лекция. Регуляторы роста растений

• Название: Регуляторы роста растений
• Анкор: лекция
• Дата: 27.11.2021
• Размер: 22.88 Kb.
• Имя файла: 6.docx
• Тип: Документы; #283908

Получение лекарственных средств на основе культур клеток растений методом биотехнологий.

Факторы, от которых зависит накопление вторичных метаболитов в процессе культивирования растительных клеток

1.      Регуляторы роста растений, они являются пусковыми механизмами первичного и вторичного метаболизма, т.е. влияют  на потенциал продуктивности культур клеток.

• ауксины (индолил-3-уксусная кислота (ИУК), нафтилукссная кислота (НУК) и 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д)

• цитокинины -6-бензиламинопурин (БАП), N-изоптен и 6-фурфуриламинопурин (кинетин)

Цитокины – это небольшие пептидные информационные молекулы. Цитокин выделяется на поверхность клетки А и взаимодействует с рецептором находящейся рядом клетки В. Таким образом, от клетки А к клетке В передается сигнал, который запускает в клетке В дальнейшие реакции.

Цитокины по разному влияют на накопление вторичных метаболитов: одни не реагируют на внесение в среду кинетика, а другие культуры клеток при этом начинают образовывать например, алкалоиды. Таким образом, существование цитокининзависимых и цитокининнезависимых клеток зависит от изменений в фенотипе (внешних), а не в генотипе (внутренних) культуры клеток.

2.      На синтез вторичных метаболитов влияет внесение в питательную среду известных предшественников, стимулирующих определенные ферментативные пути метаболизма. Например, внесение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивает выход диосгенина на 100%.

3.      Накопление вторичных метаболитов также зависит от света, температуры, рН, а при суспензионном культивировании от аэрации, перемешивания, скорости вращения сосудов, от газового состава и т.д.

Таким образом, создавая для каждой культуры клеток растений благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов, можно гарантировать получение любого продукта с метаболической активностью.

Для накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений используют:

1.      каллусные культуры

2.      суспензионные культуры (получают из каллусных)

Преимущества каллусных культур в технологии получения растительного сырья. Прежде всего - это:

• надежность и стабильность по выходу биомассы и продуктов вторичного метаболизма

• возможность использования каллусной системы для иммобилизации и последующей биотрансформации

Недостаток: в необходимости применения ручного труда

Выход продуктов вторичного метаболизма выше именно в каллусных культурах, но управление процессом культивирования легче осуществлять при работе в суспензионных культурах.

При производстве настоек женьшеня, плантационное выращивание этой культуры в количественном отношении по выходу панаксозидов имеет преимущество перед каллусным сырьем, но по токсичности, препараты, получаемые из каллусного сырья менее опасны.

При внедрении технологии суспензионного культивирования крайне важно учитывать основные свойства растительных клеток: клетки растений в 50-100 раз больше, чем клетки грибов; в результате роста клетки увеличиваются в размерах, в них появляется большая вакуоль; суспензионные культуры состоят из клеточных агрегатов; наличие целлюлозной клеточной оболочки; интенсивность дыхания.

ТЕХНОЛОГИЯ ВЫРАЩИВАНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК

Выращивание растительных клеток осуществляется в сосудах различного объёма (до 200 литров) с системами перемешивания (турбинное, восходящими потоками воздуха, встряхивания).

Сегодня применяют многостадийные способы получения биомассы и продуктов вторичного метаболизма:

• выращивание в аэрируемом реакторе;

• перенос клеток из одной среды в другую, более богатую микро- и макроэлементами, питательными веществами, но лишенную органических добавок;

• последующее добавление в конце цикла органики.

В основном клетки выращивают в периодическом реакторе.

Для повышения выхода продуктов вторичного метаболизма разрабатываются применительно к растительным клеткам методы иммобилизации, биотрансформации.

На моделях ряда клеточных культур, к примеру, кукурузы было показано, что синтез и накопление вторичных метаболитов связаны с агрегатным состоянием, отмечается, что чем ближе клетки и группы клеток к целому растению, тем выше у них метаболический потенциал. Имеется, однако, много данных об обратной зависимости между агрегатным состоянием и накоплением вторичных метаболитов. Это связано с двумя типами механизмов.

Если имеется прямая связь – один механизм накопления, когда определяющим в росте клетки является действительно уровень агрегации, когда достаточная ее степень может быть достигнута в медленно растущих культурах.

В случае обратной связи включается другой механизм накопления вторичных метаболитов и в этом случае уже определяющим фактором является не агрегация, а кинетика скорости роста, когда первичные и вторичные пути метаболизма по разному конкурируют за предшественник в быстро и медленно растущих клетках.

Вывод. Иммобилизованные клетки с низкой скоростью роста способны к интенсивной выработке метаболитов. Одним из основных условий иммобилизации является:

- выделение метаболита в питательную среду

- свободное извлечение метаболита из питательной среды. (например, к таким клеткам относятся клетки, продуцирующие алкалоиды)

Способы иммобилизации

•        клетки встраивают в альгинат кальция

•        клетки встраивают в агарозные шарики

•        клетки встраивают в трехмерные сетчатые структуры из нейлона, порошкового металла, полиуретана (в частности такие системы используются для наперстянки шерстистой)

Клетки, иммобилизованные на плоской основе, имеют более высокий уровень синтеза вторичных метаболитов, однако горизонтальная конструкция при промышленном культивировании создает неудобства при работе и требует большей площади, что устраняется в системе колончатой культуры.

Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с суспензионными культурами:

• многократное использование

• четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма

• увеличение продолжительности культивирования на стадии

продуцирования

• получение большого количества вторичных метаболитов.

Другим перспективным вариантом использования культур клеток растений в фармацевтической промышленности следует считать их применение для биотрансформации.

Биотрансформация

Биотрансформация – это метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения и способные менять функциональные группы добавленных из вне химических соединений.

Метод используется для повышения биологической активности конкретной химической структуры и проведения серий специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов.

В качестве примера можно привести превращение дигитоксина в дигогсин клетками наперстянки шерстистой

Недеференцированные культуры клеток Digitalis lanata сами не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду.

Биотрансформация дигитоксина в дигогсин идет за счет реакции 12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, находящимся в клетках Digitalis lanata.

Итак, для дальнейшего развития этого направления получения лекарственных средств на основе клеток растений с использованием биотрансформации необходимо следующее:

1. селекция специализированных линий клеток

2. оптимизация условий культивирования

3. сокращения времени ферментации

4. увеличение срока работы клеток.

Культура протопластов

Использование культуры протопластов

Протопласт– клетка, лишенная клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке.

Впервые протопласты в 1892г. выделил Клеркер, который использовал механическийспособ.

Другой метод выделения протопластов – энзиматический, с использованием ферментов 3 типов:

•        целлюлазы,

•        гемицеллюлазы

•        пектиназы.

Отдельные клетки могут быть изолированы из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра с сортером или путем последовательных разбавлений. Более эффективны методы использованияткани-«няньки» или «кормящего слоя».

Отсутствие клеточной стенки у протопластов обусловливает их свойства, отличные от целых клеток. Благодаря тому, что протопласты способны поглощать макромолекулы и органеллы, их используют в качестве реципиентов при трансформации, а также в экспериментах по клеточной селекции и мутагенезу. Изолированные протопласты служат источником для выделения неповрежденных и функционально активных субклеточных и цитоплазматических структур и органелл (хлоропластов, ядер, хромосом).

Под воздействием электрического поля или с помощью полиэтиленгликоля протопласты могут сливаться друг с другом с образование  двух видов новых клеток:

ü    Гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного родителя.

ü    Гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих родителей.

Способность протопластов сливаться друг с другом нашла применение для получения соматических гибридов.

Современное состояние и достижения в области биотехнологии лекарственных средств на основе культур растительных клеток и тканей.

Россия занимает первое место в мире по промышленному производству культур клеток. В настоящее время получено более 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ либо на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве. В нашей стране разработаны и внедрены в промышленное производство технологии получения БАВ из биомассы женьшеня и родиолы розовой.