Клонирование ДНК. Ахметшина С.А. 19-ТПМ-12 Клонирование ДНК.. Клонирование днк. Определение нуклеотидных последовательностей.
 Скачать 41.64 Kb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ» Институт: «Институт пищевых систем и здоровьесберегающихТехнологий» Кафедра: «Биотехнологии и технологии продуктов биоорганического синтеза» Реферат На тему: «Клонирование ДНК.Определение нуклеотидных последовательностей.» Выполнила студентка: Группы 19-ТПМ-12 Ахметшина Сюмбель Проверил преподаватель: Каночкина Мария Сергеевна Москва 2021 Содержание 1) Введение .……………………………………………………………………….3 2) Клонирование ДНК.Обзор……………………………………………………..4 3)Этапы клонирования ДНК.…..…………………………………………..……..5 4) Методы клонирования…………….……………………………………………6 5)Определение нуклеотидной последовательности ДНК.………………………………10 6)Достоверностьсеквенирования ДНК.…….…………………………………………….15 7) Заключение ..…………………………………………………………………..16 8) Список литературы ..…….……………………………………………………17 Введение Разработка методов клонирования и определения последовательности оснований (секвенирования) нуклеиновых кислот положила начало новому этапу развития молекулярной биологии. Знание первичной структуры участков генома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно применить для их исследования целый арсенал новых методов генной инженерии. Эти методы (направленный мутагенез, рекомбинация in vitro и др.) позволяют модифицировать участки нуклеотидных последовательностей и исследовать их функции на молекулярном уровне. С их помощью комбинируются участки генетического материала и создаются геномы с совершенно новыми функциями. Клонирование ДНК.Обзор Клонирование ДНК — это процесс создания нескольких идентичных копий определенного фрагмента ДНК. В типичной процедуре клонирования ДНК ген или другой интересующий нас фрагмент ДНК (возможно, ген какого-то белка, важного с медицинской точки зрения) сначала встраивается в кольцевую молекулу ДНК, называемую плазмидой. Встраивание выполняется при помощи ферментов, которые «вырезают и вставляют» ДНК, в результате чего образуется молекула рекомбинантной ДНК или ДНК, собранной из фрагментов, полученных из нескольких разных источников. Затем рекомбинантную плазмиду вводят в бактерии. Бактерии, несущие плазмиду, отбираются и выращиваются. В процессе работы они реплицируют плазмиду и передают ее своему потомству, таким образом воспроизводя большое количество копий ДНК. В чем смысл создания множества копий ДНК плазмиды? В некоторых случаях это нужно для проведения экспериментов или создания новых плазмид. В других случаях фрагмент ДНК кодирует полезный белок, и бактерии используются как «фабрики» для производства этого белка. Например, ген человеческого инсулина экспрессируется в кишечную палочку для выработки инсулина, используемого диабетиками. Этапы клонирования ДНК. Геном был разбит на небольшие участки, примерно по 150 000 пар нуклеотидов в длину. Эти куски затем встраивали в вектор, известный как Искусственная бактериальная хромосома или BAC. Эти векторы созданы из бактериальных хромосом, измененных методами генной инженерии. Векторы, содержащие гены, затем можно вставлять в бактерии, где они копируются бактериальными механизмами репликации. Каждый из кусочков генома потом секвенировали раздельно методом дробовика, и затем все полученные последовательности собирали воедино уже в виде компьютерного текста. Размеры полученных больших кусков ДНК, собираемых для воссоздания структуры целой хромосомы, составляли около 150 000 пар нуклеотидов. Такая система известна под именем «иерархического метода дробовика», потому что вначале геном разбивается на куски разного размера, положение которых в хромосоме должно быть заранее известно. Клонирование ДНК используется для многих целей.Основные шаги этого процесса следующие: «Разрезание» плазмиды и «вставка» в нее целевого гена. Этот процесс основан на рестриктазах (которые разрезают ДНК) и ДНК-лигазе (которая сшивает ДНК). Перенос плазмиды в бактерии. При помощи антибиотиков выявляются бактерии, которые содержат плазмиду. Наращивание большого количества бактерий, несущих плазмиды, и использование их в качестве «фабрик» для производства белка. Получение белка и его очистка. Методы клонирования. Методы трансплантации ядер. В нашей стране Б. В. Конюховым и Е. С. Платоновым в 1985 г. был разработан метод менее травматического переноса ядер методом микроманипуляции. Он протекает в два этапа: сначала тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы, а затем другой пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора.Трансплантация ядер может осуществляться и другим способом, с использованием цитохалазинов (веществ, синтезируемых грибами). Цитохалазин-В разрушает структуру микрофиламентов и способствует уникальному расположению ядра. Ядро остается соединенным с клеткой тоненьким стебельком цитоплазмы. При центрифугировании этот мостик разрывается, образуются безъядерные клетки (цитопласты) и кариопласты, представляющие собой ядра, окруженные тонким слоем цитоплазмы и цитоплазматической мембраной. Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Они сохраняют способность прикрепляться к поверхности культурального сосуда и могут быть использованы для слияния с кариопластами других клеток с целью получения жизнеспособной клетки. Методы выделения кариопластов несколько сложнее и включают в себя ряд операции по центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. В некоторых случаях к смеси клеток и кариопластов добавляют частицы тантала диаметром 1 – 3 мкм. Они проникают в клетки и никогда в кариопласт, поэтому более тяжелые клетки осаждаются быстрее кариопластов.Цитопласты содержат все виды органелл, присущие нормальной клетке, сохраняют способность прикрепляться к субстрату, образовывать складчатую мембрану, передвигаться, осуществлять пиноцитоз. Кариопласты окружены тонким слоем цитоплазмы (около 10% от всей клеточной цитоплазмы), содержат компактный эндоплазматический ретикулум, несколько митохондрий и рибосом. У некоторых клеточных линий 1/10 кариопластов способна восстановить весь утраченный объем цитоплазмы и восстановиться в жизнеспособные клетки. Метод генетического перепрограммирования клеток кожи. Этот метод менее трудоемкий, чем тот, что использовался при клонировании овцы Долли. В связи с этим возникли опасения, что однажды он будет использован для обработки эмбрионов человека, дабы формировать детей "по заказу". Никто из ученых, разрабатывающих методы перепрограммирования клеток для производства индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced Puripotent Stem, сокращенно iPS) – так называют эмбриональные клетки – не планирует применять их в репродуктивной медицине человека. Главная цель ученых – наладить производство стволовых клеток для терапевтического лечения таких заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и инсульт. Клонирование растений Любой садовод или цветовод неоднократно сталкивался с клонированием растений, это один из способов размножения называемый вегетативным, когда растение размножается частями тела: отводками, черенками, розетками, листовыми пластинами, отростками, усиками. Это и есть пример клонирования. Природа клонирует организмы миллиарды лет. Например, когда куст хлорофитума дает побег, новое растение вырастает на месте, где этот побег укоренился. Новое растение, и есть клон. Такое же клонирование происходит с травой, картофелем и луком. Люди клонировали растения одним или другим способом тысячи лет. Когда вы берете лист, отрезанный от растения, и выращиваете из него новое растение (вегетативный способ), вы клонируете изначальное растение, потому что у нового растения такой же генетический набор, как и у растения – донора. Следовательно, клонированием можно считать любой процесс вегетативного размножения у растений. Всё шире на промышленной основе применяется вегетативное размножение сельскохозяйственных растений методом культуры тканей. Он позволяет не только быстро размножать новые перспективные сорта растений, но и получить незаражённый вирусами посадочный материал. Процесс этот у растений значительно более простой, чем клонирование животных. Дело в том, что у растений (в отличие от животных) по мере их роста в ходе клеточной специализации - дифференцировки - клетки не теряют так называемых тотипотентных свойств, т.е. не теряют своей способности реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в ядре. Поэтому практически любая растительная клетка, сохранившая в процессе дифференцировки свое ядро, может дать начало новому организму. Для клонирования растительную клетку достаточно изолировать из целого растения и поместить на питательную среду, содержащую солевые компоненты, витамины, гормоны и источник углеводов, она начинает делиться и образует культуру каллуса. В дальнейшем каллусы можно размножить и получить неограниченное количество биомассы. Основная трудность, с которой сразу же приходится сталкиваться исследователю - это то, что клетки в искусственных условиях начинают бурно делиться и расти, но при этом часто не в состоянии продуцировать вторичные метаболиты, т.е. биологически активные вещества растений. Клонирование животных. В настоящее время, как известно, воспроизводство живых существ в лабораторных условиях является реальным событием и отрицать это после сообщения о появлении на свет первого животного никак нельзя. Первые клоны животных были созданы еще на рубеже 19-го и 20-го столетий. Однако методики клонирования того времени можно было использовать лишь в опытах с небольшим числом примитивных живых существ, например, морских ежей и саламандр. Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Американские исследователи Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других работах. В 1997 году научная общественность была взбудоражена сообщением, что в Англии успешно завершились эксперименты по генетическому клонированию овцы. Для этого использовали ядра соматических клеток, полученных из ткани молочной железы взрослой овцы – донора. На рисунке видно из яйцеклетки удалялось ядро и замещалось ядром соматической клетки. Образовавшуюся диплоидную клетку стимулировали к дроблению электрошоком и пересаживали в овцу реципиента. Через 148 дней приёмная мама родила живую овечку, которую назвали Долли. Потребовалось очень много попыток клонирования, прежде чем на свет появилась Долли. Ученые — биологи из Шотландии Йэн Уилмат и Кейт Кемпбелл — по праву могут считать себя «Родителями» Долли. В 2003 году Долли пришлось усыпить из-за заболевания легких и артрита. После этого ее забальзамированное тело было выставлено в Королевском музее Шотландии. Клонирование человека. Стремительное развитие биотехнологии привело к тому, что перед человечеством встал вопрос о клонировании человека. В настоящее время существуют различные подходы к этой проблеме . Клонирование человека – действие, заключающееся в формировании и выращивании принципиально новых человеческих существ, точно воспроизводящих не только внешне, но и на генетическом уровне того или иного индивида, ныне существующего или ранее существовавшего. В 1993 году ученый из Южной Кореи (университет Кьюнджи) создал клон человека, вырастил его до 4 клеток и уничтожил. Понять, удался ли эксперимент, можно только, когда зародыш состоит из 8-16 клонов, потому всемирного признания не последовало. За последние годы прозвучало немало заявлений о клонировании человека. Но ни разу не было представлено убедительных доказательств. И не только убедительных, а вообще никаких. В настоящее время во многих странах, в том числе и в России, активно разрабатываются законы, направленные на введение в правовые рамки работ по генной инженерии, а также исследований по клонированию человека. Важно, чтобы новые научные исследования и разработки в области биотехнологии были направлены на благо человечества. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Описанные методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели большое значение сами по себе. Но они также проложили путь к разработке исключительно эффективных методов секвенирования ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 100 - 500 нуклеотидных пар, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Метод Маскама и Гилберта (химический) Один из методов основан на химической деградации ДНК. Он был предложен в 1976 году Максамом и Гилбертом и назван их именем. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора 32Р. В последнее время вместо радиоактивной вводят флюоресцирующую метку. Ее можно «цеплять» и к нуклеотидам, причем для каждого типа нуклеотидов подбирать различную окраску. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Разрушение идет в 2 этапа. На первом этапе происходит модификация азотистого основания и последующее выщепление его. На втором этапе производят гидролиз ДНК в местах выщепления оснований. Пуриновые основания модифицируются диметилсульфатом. Адениновые остатки метилируются по третьему атому азота, гуаниновые – по положению N7. Если такую модификацию обработать 0,1 М HCl при 0оС, то выщепляется метиладенин. При последующей инкубации в щелочной среде (0,1 М NaOH) при температуре +90С происходит разрушение сахаро-фосфатной связи в местах выщепления оснований. Обработка поврежденных молекул пиперидином приводит к гидролизу ДНК по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируются гидразином. В бессолевой среде модифицируется и цитозин, и тимин, в присутствии 2 М NaCl модифицируется только цитозин. При дальнейшей обработке пиперидином происходит расщепление ДНК по точкам модификации. Можно использовать и другие реакции химической модификации оснований и расщепления по ним молекул ДНК. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят радиоавтографию, и те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют "отпечатки" на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание - его положение. Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК. Аналогично наблюдают флюоресцентное окрашивание. Если для каждого из четырех нуклеотидов был подобран свой цвет флюоресцентной метки, то при электрофорезе их наносят на 1 дорожку. Тогда расположение нуклеотидов отмечено штрихами разного цвета, а процедуру считывания легко автоматизировать. Метод Сэнгера (ферментативный) Другой метод, разработанный Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер использовал ДНК-полимеразу I. В клетке этот фермент участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок - затравка, с которого начинается синтез (рис. 41). Были также синтезированы модифицированные дидезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксирибоза 3’-ОН отсутствует, для каждого из четырех оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Поэтому их называют терминаторами элонгации. Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить, короткого фрагмента "меченой" ДНК, комплементарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырех ddNTP и соответствующего dNTP в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК. В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины - вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секвенирования. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель. Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. – геном арабидопсиса, в 2000 году – геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы, это более сложная задача. Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью. Теперь за три-четыре дня можно синтезировать последовательность из 12 - 20 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. Появились приборы - ДНК-синтезаторы, которые выполняют эту работу за несколько часов. Для теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. ДНК-зонды применяются в различных целях. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой клетки, может выявить наличие или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику наследственных болезней. В большинстве случаев мутации, ведущие к наследственным болезням, рецессивны, то есть болезнь развивается, если человек получает дефектные гены от обоих родителей. Аномальные эмбрионы лучше выявлять до рождения. Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована. Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Они дешевы, очень надежны, просты в обращении и могут многократно использоваться. Недостаток – дорогая аппаратура для детекции. Достоверность секвенирования ДНК. Немаловажное значение имеет достоверность получаемой информации в виде последовательности нуклеотидов, чему всегда уделялось серьезное внимание. Разработаны специальные компьютерные программы, направленные на выявление неточностей при анализе первичных данных, а также контролирующие весь ход выполнения проекта по крупномасштабному секвенированию ДНК. Особенно важным это становится в случаях когда в одной лаборатории выполняется более одного крупномасштабного проекта и поток данных чрезвычайно велик. Заключение Генетическая инженерия, а в частности работа с рекомбинантными ДНК на сегодняшний день является важнейшей и наиболее быстро развивающейся составной частью биотехнологии. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. Секвенирование нуклеиновых кислот в настоящее время стало рутинным методом молекулярной биологии. Благодаря знанию генетического кода появилась возможность определять участки нуклеотидных последовательностей, кодирующих потенциальные белки. Этот источник дает основную информацию о функциональном строении нуклеотидной последовательности. Секвенирование - это общее название методов, принципов и технологий, которые позволяют определить полную нуклеотидную последовательность всех хромосом, всего ДНК любого генома, любого организма. Этот метод позволяет определить последовательность нуклеотидов любых генов, что дает возможность их синтеза. Список литературы «Молекулярная биология», Коничев А.С., Севастьянова Г.А., 2012. Миненко И.А. и Сердюков Д.Г. 2014. К вопросу об истории клонирования. «Вестник новых медицинских технологий» Основы современной генетики. Генетика человека, Маккьюсик В. А. 4) Дейвис К. Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. - М., Мир, 1990. 5) https://ru.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/ 6) https://studme.org/396736/meditsina/klonirovanie |