Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
 Скачать 1.38 Mb.
|
|
18. Салициловая и жасминовая кислоты как регуляторы роста и развития растений САЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА (СК) относится к фитогормонам, к-ые обеспечивают растению уст-ть к повр-ию разл. патогенами. Синтез СК играет ключевую роль в р-ии сверхчувствит-ти, а также в пролонгированной системной уст-ти растений к широкому кругу инфекций. Синтез СК в растениях начинается с превращения фенилаланина в транс-коричную кислоту. Этот процесс катализ-ет один из осн. ферментов фенольного обмена фенилаланинаммонийлиаза (ФАЛ). Далее коричная кислота путем декарбоксилир-ия превращается в бензойную, к-ая после гидроксилир-ия дает салициловую кислоту: Фенилаланин → Транс-коричная кислота → Бензойная кислота → Саллициловая кислота ↔ β-D-Глюкозилсаллициловаякислота Фермент, к-ый осущ-ет этот процесс, 2-гидроксилаза бензойной кислоты представляет собой цитохром-Р450-монооксигеназу, использующую молекулярный кислород для гидроксилирования бензойной кислоты. СК может образ-ть метиловый эфир и (или) связываться с глюкозой под действием глюкозилтрансферазы. Однако, если β-D-глюкозилсалицилат — неактивное соед-ие, то метилсалицилат является мобильным летучим предш-ком, к-ый легко превращается в тканях-мишенях в СК. Ключевая роль в формир-ии системного приобретенного иммунитета растений принадлежит СК. Именно образование салицилата предшествует системной иммунизации растения. Экзогенная обработка СК и ее аналогами вызывает формир-ие системной уст-ти растения, а мутантные растения, не накапливающие салицилата, не способны к иммунизации. Заражение растений несовместимым патогеном индуцирует накопление салициловой кислоты как в инфицированных, так и в неинфицированных тканях. Избыток салицилата, образовавшийся при заражении, переводится в форму конъюгатов с глюкозой, к-ые при вторичном поражении гидролизуются до свободной салициловой кислоты. При повышении конц-ии СК индуцируется локальный син-тез ряда в-в (фитоалексинов, нек-ых фенольных соединений), к-ые подавляют развитие патогена, и стимулируются процессы, способствующие укреплению клеточных стенок. ЖАСМОНОВАЯ КИСЛОТА (ЖК) и ее метиловый эфир могут контролир-ть созревание плодов и рост корня, изгиб усиков и произв-во жизнеспособной пыльцы, уст-ть растений к насекомым и патогенам. ЖК синтезир-ся из линоленовой кислоты; большинство ферментов, приним-их участие в ее синтезе, выявлено и интенсивно изучается. Содержание ЖК в тканях растений возрастает при таких механ. раздражениях, как изменение тургорного давления при водном дефиците, движения усиков, взаимодействие корневых волосков с частицами почвы. Синтез ЖК активируется элиситорами и системином. Полагают, что пептид системин, к-ый образуется в поврежд-ых тканях в рез-те гидролиза некоего полипептида-предшественника, транспортируется по флоэме к клеткам-мишеням, связывается с локализованным в плазмалемме рецептором и активирует экспрессию жасмонатзависимых генов. Активация синтеза ЖК в ответ на ряд механ. стимулов происходит с участием Са-кальмодулинового пути сигнальной трансдукции. Конц-ия ЖК наиболее высока в зонах клеточного деления, молодых почках, цветках, тканях околоплодника, а также в гипокотильном крючке бобовых растений. Жасмонат подавляет экспрессию ряда ядерных и хлоропластных генов, продукты к-ых необходимы для фотосинтеза, что приводит к снижению содержания хлорофилла и хлорозу. Наиболее важной функцией ЖК является ее участие в ответных р-иях при поврежд-ии растений насекомыми и патогенами. Поврежд-ые ткани отличаются очень высокой конц-ией этого фитогормона, что резко повышает уст-ть растений к вредителям. Повышение содержания жасмоната активирует экспрессию целого каскада генов, к-ые кодируют: 1) белки, формирующие механ. барьеры в клет. стенке на пути инфекции; 2) ферменты, участв-ие в синтезе фитоалексинов; 3) ингибиторы протеаз, обеспеч-ие защиту растений от поврежд-ия насекомыми; 4) белки, облад-ие фунгицидной активностью, — тионин, осмотин и др. Механизм проведения сигнала, индуцируемого в растит. клетках ЖК, изучен слабо. Известно, что жасмонат взаимод-ет с неким рецептором, после чего активируется сигнальный путь, приводящий к изменению процессов транскрипции, трансляции и др. процессов, контролируемых ЖК. В промоторной зоне жасмонат-индуцибельных генов выделена специф. нуклеотидная последов-ть (CACGTG-бокс), с к-ой связываются транскрипционные факторы bZIP-типа. Конц-ия жасмоновой кислоты в растит. тканях резко возрастает при механ. повр-ии / при возд-ии элиситоров. Синтез жасмонатов запускается при поранении растения, н-р, в процессе поедания фитофагами. Жасмоновая кислота активирует экспрессию ряда генов, пр-ты к-ых вырабатываются в ответ на такие стрессовые возд-ия, как механ. повр-ие тканей и заражение патогенами. К их числу относятся, н-р, тионины, экстенсины, ферменты, участв-ие в синтезе ряда фенольных соед-ий и фитоалексинов. Поэтому обработка растений жасмоновой кислотой резко повышает их уст-ть к повр-иям. Жасмоновая кислота так же, как и салицилат, — один из факторов индукции иммунитета растений к повторным заражениям. 19. Метаболизм и взаимодействие фитогормонов в онтогенезе растений. Фитогормоны — низкомолекулярные органические вещества, вырабатываемые растениями и имеющие регуляторные функции. Действующими являются низкие концентрации фитогормонов, при этом фитогормоны вызывают различные физиологические и морфологические изменения в частях растений. Многие фитогормоны и другие регуляторы роста растений представляют собой слабые кислоты. Ауксинами богаче всего верхушечные меристемы стебля, гиббереллинами — листья, цитокининами — корни и созревающие семена. Фитогормоны обладают широким спектром действия. Фитогормоны регулируют многие процессы жизнедеятельности растений: прорастание семян, рост, дифференциацию тканей и органов, цветение, созревание плодов. Среди растительных гормонов выделяют 5 основных групп: *Абсцизины *Ауксины *Цитокинины *Этилен *Гиббереллины Три основных класса гормонов, стимулирующих рост, — ауксины, гиббереллины и цитокинины. Кроме того, в растениях содержатся и другие типы гормонов, в частности «ингибиторы роста», такие, как абсцизовая кислота (АБК), а также газообразный гормон этилен, Взаимодействие фитогормонов: Рост растений и формообразовательные процессы регулируются определенным соотношением фитогормонов. При этом появление каждого органа, направление и темпы роста будут зависеть именно от определенного соотношения фитогормонов. Например, значение соотношений между ауксином и цитокинином хорошо показано в опытах с выращиванием изолированных тканей. Увеличение в питательной среде отношения ауксин/кинетин приводит к тому, что из массы недифференцированных клеток (каллуса), выращиваемых в стерильных условиях, дифференцируется корень. Уменьшение указанного соотношения приводит к дифференциации побегов. На разных этапах онтогенеза под влиянием различных условий внешней среды соотношение фитогормонов меняется, и именно это изменяет скорость и направление роста и морфогенеза растительных организмов. Одни гормоны могут оказывать влияние на ферменты, катализирующие синтез или разрушение других гормонов, и тем самым изменять их содержание. Так, известно, что под влиянием гиббереллинов содержание ауксинов растет. Как уже упоминалось, ауксин может вызывать накопление этилена. Это проявляется при росте корня. Ауксин активирует его рост. Однако высокие концентрации ауксина индуцируют синтез этилена, который рост корня подавляет. Следовательно, этилен контролирует действие ауксина по принципу обратной связи. Индолилуксусная кислота (ауксин) является производным индола, синтезируется из триптофана в верхушке побега и передвигается вдоль стебля сверху вниз. Цитокинины являются производными аденина, синтезируются главным образом в кончиках корней и перемещаются оттуда во все органы растений по транспортным каналам. Гиббереллины представляют собой обширную группу близких по строению тетрациклических карбоновых 19кислот, относящихся к терпенам. Они синтезируются во многих органах, особенно в интенсивно растущих: молодых листьях, прицветниках, частях цветков, формирующихся и прорастающих семенах и др. Свет стимулирует образование гиббереллинов. Абсцизовая кислота образуется главным образом в листьях, а также в корневом чехлике двумя путями: либо синтезом из мевалоновой кислоты, либо за счет распада каротиноидов. Перемещение гиббереллинов и абсцизовой кислоты на короткие расстояния происходит путем диффузии, на дальние-по транспортным каналам. Этилен синтезируется из метионина. Этилен образуется во всех органах и тканях, но наиболее активно в зонах меристем, стареющих листьях и созревающих плодах, а также при стрессовых воздействиях или травмах. Физиол.действие: Фитогормоны контролируют все этапы онтогенеза растений. Деление и растяжение клеток, лежащие в основе всех процессов роста и морфогенеза, находятся у растений под контролем ауксинов и цитокининов, поэтому полное отсутствие этих фитогормонов для растений летально. Ауксины верхушки побега подавляют рост боковых почек (апикальное доминирование), тогда как цитокинины это доминирование преодолевают, вызывая ветвление. Гиббереллины усиливают рост растения, активируя апикальные и интеркалярные (вставочные) меристемы. Ауксины способствуют образованию корней и определяют адаптивные изгибы растения в соответствии с направлением света или вектора силы тяжести (фото- и геотропизм). Формирование аппарата фотосинтеза и транспирация растений регулируются гормонами-антагонистами - цитокининами и абсцизовой кислотой: цитокинины вызывают дифференцировку хлоропластов и открывание устьиц, тогда как абсцизовая кислота подавляет оба эти процесса. Последовательное участие фитогормонов необходимо для нормального формирования плодов и семян. Завязывание и рост плодов стимулируются ауксинами, гиббереллинами и цитокининами, выделяемыми семяпочками или семенами. Созревание и опадение плодов, а также листьев вызываются этиленом и абсцизовой кислотой. Стрессовые воздействия на растения вызывают всплеск количества этилена, а водный дефицит - абсцизовой кислоты. Цитокинины, гиббереллины и, в ряде случаев, этилен способствуют прорастанию семян многих растений и повышают их всхожесть. 20.Факторы, влияющие на физиологическое состояние изолированных клеток и тканей растений. Сущность метода изол.кл. и тк. заключается в том, что выделенные кусочки ткани или отдельные клетки выращивают на искусственной питательной среде в стерильных условиях. Если полностью дифференцированную клетку изолировать, то в стерильных условиях на соответствующей питательной среде она снова начинает делиться, и затем из нее может развиться целый растительный организм. Факторы: * Асептика. Прежде всего, культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток требует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирующие рост клеток и приводящие культуру к гибели, поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики. * Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной смеси в концентрации 2—3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза. *Физические факторы. На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы — свет, температура, аэрация, влажность. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60—70%. Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от многих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо известно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических факторов на рост и физиологические характеристики этой культуры. 21. Получение in vitro каллусных культур у растений. Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными тканями - каллусами. Паренхимные клетки дифференцируются, переходят к делению и образуют недифференцированную ткань, получившая название каллус. Классическая каллусная культура, выращиваемая поверхностным способом, (первичный каллус) представляет собой аморфную, рыхлую массу сильно оводненных дедифференцированных клеток, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. Такая рыхлая каллусная ткань легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и поэтому может быть использована для получения суспензионной культуры. Под влиянием фитогормонов клетки первичного каллуса могут претерпевать процессы вторичной (обратно) дифференцировки и органогенеза, что существенно сказывается на внешнем виде и консистенции (плотности) каллуса. В естественных условиях каллусная ткань может возникнуть у растений в результате механических повреждений. Она функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса. Методика искусственного получения каллусной культуры: для того чтобы получить культуру ткани, из любой части растения (стебель, лист, элемента цветка, корень и т.д.), вычленяют эксплантат (кусочек ткани размером 0,5 - 1,0 см), стерилизуют его и помещают на питательную среду определенного состава. Важнейшую роль в индуцировании каллусообразования на эксплантатах является наличие в питательных средах специфических фитогормонов – ауксинов и цитокининов. Функции этих двух групп фитогормонов в каллусогенезе различны, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки и последующей вторичной дифференцировки клеток и подготавливают их к делению, а цитокинины инициируют деление. Различные типы фитогормонов, и, прежде всего их соотношение в среде культивирования, играют определяющую роль и во вторичной дифференцировке каллусных клеток. Через несколько дней на изолированном кусочке ткани растения образуется первичный каллус. Периодически в асептических условиях его отделяют и переносят на свежую питательную среду для дальнейшего роста. Такую ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически расчленяя ее и пересаживая на свежую питательную среду. Рост пересаженных тканей происходит в контролируемых условиях при температуре 24-28°С. Формирование каллуса длится обычно 1-2 месяца. Периодичность субкультивирования тканей зависит от скорости роста биомассы. Внешне такая ткань совершенно не похожа на растение, от которого она была получена, но ее клетки несут генетическую информацию, свойственную данному виду. Процессы, происходящие в культивируемых тканях, в принципе не отличаются от идущих в тканях целого растения. Сохранение способности к синтезу специфических вторичных метаболитов - алкалоидов, эфирных масел, карденолидов, стероидов и др. - определяет практическую ценность культур растительных тканей для создания технологий промышленного выращивания биомассы клеток в качестве принципиально нового вида лекарственного сырья. Кроме того каллусные клетки сохраняют свойство тотипотентности, что используется в технологии моноклонального размножения растений. 22. Молекулярно-физиологические основы процесса дедифференциации растительных клеток. Если определенным образом изменить условия, в которых находится специализированная клетка, то в большинстве случаев можно вызвать в ней ростовую активность, дедифференциацию клеток, неорганизованный рост, а при определенном дальнейшем изменении условий - и вторичную дифференциацию клеток, идущую различными путями. Вне организма почти каждая живая растительная клетка при создании соответствующих условий способна к делению и росту. Характерной особенностью процесса дедифференциации клеток и различных тканей из самых разнообразных органов является то, что в результате возобновления эмбриональной активности все они образуют массу каллусной ткани. Исходя из свойства тотипотентности растительной клетки предполагалось, что изменение условий культивирования может вызвать вторичную дифференциацию клеток в культуре in vitro. К концу XX в. было установлено, что дифференцировка клеток растений in vitro может происходить различными путями и в различной степени - от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. *Наиболее простой вид дифференцировки - появление в каллусной ткани дифференцированных клеток, имеющих специфическое морфологическое строение и выполняющих особые функции. Достаточно часто наблюдается возникновение эпибластов - клеток, депонирующих запасные вещества, а также вторичные метаболиты. *Гистологическая дифференциация каллусных клеток (гистогенез) - образование в каллусе различных тканей. В каллусной ткани может происходить образование млечников, волокон, трихом; сюда же можно отнести элементы сосудистой системы - трахеи и трахеиды ксилемы, ситовидные трубки и клетки-спутники флоэмы. *Органогенез (монополярные структуры) - это дифференциация каллусных клеток в целые органы: превращение их в апексы стеблей или корней, флоральные элементы. *Соматический эмбриогенез (биполярные структуры) - образование в каллусной или суспензионной культуре эмбриоидов, т. е. зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. Дифференциация тотипотентных клеток in vitro зависит от ряда факторов: -вида растения и генотипа растения-донора; -условий культивирования (различных питательных сред, экзогенных гормональных факторов, стимуляторов); -физических факторов культивирования (фотопериода, качества и интенсивности освещения, температурного режима, рН, аэрации). Первый этап дедифференциации клетки связан с ее вхождением в клеточный цикл, что происходит под действием фитогормонов - ауксинов и цитокининов. Три фазы роста клеток: 1 - деление, 2 - растяжение, 3 - дифференцировка (утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря способности к делению). Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки должны как бы возвратиться в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. |