Шпоры культура клеток органов и тканей. ККОИТ. 1. История развития метода культивирования клеток и тканей растений
 Скачать 1.38 Mb.
|
|
23.Типы каллусных культур и их характеристика. Каллусная культура - это неорганизованно пролиферирующая ткань, возникающая из дедифференцированных клеток. «Каллус-мозоль» может образовываться на растении при поранении. Это естественный процесс, который можно наблюдать в природе. На месте ранения часть ткани утрачивает прежние связи с организмом, для их восстановления необходимо нарастание клеточной массы. То же происходит и на изолированных кусочках ткани (эксплантах) в культуре in vitro. При помещении фрагмента ткани или органа растения на питательную среду соответствующего состава может происходить дедифференциация соматических клеток с образованием каллусной ткани. Как правило, для индукции каллусной ткани необходимо присутствие двух гормонов: ауксинов (дедифференцировка и подготовка к делению) и цитокининов (пролиферация - деление). Каллусные культуры различаются по: *интенсивности роста; *окраске(белый, желтый, бурый, коричневый); *консистенции и др. 1) в зависимости от источника получения: a)гомогенные (содержат один тип клеток); b) гетерогенные (содержат несколько типов клеток) Каллусная ткань может содержать клетки следующих типов: *паренхимные; *меристематические; *отдельные клетки или зоны проводящей системы; *некротические 2) в зависимости от консистенции: * рыхлые (легко распадаются на отдельные клетки, состоящая из сильно оводнённых клеток); *среднеплотные (клетки могут быть отделены друг от друга сильным взбалтыванием либо встряхиванием, с хорошо выраженными меристематическими очагами); *плотные (клетки очень мелкие, не отделяются взбалтыванием, выражены зоны с камбиальными и трахеиподобными элементами). «Разрыхлить» каллус можно путем: 1) исключения из питательной среды солей Са2+; 2) использования при выращивании культуры в качестве ауксина 2,4-Д; 3) добавления ферментов – 0,2 мг/л пектиназы и 0,01 мг/л целлюлазы. 24. Показатели роста каллусных культур. Массу сырого веса определяют в начале и в конце роста культуры, отделяя клетки от питательной среды. Для определения сухой массы сырую биомассу сушат до постоянного веса. Расчёт показателей: • увеличение сырого веса (г): М =Wt –W0, где М – увеличение сырого веса, W0 – исходный вес ткани, Wt – конечный вес ткани; • прирост сырой биомассы относительно исходного веса (г): П =(Wt – W0)/ W0, где П – прирост сырой биомассы относительно исходного веса; • прирост с учётом фактора времени (сут -1): Пt =((Wt –W0)/ W0) *1/t, где Пt –прирост с учётом фактора времени; • удельную скорость роста (сут -1): μ = ( ln Wt – ln W0)/t, где μ – удельная скорость роста, W0 – биомасса в начале интегралов времени (t =0), Wt- биомасса в конце интегралов времени, t –время; • время удвоения биомассы (сут): g = ln2/μ, где g- время генерации (период удвоения) биомассы, μ-удельная скорость роста; • индекс скорости роста по сырой биомассе: I =Wt / W0 , где I- индекс скорости роста по сырой биомассе, Wt – масса каллусов в конце цикла выращивания, W0 - масса каллусов в начале цикла выращивания; • максимальное накопление биомассы (г/л): Х= Wt*1000/V, где Х-максимальное накопление биомассы, Wt - максимальная биомасса (сырая или сухая) в течение цикла культивирования, V -объём среды культивирования; • экономический коэффициент (грамм биомассы на 1 грамм потребленной сахарозы): ЭК= Wt/((С* V)/1000), где ЭК – экономический коэффициент, Wt - максимальная биомасса (сырая или сухая) в течение культивировании, С –концентрация сахарозы в среде; • продуктивность по биомассе (г/л в сутки): Р= Х/t , где Р - продуктивность по биомассе, Х- максимальное накопление биомассы (сырой и сухой), t- время. Содержание воды в ткани: Х%=((Wt сыр- Wt сух)*100%)/Wt сыр, где Х% - содержание воды в ткани, Wt сыр – сырая биомасса в конце интегралов времени, Wt сух – сухая биомасса в конце интегралов времени. 25. Основные направления использования каллусных культур растений в биотехнологии. Каллусные ткани являются одним из основных объектов при длительном культивировании in vitro. Каллусную ткань in vitro можно получить практически из любой живой ткани растения. 1. Сохранение генофонда растений (каллус сохр свои способности к росту даже при хранении в жидком азоте при температуре -196°С). 2. Получение суспензионных культур и протопластов. Рыхлый каллус используют для получения одиночных клеток в жидкой питательной среде и последующего культивирования суспензионной культуры, каллусные ткани могут быть также использованы для получения протопластов. 3. В клеточной селекции. Состояние каллуса индуцирует сомаклональную изменчивость, что дает основание для проведения отбора в культуре клеток и создания новых генотипов. 4. Использование каллуса для микроразмножения растений. Культуры, могут размножаться в результате образования зародышеподобных структур из каллуса или суспензионной культуры, полученной на его основе. Недостаток этого метода вегетативного размножения – возможность появления генетических отклонений в результате сомаклональной изменчивости . 5. Получение вторичных метаболитов. Культура каллуса и суспензионная культура применяется для промышленного получения синтезируемых клетками соединений, используемых для целей медицины, защиты растений, производства продуктов питания и др. 6. Использование каллусных культур как модельных объектов при изучении стрессовых воздействий на растения (заболевания, тяж металлы, низкие температуры, солевые растворы и т.д.). 26.Клеточная инженерия (КИ) в растениеводстве. Основной задачей КИ является конструирование новых форм растений с желаемыми признаками. Перспективный метод получения дальнеродственных гибридов основывается на новой экспериментальной технике – парасексуальной гибридизации, осуществляемой путем слияния протопластов. Продукты слияния протопластов часто являются асимметричными гибридами, представляющими ценные формы, содержащие весь хромосомный набор культурного вида и лишь несколько хромосом или генов дикого родителя. Слияние протопластов позволяет получать уникальные сочетания митохондриальных и хлоропластных генов. При соматической гибридизации возможно получение гибридов филогенетически отдаленных форм, которые обычным путем скрестить невозможно. Быстрый прогресс в совершенствовании методов КИ позволяет надеяться, что соматическая гибридизация как новая биотехнология станет основной в селекции для получения жизнеспособных гибридов нескрещивающихся видов растений. Реконструкция клетки является еще одним бурно развивающимся направлением КИ. Речь идет о сборке совершенно новой клетки за счет объединения (слияния) изолированных клеточных фрагментов друг с другом или с целыми клетками. В результате такой реконструкции можно создать клетку, ранее в природе не существовавшую. Однако многие проблемы, стоящие на пути исследований в данном направлении, связаны с ограниченным числом подходящих методик фрагментации и выделения гомогенных популяций интактных клеточных фрагментов. Новым направлением КИ растений является создание необычных биологических систем путем введения микрорганизмов в популяцию культивируемых клеток. Создание таких ассоциаций представляет интерес для решения следующих задач: 1) экспериментальной проверки теории эндосимбиотического происхождения эукариотической клетки в процессе эволюции; 2) моделирования природных симбиотических отношений растений микроорганизмов; 3) повышения продуктивности культивируемых растительных клеток; 4) получения растений с новыми свойствами; 5) изучения различных аспектов взаимодействия растения-хозяина и патогена. Получение искусственных ассоциаций межклеточного и внутриклеточного типа на основе культивируемых клеток или изолированных протопластов с микроорганизмами является одним из новых способов модификации растительной клетки. Довольно перспективным является получение ассоциаций культур клеток растений с микроорганизмами, способными к фиксации молекулярного азота атмосферы. Способность к формированию азотфиксирующих симбиотических систем приобрели определенные группы высших растений и микроорганизмов. В связи с этим вопрос о повышении способности к вступлению в такие симбиотические ассоциации для большинства растений имеет важное экономические значение и может быть решен методами КИ. Следовательно, становится возможным конструирование клеток с новыми свойствами. Реконструированные клетки, происходящие из ядра и цитоплазмы разного происхождения, являются удобными экспериментальными моделями для решения таких важных биологических проблем, как дифференцировка, старение клеток, цитоплазматическая наследственность. Гибриды растений с генетически реконструированной цитоплазмой представляют собой весьма ценный материал для оценки влияния двух цитоплазматических генофоров на различные практически значимые признаки возделываемых культур. 27.Способы получения суспензионных культур растений Для получения суспензионных культур чаще всего используют каллусную ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты при помещении ее в перемешиваемую жидкую среду. С этой целью при культивировании каллуса из среды исключают цитокинины или снижают их концентрацию, а концентрацию ауксинов увеличивают. Первичный каллус использовать нежелательно, т. к. он содержит обычно более плотные агрегаты клеток. Возможно получение суспензионной культуры непосредственно из эксплантов, помещенных в жидкую среду. Возникающие на поверхности экспланта каллусные клетки могут отрываться и переходить в среду, давая начало суспензии. Но это длительный и малоэффективный процесс. Для некоторых исследований суспензионную культуру клеток получают путем ферментативной мацерации растительных тканей, например из мезофилла листа, но такую суспензию невозможно поддерживать в течение длительного времени. Для получения первичной суспензии, как правило, используют 2—3 г свежей массы каллусной ткани на 60—100 мл жидкой питательной среды. Для избавления от крупных плотных остатков каллуса, больших клеточных агрегатов ее фильтруют через 1—2 слоя марли, нейлон или отбирают одиночные клетки и мелкие агрегаты путем осаждения крупных агрегатов при отстаивании суспензии в течение нескольких минут. Колбы помещают на качалку, скорость вращения которой обычно составляет 110—120 об/мин. Клеточные суспензии обычно требуют регулярного и более частого субкультивирования, чем каллусные культуры. Часть суспензионной культуры, используемая для пересадки на свежую среду, называется инокулюм. Для каждой линии культуры клеток существует минимальный размер инокулюма, при уменьшении объема которого культура не растет. Суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только из одиночных клеток. В лучшем случае последние составляют 50—60 %, остальное приходится на долю групп из 2—10 клеток и многоклеточные агрегаты. В зависимости от степени агрегированности выделяют слабоагрегированные (до 5—10 клеток), среднеагрегированные (более 10 клеток) и высокоагрегированные суспензии (более 50 клеток в агрегате). 28. Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ. Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др. Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования. Морфологические характеристики такой линии: высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе); морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма); отсутствие трахеидоподобных элементов. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую. Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания. Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы. Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость. Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования. Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, со провождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии. Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения. 29. Способы культивирования клеточных суспензий растений Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую. Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания. Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы. Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость. Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования. Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток. Для культуры клеток женьшеня отрицательное влияние механического стресса при выращивании в ферментере с турбинными мешалками сказывалось на жизнеспособности клеток уже при скоростях мешалок свыше 100—350 об/мин, это отрицательно влияло на синтез ими антрахинонов. Устойчивость штамма к механическому стрессу является важным требованием к культуре и трудной задачей для исследователей. Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, со провождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии. Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения. 30. Методы изолирования одиночных клеток растений Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Обычно в такие клетки вводят маркерные гены, которые позволяют осуществлять селекцию. Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и целой ткани. Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов: 1) изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани; 2) создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки. На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани. Этого можно достичь путем обработки ткани пектиназами, что ведет к мацерации ее клеток. Однако не всегда после такой обработки клетки сохраняют способность к последующим делениям и образованию ткани. Лучше получать отдельные клетки из суспензионных культур или рыхлого каллуса. Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку. Далее клетки изолируют либо при помощи микроманипуляторов, либо путем ряда последовательных разведений. При первых же попытках культивирования отдельных клеток возникла важная научная проблема: как заставить делиться клетки, изолированные от влияния других клеток популяции или тканей? Отдельные клетки вели себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды. При ее решении возникла гипотеза о «факторе кондиционирования». Так было названо вещество, стимулирующее деление отдельных клеток. Определено, что этот фактор имеет химическую природу, термолабилен, водорастворим, низкомолекулярен, видонеспецифичен, не заменяет известные фитогормоны, синергичен с брассиностероидами. Было предложено несколько вариантов культивирования отдельных клеток. Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки» Клетку изолируют при помощи микроманипулятора из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра размером 8 * 8 мм, помещенный на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. Каллус должен находится в фазе активного роста. Можно также в качестве «няньки» использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В этом случае клетки растут и делятся. По мере старения каллуса – няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. Когда ткань из клетки достигает размеров 0,5 – 1 мм, то ее можно высаживать непосредственно на питательную среду. Проводились также эксперименты по высаживанию клетки непосредственно на агаризованную среду, но обязательно рядом с фильтром, который в течение нескольких дней контактировал с молодой, интенсивно растущей каллусной тканью. Поскольку эти работы показали, что постоянный контакт клетки через фильтр с каллусной массой не является обязательным для деления клетки, то было предложено использовать старую культуральную среду для стимуляции одиночной клетки к делению. 31. Клон – потомство одиночной клетки каллусных тканей. Для получения одноклеточной фракции суспензионной культуры иногда достаточно простого отстаивания в колбе в течение 15 – 30 мин: при этом крупные агрегаты оседают на дно колбы, а надосадочная фракция содержит только одиночные клетки или мелкие агрегаты. Если при отстаивании не удается получить одноклеточную фракцию, применяют мацерирующие ферменты, центрифугирование или фильтрования через сита (нейлоновые или металлические). Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночную клетку делиться были разработаны специальные методы. Культивирование одиночных клеток представляет большой интерес в связи с возможностью получения на их основе генетически однородных клонов. Важно использовать одиночные клетки ( протопласты) и для соматической гибридизации. Для изолирования одиночных клеток используют рыхлый каллус, низкоагрегированную суспензию, изолирование отдельных клеток непосредственно из тканей целого растения ( например, мезофилла листа после мацерации его ферментам). Используют следующие методы выращивания одиночных клеток: |