и БАП (2мг/л).

Клональное микроразмножение осины. Основной метод-активация развития уже существующих в растении меристем. В качестве первичного экспланта были использованы вегетативные почки с молодых побегов. Почки вводили в культуру in vitro. Готовый растительный материал с помощью длинного пинцета помещали на питательную среду. Колбы ставили в световую комнату. Образовавшиеся в колбах конгламерат побегов делили, удаляли скальпелем листочки и черенковали на сегменты стебля с одной или двумя пазушными почками. После чего его переносили на свежую питательную среду. После 3-х пассажей микропобеги укореняли in vitro. Регенеранты выращивали в световой комнате в течение 30 суток при 23С, 24 часовом фотопериоде и интенсивности освещения 1250 люкс.

57. Клональное размножение декоративных растений.

Клональное микроразмножение декоративных растений широко рас­пространено в Западной Европе и США. Имеется большой опыт микро­размножения и получения безвирусного посадочного материала гвоздики, хризантемы, антуриума, розы, бегонии в ряде научных и производствен­ных учреждений СНГ (Институт физиологии растений РАН, Центральный ботанический сад НАН Беларуси, цветоводческое хозяйство «Элита» (Россия) и др.). Разнообразие декоративных растений очень велико, в связи с этим приведены схемы клонального микроразмножения на при­мере хризантем и лилий.


РАСТЕНИЙ . 235
Сотрудниками Никитского ботанического сада совместно со специа­листами совхоза «Оранжерейный комплекс» разработана технология по­лучения безвирусного посадочного материала хризантем для закрытого грунта. Технологичекий процесс получения безвирусного посадочного материала начинается с термотерапии. Сортовые черенки берут с маточ­ных растений, предварительно тестированных на вирусы, высаживают в контейнеры, После 2- 3 прищипок растении помещают в термокамеру. Адаптацию к повышенной температуре начинают с 25 С и доводят до 37°С, Термотерапия продолжается 4- 10 недель а зависимости от состава выявленных вирусов при освещенности 3500—1000 люкс п фотопериоде 14,5 часа. У растений, прошедших термотерапию, берут черенки длиной 5 -7 см и дезинфицируют их в 1%-растворе гипохлорита натрия в течение 5 минут с последующим пятикратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Вычленяют апикальные и латеральные ме­ристемы размером 0.3- 0,4 мм в ламинар-боксах и помещают на жидкую питательную среду. Пробирки с эксплантами культивируют при темпера­туре 22-23, освещенности 2500 -3000 люксе в течение 16 часов. Обра­зовавшиеся каллус через 2 -3 недели в асептических условиях пасси­руют на аудированную питательную среду, где в течение 3 недель происходит регенерация проростков, которые пересаживают на среду для укоренения. После укоренения растения высаживают в контейнеры с субстратом (2 части торфа и 1 часть перлита), поливают раствором Кнопа и накрывают полиэтиленовыми изоляторами на 7-10 дней. После фор­мирования 5- 6 листьев растения тестируют на вирусы. Бсзвнрусные рас­тения используют для закладки маточника.

На этапах 0-1 для введения в культуру in vitro используют в качестве эксплантов луковичные чешуи. Стерилизацию проводят в 3-5%-ном растворе гипохлорита кальция. Чешуя, за исключением апикальной части, разрезается на экспланты размером око­ло 1,5 см^2. Экспланты ориентируются внутренней поверхностью чешуи вверх, поскольку регенерация луковичек у лилий идет только с внутрен­ней стороны. Экспланты культивируют на среде Мурасиге, Скуга с по­вышенной концентрацией сахарозы (60г/л) и добавлением НУК (0,1- 1мг/л) Культивирование эксплантов осуществляется при температуре 24-27, освещенности 1000 люкс, фотопериоде 16 часов в течение 6-8 недель. На этапе 2 образовавшиеся луковички разделяются на чешуи, которые высаживают на среду Мурасиге, Скуга с добавлением 60 г/л сахарозы и 0,5 мг/л НУКэ. Продолжительность пассажа составляет 8 недель. коэффициент размножения 2 -5. Особенностью предлагаемой технологии является то, что она не требует специальной стадии укоренения на этане 3. На среде с НУК растении оборазуют хорошо развитые корни. Для переноса в условии In vivo растения отмываются от агара и высаживаются в субстрат с верховым торфом или его смесью с песком и перлитом. Ящики с субстратом накрывают полиэтиленовой плёнкой и ежедневно увлажняют. Освещённость 2-3- тыс. люкс, температура- 22-26.


58. Растительные экспланты и регенеранты.

Эксплант- любой кусочек растения, который может быть помещён в культуру in vitro (лист, корешок). Используется в биологических исследованиях, связанных с микроклональным размножением растений. У двудольных растений, эксплантами могут являться, например, части гипокотилей, стеблей, корней, семядоли, пыльники и прочее. При культивировании эксплантов на питательных средах различного состава, можно наблюдать каллусогенез или органогенез(образование корней, побегов и пр.)

Регенерант- то, что стабильно размножается в культуре in vitro. А следовательно, можно черенковать и высаживать.

59. Асептическое введение и стабилизация растений в культуре in vitro

Растительные ткани сами по себе могут служить источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Для поверхностной стерилизации растительных тканей применяют большой набор химических веществ. Растительные экспланты стерилизуют растворами соединений, содержащих активный хлор (хлорамином, гипохлоритом кальция и натрия, сулемой), бром (бромной водой), диацидом, перекисью водорода, спиртом, антибиотиками. Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиком. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений с крупными сосудами. Антибиотики также используются для подавления роста микроорганизмов в суспензионных культурах, стерилизации нежных тканей и корончатогалловых опухолей. Поскольку антибиотики являются термолабильными веществами, их стерилизуют только методами фильтрования и добавляют в охлажденную среду. При использовании антибиотиков руководствуются тем правилом, что применяют либо несколько антибиотиков, действующих на разные микроорганизмы, либо один, но с широким спектром микробного действия.

Прежде чем приступить к стерилизации ткани, ее предварительно моют в мыльном растворе и ополаскивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70 %-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1–2 мин. Обработка тканей этанолом перед помещением их в стерилизующий раствор, кроме собственного стерилизующего действия спирта, повышает действие стерилизующих веществ. Добавление незначительного количества поверхностно- активного вещества в стерилизующий раствор (особенно в случае плохо смачиваемых опушенных или покрытых воском тканей) также заметно повышает его эффективность и сокращает время стерилизации. Очищенный и промытый в дистиллированной воде растительный материал помещают в стерилизующий раствор и отмечают время начала стерилизации. По истечении времени стерилизации растительный материал промывают тремя порциями стерильной воды, выдерживая по 10–15 мин в каждой.

Если в результате неудовлетворительной стерилизации культура тканей загрязнена быстрорастущими микроорганизмами, то такое заражение легко обнаруживается уже на 2–3 сутки после посадки. Инфицирование культур, растущих на агаризованной среде, легче выявляется, если культуральный сосуд просматривать на свет. Заражение растительной ткани проявляется в виде ореола из бактериальных микроорганизмов вокруг ткани на поверхности агара или помутнения агара непосредственно под тканью. Если инфицирована питательная среда, то колонии микроорганизмов или грибов распределяются в толще агарового слоя. Зараженная суспензионная культура мутнеет, приобретая цвет разбавленного молока. В худшем случае ткань может быть загрязнена медленно растущими микроорганизмами или спорами. При этом заражение не проявляется в первые дни после посадки эксплантов, а обнаруживается только при последующем размножении ткани или субкультивировании ее на свежую питательную среду.