биология ярыгин. Книга 1 Издание пятое, исправленное и дополненное

• Название: Книга 1 Издание пятое, исправленное и дополненное
• Анкор: биология ярыгин.doc
• Дата: 24.03.2018
• Размер: 7.35 Mb.
• Имя файла: биология ярыгин.doc
• Тип: Книга; #17128
• страница: 21 из 41

6.4.2. Особенности человека

как объекта генетических исследований

Основные закономерности наследственности и изменчивости живых организмов были открыты благодаря разработке и применению гибридологического метода генетического анализа, основоположником которого является Г. Мендель. Наиболее удобными объектами, широко используемыми генетиками для гибридизации и последующего анализа потомства, стали горох, дрозофила, дрожжи, некоторые бактерии и другие виды, легко скрещивающиеся в искусственных условиях. Отличительной особенностью этих видов является достаточно высокая плодовитость, позволяющая применять статистический подход при анализе потомства. Короткий жизненный цикл и быстрая смена поколений позволяют исследователям в относительно небольшие промежутки времени наблюдать передачу признаков в последовательном ряду многих поколений. Немаловажной характеристикой видов, используемых в генетических экспериментах, является также небольшое число групп сцепления в их геномах и умеренное модифицирование признаков под влиянием окружающей среды.

С точки зрения приведенных выше характеристик видов, удобных для применения гибридологического метода генетического анализа, человек как вид обладает целым рядом особенностей, не позволяющих применять этот метод для изучения его наследственности и изменчивости. Во-первых, у человека не может быть произведено искусственного направленного скрещивания в интересах исследователя. Во-вторых, низкая плодовитость делает невозможным применение статистического подхода при оценке немногочисленного потомства одной пары родителей. В-третьих, редкая смена поколений, происходящая в среднем через 25 лет, при значительной продолжительности жизни дает возможность одному исследователю наблюдать не более 3—4 последовательных поколений. Наконец, изучение генетики человека затрудняется наличием в его геноме большого числа групп сцепления генов (23 у женщин и 24 у мужчин), а также высокой степенью фенотипического полиморфизма, связанного с влиянием среды.

Все перечисленные особенности человека делают невозможным применение для изучения его наследственности и изменчивости классического гибридологического метода генетического анализа, с помощью которого были открыты все основные закономерности наследования признаков и установлены законы наследственности. Однако генетиками разработаны приемы, позволяющие изучать наследование и изменчивость признаков у человека, несмотря на перечисленные выше ограничения.

Невозможность направленного скрещивания, проводимого в интересах исследования, и малочисленность потомства, получаемого от каждой родительской пары, компенсируются подбором в популяции семей с интересующим генетика признаком в количестве, достаточном для проведения статистического анализа потомства. Ограниченность числа поколений, которые может наблюдать один генетик, компенсируется возможностью подбора и регистрации последовательных поколений семей с интересующим признаком многими поколениями исследователей. Существенно облегчается генетический анализ у человека благодаря высокой степени изученности его фенотипа методами морфологии, физиологии, биохимии, иммунологии, клиники. Большие перспективы в изучении наследственности и изменчивости у человека открываются в связи с применением ранее используемых и новых методов генетических исследований.

6.4.3. Методы изучения генетики человека

К методам, широко используемым при изучении генетики человека, относятся генеалогический, популяционно-статистический, близнецовый, метод дерматоглифики, цитогенетический, биохимический, методы генетики соматических клеток.

6.4.3.1. Генеалогический метод

В основе этого метода лежит составление и анализ родословных. Этот метод широко применяют с древних времен и до наших дней в коневодстве, селекции ценных линий крупного рогатого скота и свиней, при получении чистопородных собак, а также при выведении новых пород пушных животных. Родословные человека составлялись на протяжении многих столетий в отношении царствующих семейств в Европе и Азии.

Как метод изучения генетики человека генеалогический метод стали применять только с начала XX столетия, когда выяснилось, что анализ родословных, в которых прослеживается передача из поколения в поколение какого-то признака (заболевания), может заменить собой фактически неприменимый в отношении человека гибридологический метод.

При составлении родословных исходным является человек — пробанд, родословную которого изучают. Обычно это или больной, или носитель определенного признака, наследование которого необходимо изучить. При составлении родословных таблиц используют условные обозначения, предложенные Г. Юстом в 1931 г. (рис. 6.24). Поколения обозначают римскими цифрами, индивидов в данном поколении — арабскими.

Рис. 6.24. Условные обозначения при составлении родословных (по Г. Юсту)

С помощью генеалогического метода может быть установлена наследственная обусловленность изучаемого признака, а также тип его наследования (аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный, X-сцепленный доминантный или рецессивный, Y-сцепленный). При анализе родословных по нескольким признакам может быть выявлен сцепленный характер их наследования, что используют при составлении хромосомных карт. Этот метод позволяет изучать интенсивность мутационного процесса, оценить экспрессивность и пенетрантность аллеля. Он широко используется в медико-генетическом консультировании для прогнозирования потомства. Однако необходимо отметить, что генеалогический анализ существенно осложняется при малодетности семей.

Родословные при аутосомно-доминантном наследовании. Для аутосомного типа наследования в целом характерна равная вероятность встречаемости данного признака как у мужчин, так и у женщин. Это обусловлено одинаковой двойной дозой генов, расположенных в аутосомах у всех представителей вида и получаемых от обоих родителей, и зависимостью развивающегося признака от характера взаимодействия аллельных генов.

При доминировании признака в потомстве родительской пары, где хотя бы один родитель является его носителем, он проявляется с большей или меньшей вероятностью в зависимости от генетической конституции родителей (рис. 6.25).

Рис. 6.25. Вероятность появления потомков с доминантным признаком от различных супружеских пар (/—III)

Если анализируется признак, не влияющий на жизнеспособность организма, то носители доминантного признака могут быть как гомо-, так и гетерозиготами. В случае доминантного наследования какого-то патологического признака (заболевания) гомозиготы, как правило, нежизнеспособны, а носители этого признака — гетерозиготы.

Таким образом, при аутосомно-доминантном наследовании признак может встречаться в равной мере у мужчин и у женщин и прослеживается при достаточном по численности потомстве в каждом поколении по вертикали. Анализируя родословные, необходимо помнить о возможности неполного пенетрирования доминантного аллеля, обусловленной взаимодействием генов или факторами среды. Показатель пенетрантности может быть вычислен как отношение фактического числа носителей признака к числу ожидаемых носителей этого признака в данной семье. Необходимо также помнить, что некоторые заболевания проявляются не сразу с момента рождения ребенка. Многие болезни, наследуемые по доминантному типу, развиваются лишь в определенном возрасте. Так, хорея Гентингтона клинически проявляется к 35—40 годам, поздно проявляется и поликистоз почек. Поэтому при прогнозировании подобных заболеваний в расчет не принимаются братья и сестры, не достигшие критического возраста.

Первое описание родословной с аутосомно-доминантным типом наследования аномалии у человека было дано в 1905 г. В ней прослеживается передача в ряду поколений брахидактилии (короткопалости). На рис. 6.26 приведена родословная с этой аномалией. На рис. 6.27 изображена родословная с ретинобластомой в случае неполной пенетрантности.

Родословные при аутосомно-рецессивном наследовании. Рецессивные признаки проявляются фенотипически лишь у гомозигот по рецессивным аллелям. Эти признаки, как правило, обнаруживаются у потомков фенотипически нормальных родителей — носителей рецессивных аллелей. Вероятность появления рецессивного потомства в этом случае равна 25%. Если один из родителей имеет рецессивный признак, то вероятность проявления его в потомстве будет зависеть от генотипа другого родителя. У рецессивных родителей все потомство унаследует соответствующий рецессивный признак (рис. 6.28).

Рис. 6.26. Родословная (А) при аутосомно-доминантном типе наследования (брахидактилия — Б)

Для родословных при аутосомно-рецессивном типе наследования характерно, что признак проявляется далеко не в каждом поколении. Чаще всего рецессивное потомство появляется у родителей с доминантным признаком, причем вероятность появления такого потомства возрастает в близкородственных браках, где оба родителя могут являться носителями одного и того же рецессивного аллеля, полученного от общего предка. Примером аутосомно-рецессивного наследования является родословная семьи с псевдогипертрофической прогрессивной миопатией, в которой часты близкородственные браки (рис. 6.29). Обращает внимание распространение заболевания в последнем поколении по горизонтали.

Рис. 6.27. Родословная с ретинобластомой в случае неполной пенетрантности


Рис. 6.28. Вероятность появления потомков с рецессивным признаком

от различных супружеских пар (I—IV)
Родословные при доминантном Х-сцепленном наследовании признака. Гены, расположенные в Х-хромосоме и не имеющие аллелей в Y-хромосоме, представлены в генотипах мужчин и женщин в разных дозах. Женщина получает две свои Х-хромосомы и соответствующие гены как от отца, так и от матери, а мужчина наследует свою единственную Х-хромосому только от матери. Развитие соответствующего признака у мужчин определяется единственным аллелем, присутствующим в его генотипе, а у женщин он является результатом взаимодействия двух аллельных генов. В связи с этим признаки, наследуемые по Х-сцепленному типу, встречаются в популяции с разной вероятностью у мужского и женского пола.

При доминантном Х-сцепленном наследовании признак чаще встречается у женщин в связи с большей возможностью получения ими соответствующего аллеля либо от отца, либо от матери. Мужчины могут наследовать этот признак только от матери. Женщины с доминантным признаком передают его в равной степени дочерям и сыновьям, а мужчины — только дочерям. Сыновья никогда не наследуют от отцов доминантного Х-сцепленного признака.

Рис. 6.29. Родословная при аутосомно-рецессивном типе наследования (псевдогипертрофическая прогрессирующая миопатия)
Примером такого типа наследования служит описанная в 1925 г. родословная с фолликулярным кератозом —кожным заболеванием, сопровождающимся потерей ресниц, бровей, волос на голове (рис. 6.30). Характерным является более тяжелое течение заболевания у гемизиготных мужчин, чем у женщин, которые чаще всего являются гетерозиготами.

При некоторых заболеваниях наблюдается гибель мужчин-гемизигот на ранних стадиях онтогенеза. Тогда в родословных среди пораженных должны быть только женщины, в потомстве которых отношение пораженных дочерей, здоровых дочерей и здоровых сыновей равно 1:1:1. Мужские доминантные гемизиготы, не погибающие на очень ранних стадиях развития, обнаруживаются в самопроизвольных абортах или среди мертворожденных. Такими особенностями наследования у человека характеризуется пигментный дерматоз.

Родословные при рецессивном Х-сцепленном наследовании признаков. Характерной особенностью родословных при данном типе наследования является преимущественное проявление признака у гемизиготных мужчин, которые наследуют его от матерей с доминантным фенотипом, являющихся носительницами рецессивного аллеля. Как правило, признак наследуется мужчинами через поколение от деда по материнской линии к внуку. У женщин он проявляется лишь в гомозиготном состоянии, вероятность чего возрастает при близкородственных браках.

Наиболее известным примером рецессивного Х-сцепленного наследования является гемофилия. Наследование гемофилии типа А представлено в родословной потомков английской королевы Виктории (рис. 6.31).


Рис. 6.30. Родословная при Х-сцепленном доминантном типе наследования (фолликулярный кератоз)

Рис. 6.31. Родословная при Х-сцепленном рецессивном типе наследования (гемофилия типа А)
Другим примером наследования по данному типу является дальтонизм — определенная форма нарушения цветоощущения.

Родословные при Y-сцепленном наследовании. Наличие Y-хромосомы только у представителей мужского пола объясняет особенности Y-сцепленного, или голандриче-ского, наследования признака, который обнаруживается лишь у мужчин и передается по мужской линии из поколения в поколение от отца к сыну.


Рис. 6.32. Родословная при Y-сцепленном (голандрическом) типе наследования
Одним из признаков, Y-сцепленное наследование которого у человека все еще обсуждается, является гипертрихоз ушной раковины, или наличие волос на внешнем крае ушной раковины. Предполагают, что в коротком плече Y-хромосомы кроме этого гена находятся гены, определяющие мужской пол. В 1955 г. у мыши описан определяемый Y-хромосомой трансплантационный антиген, названный HY. Возможно, он является одним из факторов половой дифференцировки мужских гонад, клетки которых имеют рецепторы, связывающие этот антиген. Связанный с рецептором антиген активизирует развитие гонады по мужскому типу (см. разд. 3.6.5.2; 6.1.2). Этот антиген в процессе эволюции остался почти неизменным и встречается в организме многих видов животных, в том числе и человека. Таким образом, наследование способности к развитию гонад по мужскому типу определяется голандрическим геном, расположенным в Y-хромосоме (рис. 6.32).

6.4.3.2. Близнецовый метод

Этот метод заключается в изучении закономерностей наследования признаков в парах одно- и двуяйцевых близнецов. Он предложен в 1875 г. Гальтоном первоначально для оценки роли наследственности и среды в развитии психических свойств человека. В настоящее время этот метод широко применяют в изучении наследственности и изменчивости у человека для определения соотносительной роли наследственности и среды в формировании различных признаков, как нормальных, так и патологических. Он позволяет выявить наследственный характер признака, определить пенетрантность аллеля, оценить эффективность действия на организм некоторых внешних факторов (лекарственных препаратов, обучения, воспитания).

Суть метода заключается в сравнении проявления признака в разных группах близнецов при учете сходства или различия их генотипов. Монозиготные близнецы, развивающиеся из одной оплодотворенной яйцеклетки, генетически идентичны, так как имеют 100% общих генов. Поэтому среди монозиготных близнецов наблюдается высокий процент конкордантных пар, в которых признак развивается у обоих близнецов. Сравнение монозиготных близнецов, воспитывающихся в разных условиях постэмбрионального периода, позволяет выявить признаки, в формировании которых существенная роль принадлежит факторам среды. По этим признакам между близнецами наблюдается дискордантность, т.е. различия. Напротив, сохранение сходства между близнецами, несмотря на различия условий их существования, свидетельствует о наследственной обусловленности признака.

Сопоставление парной конкордантности по данному признаку у генетически идентичных монозиготных и дизиготных близнецов, которые имеют в среднем около 50% общих генов, дает возможность более объективно судить о роли генотипа в формировании признака. Высокая конкордантность в парах монозиготных близнецов и существенно более низкая конкордантность в парах дизиготных близнецов свидетельствуют о значении наследственных различий в этих парах для определения признака. Сходство показателя конкордантности у моно- и дизиготных близнецов свидетельствует о незначительной роли генетических различий и определяющей роли среды в формировании признака или развития заболевания. Достоверно различающиеся, но достаточно низкие показатели конкордантности в обеих группах близнецов дают возможность судить о наследственной предрасположенности к формированию признака, развивающегося под действием факторов среды.

Установление соотносительной роли наследственности и среды в развитии различных патологических состояний позволяет врачу правильно оценить ситуацию и проводить профилактические мероприятия при наследственной предрасположенности к заболеванию или осуществлять вспомогательную терапию при его наследственной обусловленности.

Трудности близнецового метода связаны, во-первых, с относительно низкой частотой рождения близнецов в популяции (1:86—1:88), что осложняет подбор достаточного количества пар с данным признаком; во-вторых, с идентификацией монозиготности близнецов, что имеет большое значение для получения достоверных выводов.

Для идентификации монозиготности близнецов применяют ряд методов. 1. Полисимптомный метод сравнения близнецов по многим морфологическим признакам (пигментации глаз, волос, кожи, форме волос и особенностям волосяного покрова на голове и теле, форме ушей, носа, губ, ногтей, тела, пальцевым узорам). 2. Методы, основанные на иммунологической идентичности близнецов по эритроцитарным антигенам (системы АВО, MN, резусу), по сывороточным белкам (γ-глобулину). 3. Наиболее достоверный критерий монозиготности предоставляет трансплантационный тест с применением перекрестной пересадки кожи близнецов.

Несмотря на трудоемкость близнецового метода и возможность ошибок при определении монозиготности близнецов, высокая объективность выводов делает его одним из широко применяемых методов генетических исследований у человека.

6.4.3.3. Популяционно-статистический метод

С помощью популяционно-статистического метода изучают наследственные признаки в больших группах населения, в одном или нескольких поколениях. Существенным моментом при использовании этого метода является статистическая обработка получаемых данных. Этим методом можно рассчитать частоту встречаемости в популяции различных аллелей гена и разных генотипов по этим аллелям, выяснить распространение в ней различных наследственных признаков, в том числе заболеваний. Он позволяет изучать мутационный процесс, роль наследственности и среды в формировании фенотипического полиморфизма человека по нормальным признакам, а также в возникновении болезней, особенно с наследственной предрасположенностью. Этот метод используют и для выяснения значения генетических факторов в антропогенезе, в частности в расообразовании.

При статистической обработке материала, получаемого при обследовании группы населения по интересующему исследователя признаку, основой для выяснения генетической структуры популяции является закон генетического равновесия Харди — Вайнберга. Он отражает закономерность, в соответствии с которой при определенных условиях соотношение аллелей генов и генотипов в генофонде популяции сохраняется неизменным в ряду поколений этой популяции (см. разд. 10.2.3, т.2). На основании этого закона, имея данные о частоте встречаемости в популяции рецессивного фенотипа, обладающего гомозиготным генотипом (аа), можно рассчитать частоту встречаемости указанного аллеля (а) в генофонде данного поколения. Распространив эти сведения на ближайшие поколения, можно предсказать частоту появления в них людей с рецессивным признаком, а также гетерозиготных носителей рецессивного аллеля.

Математическим выражением закона Харди — Вайнберга служит формула (рА. + qa)², где р и q — частоты встречаемости аллелей А и а соответствующего гена. Раскрытие этой формулы дает возможность рассчитать частоту встречаемости людей с разным генотипом и в первую очередь гетерозигот — носителей скрытого рецессивного аллеля: p²AA + 2pqAa + q²аа. Например, альбинизм обусловлен отсутствием фермента, участвующего в образовании пигмента меланина и является наследственным рецессивным признаком. Частота встречаемости в популяции альбиносов (аа) равна 1:20 000. Следовательно, q² = 1/20 000, тогда q = 1/141, up = 140/141. В соответствии с формулой закона Харди — Вайнберга частота встречаемости гетерозигот = 2pq,т.е. соответствует 2 х (1/141) х (140/141) = 280/20000 = 1/70. Это означает, что в данной популяции гетерозиготные носители аллеля альбинизма встречаются с частотой один на 70 человек.

Анализ частот встречаемости разных признаков в популяции в случае их соответствия закону Харди — Вайнберга позволяет утверждать, что признаки обусловлены разными аллелями одного гена. Так, например, установлено, что в США 29,16% белого населения имеют группу крови М, 49,58%—группу MN, 21,26%—группу N. Эти частоты разных фенотипов соответствуют формуле p²М + 2pqMN + q²N. Следовательно, эти три варианта признака обусловлены сочетанием двух аллелей одного гена, взаимодействующих по типу кодоминирования: группа М — L^mL^m, группа N — LⁿLⁿ, группа MN—L^mLⁿ.

В том случае, если ген в генофонде популяции представлен несколькими аллелями, например ген группы крови системы АВО, соотношение различных генотипов выражается формулой (pI^A + qI^B + rI⁰) ².

6.4.3.4. Методы дерматоглифики и пальмоскопии

В 1892 г. Ф. Гальтоном в качестве одного из методов исследования человека был предложен метод изучения кожных гребешковых узоров пальцев и ладоней, а также сгибательных ладонных борозд. Он установил, что указанные узоры являются индивидуальной характеристикой человека и не изменяются в течение его жизни. Ф. Гальтон уточнил и дополнил классификацию рельефа кожных узоров, основы которой были разработаны Я. Пуркинье еще в 1823 г. Позднее классификацию Гальтона усовершенствовали ряд ученых; она и сейчас широко используется в криминалистике и генетических исследованиях.

В настоящее время установлена наследственная обусловленность кожных узоров, хотя характер наследования окончательно не выяснен. Вероятно, этот признак наследуется по полигенному типу. На характер пальцевого и ладонного узоров организма большое влияние оказывает мать через механизм цитоплазматической наследственности.

Дерматоглифические исследования важны при идентификации зиготности близнецов. Считают, что если из 10 пар гомологичных пальцев не менее 7 имеют сходные узоры, это указывает на однояйцевость. Сходство узоров лишь 4—5 пальцев свидетельствует в пользу разнояйцевости близнецов.

Изучение людей с хромосомными болезнями выявило у них специфические изменения не только рисунков пальцев и ладоней, но и характера основных сгибательных борозд на коже ладоней. Характерные изменения этих показателей наблюдаются при болезни Дауна, при синдромах Клайнфельтера, Шерешевского — Тернера, что позволяет использовать методы дерматоглифики и пальмоскопии в диагностике этих заболеваний. Определяются специфические Дерматоглифические изменения и при некоторых хромосомных аберрациях, например при синдроме «кошачьего крика». Менее изучены Дерматоглифические изменения при генных болезнях. Однако описаны специфические отклонения этих показателей при шизофрении, миастении, лимфоид-ной лейкемии.

Применяют эти методы и с целью установления отцовства. Подробнее они описаны в специальной литературе.

6.4.3.5. Методы генетики соматических клеток

С помощью этих методов изучают наследственность и изменчивость соматических клеток, что в значительной мере компенсирует невозможность применения к человеку метода гибридологического анализа.

Методы генетики соматических клеток, основанные на размножении этих клеток в искусственных условиях, позволяют не только анализировать генетические процессы в отдельных клетках организма, но благодаря полноценности наследственного материала, заключенного в них, использовать их для изучения генетических закономерностей целостного организма.

В связи с разработкой в 60-х гг. XX в. методов генетики соматических клеток человек оказался включенным в группу объектов экспериментальной генетики. Благодаря быстрому размножению на питательных средах соматические клетки могут быть получены в количествах, необходимых для анализа. Они успешно клонируются, давая генетически идентичное потомство. Разные клетки могут, сливаясь, образовывать гибридные клоны. Они легко подвергаются селекции на специальных питательных средах и долго сохраняются при глубоком замораживании. Все это позволяет использовать культуры соматических клеток, полученные из материала биопсий (периферическая кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбрионов, клетки из околоплодной жидкости), для генетических исследований человека, в которых используют следующие приемы: 1) простое культивирование, 2) клонирование, 3) селекцию, 4) гибридизацию.

Культивирование позволяет получить достаточное количество клеточного материала для цитогенетических, биохимических, иммунологических и других исследований.

Планирование—получение потомков одной клетки; дает возможность проводить в генетически идентичных клетках биохимический анализ наследственно обусловленных процессов.

Селекция соматических клеток с помощью искусственных сред используется для отбора мутантных клеток с определенными свойствами и других клеток с интересующими исследователя характеристиками.

Гибридизация соматических клеток основана на слиянии совместно культивируемых клеток разных типов, образующих гибридные клетки со свойствами обоих родительских видов. Для гибридизации могут использоваться клетки от разных людей, а также от человека и других животных (мыши, крысы, морской свинки, обезьяны, джунгарского хомячка, курицы).

Гибридные клетки, содержащие два полных генома, при делении обычно «теряют» хромосомы предпочтительно одного из видов. Например, в гибридных клетках «человек — мышь» постепенно утрачиваются все хромосомы человека, а в клетках «человек — крыса» — все, кроме одной, хромосомы крысы, с сохранением всех хромосом человека. Таким образом можно получать клетки с желаемым набором хромосом, что дает возможность изучать сцепление генов и их локализацию в определенных хромосомах.

Постепенная потеря хромосом человека из гибридных клеток параллельно с изучением ферментов дает возможность судить о локализации гена, контролирующего синтез данного фермента, в определенной хромосоме.

Благодаря методам генетики соматических клеток можно изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Они позволяют судить о генетической гетерогенности наследственных болезней, изучать их патогенез на биохимическом и клеточном уровнях. Развитие этих методов определило возможность точной диагностики наследственных болезней в пренатальном периоде.

6.4.3.6. Цитогенетичвский метод

Цитогенетический метод основан на микроскопическом изучении хромосом в клетках человека. Его стали широко применять в исследованиях генетики человека с 1956 г., когда шведские ученые Дж. Тийо и А. Леван, предложив новую методику изучения хромосом, установили, что в кариотипе человека 46, а не 48 хромосом, как считали ранее.

Современный этап в применении цитогенетического метода связан с разработанным в 1969 г. Т. Касперсоном методом дифференциальногоокрашивания хромосом, который расширил -возможности цитогенетического анализа, позволив точно идентифицировать хромосомы по характеру распределения в них окрашиваемых сегментов (см. разд. 3.5.2.3).

Применение цитогенетического метода позволяет не только изучать нормальную морфологию хромосом и кариотипа в целом, определять генетический пол организма, но, главное, диагностировать различные хромосомные болезни, связанные с изменением числа хромосом или с нарушением их структуры. Кроме того, этот метод позволяет изучать процессы мутагенеза на уровне хромосом и кариотипа. Применение его в медико-генетическом консультировании для целей пренатальной диагностики хромосомных болезней дает возможность путем своевременного прерывания беременности предупредить появление потомства с грубыми нарушениями развития.

Материалом для цитогенетических исследований служат клетки человека, получаемые из разных тканей,—лимфоциты периферической крови, клетки костного мозга, фибробласты, клетки опухолей и эмбриональных тканей и др. Непременным требованием для изучения хромосом является наличие делящихся клеток. Непосредственное получение таких клеток из организма затруднено, поэтому чаще используют легкодоступный материал, каковым являются лимфоциты периферической крови.

В норме эти клетки не делятся, однако специальная обработка их культуры фитогемагглютинином возвращает их в митотический цикл. Накопление делящихся клеток в стадии метафазы, когда хромосомы максимально спирализованы и хорошо видны в микроскоп, достигается обработкой культуры колхицином или колцемидом, разрушающим веретено деления и препятствующим расхождению хроматид.

Микроскопирование мазков, приготовленных из культуры таких клеток, позволяет визуально наблюдать хромосомы. Фотографирование метафазных пластинок и последующая обработка фотографий с составлением кариограмм, в которых хромосомы выстроены парами и распределены по группам, позволяют установить общее число хромосом и обнаружить изменения их количества и структуры в отдельных парах (рис. 6.33). Кариотипы человека при некоторых хромосомных болезнях представлены на рис. 4.3—4.12.


Рис. 6.33. Нормальные кариотипы человка. А —женщины; Б —мужчины Вверху представлены хромосомные комплексы, внизу — кариограммы
В качестве экспресс-метода, выявляющего изменение числа половых хромосом, используют метод определения полового хроматина в неделящихся клетках слизистой оболочки щеки. Половой хроматин, или тельце Барра, образуется в клетках женского организма одной из двух Х-хромосом. Оно выглядит как интенсивно окрашенная глыбка, расположенная у ядерной оболочки (см. рис. 3.77). При увеличении количества Х-хромосом в кариотипе организма в его клетках образуются тельца Барра в количестве на единицу меньше числа Х-хромосом. При уменьшении числа Х-хромосом (моносомия X) тельце Барра отсутствует.

В мужском кариотипе Y-хромосома может быть обнаружена по более интенсивной по сравнению с другими хромосомами люминесценции при обработке их акрихинипритом и изучении в ультрафиолетовом свете.

6.4.3.7. Биохимический метод

В отличие от цитогенетического метода, который позволяет изучать структуру хромосом и кариотипа в норме и диагностировать наследственные болезни, связанные с изменением их числа и нарушением организации, наследственные заболевания, обусловленные генными мутациями, а также полиморфизм по нормальным первичным продуктам генов изучают с помощью биохимических методов.

Впервые эти методы стали применять для диагностики генных болезней еще в начале XX в. В последние 30 лет их широко используют в поиске новых форм мутантных аллелей. С их помощью описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Для многих из них выявлен дефект первичного генного продукта. Наиболее распространенными среди таких заболеваний являются болезни, связанные с дефектностью ферментов, структурных, транспортных или иных белков.

Дефекты структурных и циркулирующих белков выявляются при изучении их строения. Так, в 60-х гг. XX в. был завершен анализ (3-глобино-вой цепи гемоглобина, состоящей из 146 аминокислотных остатков. Установлено большое разнообразие гемоглобинов у человека, связанное с изменением структуры его пептидных цепей, что нередко является причиной развития заболеваний (см. § 4.1).

Дефекты ферментов устанавливают путем определения содержания в крови и моче продуктов метаболизма, являющихся результатом функционирования данного белка. Дефицит конечного продукта, сопровождающийся накоплением промежуточных и побочных продуктов нарушенного метаболизма, свидетельствует о дефекте фермента или его дефиците в организме (см. § 4.1).

Биохимическую диагностику наследственных нарушений обмена проводят в два этапа. На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором —более точными и сложными методами уточняют диагноз заболевания. Применение биохимических исследований для диагностики заболеваний в пренатальном периоде или непосредственно после рождения позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия, как, например, в случае фенилкетонурии.

Для определения содержания в крови, моче или амниотической жидкости промежуточных, побочных и конечных продуктов обмена кроме качественных реакций со специфическими реактивами на определенные вещества используют хроматографические методы исследования аминокислот и других соединений.

6.4.3.8. Методы изучения ДНК в генетических исследованиях

Как было показано выше, нарушения первичных продуктов генов выявляются с помощью биохимических методов. Локализация соответствующих повреждений в самом наследственном материале может быть выявлена методами молекулярной генетики.

Разработка метода обратной транскрипции ДНК на молекулах мРНК определенных белков с последующим размножением этих ДНК привела к появлению ДНК-зондов для различных мутаций нуклеотидных последовательностей человека. Использование таких ДНК-зондов для гибридизации с ДНК клеток пациента дает возможность выявлять у него соответствующие изменения в наследственном материале, т.е. диагностировать определенные виды генных мутаций (генодиагностика).

Важными достижениями молекулярной генетики последних десятилетий явились работы по секвенированию — определению нуклеотидной последовательности ДНК.
Это стало возможным благодаря открытию в 60-х гг. XX в. ферментов — рестриктаз, выделенных из бактериальных клеток, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах. В естественных условиях рестрикгазы защищают клетку от проникновения в ее генетический аппарат и размножения в нем чужеродной ДНК. Применение этих ферментов в эксперименте дает возможность получать короткие фрагменты ДНК, в которых относительно легко можно определить последовательность нуклеотидов.
В настоящее время полностью установлена последовательность нуклеотидов многих генов человеческого генома, в том числе генов α- и (β-глобиновых цепей гемоглобина, некоторых полипептидных гормонов (инсулина, гормона роста, хорионического соматотропина, пролактина). Интенсивно изучаются нуклеотидные последовательности генов актинов, тубулинов, интерферонов. Этими исследованиями выявлена высокая степень генетического полиморфизма у человека, который часто не проявляется фенотипически.

Методы молекулярной генетики и генной инженерии позволяют не только диагностировать целый ряд генных мутаций и устанавливать нуклеотидную последовательность отдельных генов человека, но и размножать (клонировать) их и получать в большом количестве белки — продукты соответствующих генов.
Клонирование отдельных фрагментов ДНК осуществляется путем включения их в бактериальные плазмиды, которые, автономно размножаясь в клетке, обеспечивают получение в большом количестве копий соответствующих фрагментов ДНК человека. Последующая экспрессия рекомбинантных ДНК в бактериях позволяет получить белковый продукт соответствующего клонированного человеческого гена.

Таким образом, с помощью методов генной инженерии стало возможно получать на основе человеческих генов некоторые первичные генные продукты (инсулин). Это определяет перспективы терапии наследственных болезней, обусловленных связанным с генными мутациями дефицитом нормальных продуктов генов.

Дальнейшее совершенствование методов молекулярной генетики обеспечит возможность полного определения нуклеотидных последовательностей не только структурных, но и регуляторных локусов генома человека, а разработка методов включения в человеческий геном нормальных нуклеотидных последовательностей в перспективе может стать основой генотерапии.

6.4.4. Пренатальная диагностика наследственных заболеваний

Разработка методов генетики соматических клеток, молекулярной биологии, цитогенетических и биохимических методов сделала возможным получение, размножение и всестороннее изучение клеточного материала развивающегося плода с целью более ранней диагностики наследственной патологии у человека. В связи с отсутствием в настоящее время действенных методов лечения, тяжелым поражением здоровья при многих наследственных заболеваниях их ранняя диагностика дает возможность предупредить появление потомства с наследственным нарушением путем прерывания беременности, а иногда начать лечение сразу после рождения или даже в пренатальном периоде.

Получение материала развивающегося внутриутробно организма осуществляют разными способами. Одним из них является амниоцентез, с помощью которого на 15—16-й неделе беременности получают амниотическую жидкость, содержащую продукты жизнедеятельности плода и клетки его кожи и слизистых (рис. 6.34, А).

Забираемый при амниоцентезе материал используют для биохимических, цитогенетических и молекулярно-биологических исследований. Цитогенетическими методами определяют пол плода и выявляют хромосомные и геномные мутации. Изучение амниотической жидкости и клеток плода с помощью биохимических методов позволяет обнаружить дефект белковых продуктов генов, однако не дает возможности определять локализацию мутаций в структурной или регуляторной части генома. Важную роль в выявлении наследственных заболеваний и точной локализации повреждения наследственного материала плода играет использование ДНК-зондов.

Рис. 6.34. Методы получения материала для пренатальной диагностики. А —амниоцентез (пункция околоплодного пузыря через брюшную стенку); Б—биопсия ворсин хориона (проникновение в матку через влагалище и шейку матки):
1—амниотическая жидкость, 2—плацента, 3—матка, 4—лобковое сращение, 5— влагалище, б—шейка, 7—крестец, 8—зеркало, 9—канюля, 10—хорион

В настоящее время с помощью амниоцентеза диагностируются все хромосомные аномалии, свыше 60 наследственных болезней обмена веществ, несовместимость матери и плода по эритроцитарным антигенам.

С начала 80-х гг. XX в. стало возможным использование для целей медикогенетического диагностирования материала биопсии ворсин хориона. В отличие от амниоцентеза это исследование проводят в первой трети беременности, что позволяет при наличии показаний прерывать ее в более ранние сроки (рис. 6.34, Б).

Кроме амниоцентеза и исследования клеток ворсин хориона применяют и другие способы пренатальной диагностики. Для диагностики таких заболеваний, какгемоглобинопатия, используют пункцию сосудов плода с получением клеток его крови.

Методы фетоскопии и ультразвуковых исследований позволяют определять пол плода и некоторые пороки его развития путем непосредственного наблюдения.

Пренатальная диагностика должна проводиться до 20—22-й недели беременности, когда плод еще нежизнеспособен после ее прерывания. Прерывание беременности в более поздние сроки может привести к рождению живого ребенка и быть опасным для организма матери. Прерывание беременности всегда проводится только с согласия родителей.

Так как многие методы пренатального обследования плода не являются абсолютно безвредными, а кроме того, они трудоемки и дорогостоящи, показания к такому обследованию должны быть обоснованы.

Пренатальное обследование плода проводят в случаях: 1) обнаружения структурных перестроек хромосом (транслокаций) у одного из родителей; 2) при наличии у родителей доминантного наследственного заболевания; 3) при наличии в семье детей с рецессивным наследственным заболеванием, что свидетельствует о гетерозиготности родителей; 4) при возрасте матери старше 35 лет, что прогрессивно повышает вероятность рождения у нее потомства с наследственной патологией; 5) при привычных выкидышах, вызывающих подозрение на несовместимость матери и плода по эритроцитарным антигенам; 6) при наличии в семье детей с врожденными пороками развития.

Благодаря разработке способов пренатальной диагностики удается сократить число рождающихся с наследственными заболеваниями.

6.4.5. Медико-генетическое консультирование

Для подавляющего большинства наследственных болезней эффективных способов лечения не существует. Из этого следует, что в борьбе с наследственной патологией основная роль отводится профилактике рождения аномального потомства. Общий профилактический характер носят мероприятия, направленные на оздоровление окружающей среды, способствующие снижению ее мутагенного воздействия на наследственный материал человеческого организма. В последние десятилетия распространенным и эффективным способом профилактики наследственных болезней является медико-генетическое консультирование.

Медико-генетическое консультирование — это один из видов специализированной помощи населению, направленной в первую очередь на предупреждение появления в семье детей с наследственной патологией. С этой целью составляют прогноз рождения в данной семье ребенка с наследственной болезнью, родителям объясняют вероятность этого события и оказывают помощь в принятии решения. В случае большой вероятности рождения больного ребенка родителям рекомендуют либо воздержаться от деторождения, либо провести пренатальную диагностику, если она возможна при данном виде патологии.

Консультирование семей, обращающихся к врачу-генетику, включает три основных этапа. Как правило, за консультацией обращаются семьи, где уже имеется ребенок с наследственной патологией, или семьи, в которых имеются больные родственники. На первом этапе консультирования производится уточнение диагноза, что является необходимой предпосылкой любого консультирования. Уточнение диагноза в медико-генетической консультации проводят с помощью генетического анализа. Для этой цели используют генеалогический, цитогенетический, биохимический и другие требуемые методы исследований, которым подвергаются пробанд и его родственники. Точный клинический и генетический диагноз заболевания позволяет установить степень генетического риска и выбор эффективных методов пренатальной диагностики и профилактического лечения.

На втором этапе консультирования делают прогноз потомства. Генетический риск может быть определен либо путем теоретических расчетов, основанных на генетических закономерностях, либо с помощью эмпирических данных. Сущность генетического прогноза заключается в определении вероятности появления наследственной патологии в семье. Наиболее эффективным является проспективное консультирование, когда риск рождения больного ребенка определяют до наступления беременности или в ранние ее сроки. Такие консультации чаще проводят в случае кровного родства супругов, при отягощенной наследственности по линии мужа или жены, при воздействии вредных средовых факторов на супругов незадолго до наступления беременности. Ретроспективное консультирование проводят после рождения больного ребенка относительно здоровья будущих детей.

Определение прогноза потомства при разных формах наследственной патологии различно. При моногенных, менделирующих болезнях прогноз основывается на расчете вероятности появления потомства в соответствии с генетическими закономерностями. При этом, если известен тип наследования данного заболевания и по родословной удается установить генотип родителей, оценка риска сводится к анализу мевделевского расщепления. Если у пробанда установлена вновь возникшая мутация, то повторный риск рождения ребенка с такой же патологией незначителен.

Расчет риска при моногенном заболевании может осложниться при пониженной экспрессивности или неполной пенетрантности гена, позднем проявлении генетической аномалии, генетической гетерогенности заболевания и вообще в случае неточного диагноза.

При хромосомных болезнях определение риска повторного рождения потомства с хромосомными аномалиями зависит от того, нормальны ли кариотипы родителей, не обнаружено ли у них мозаицизма, не наблюдается ли семейной формы структурных аномалий хромосом. В случае отсутствия нарушений в кариотипе родителей вероятность повторного рождения второго ребенка с хромосомной аномалией оценивается по эмпирическим данным для каждого вида аномалии с учетом возраста родителей.

При мультифакториальных заболеваниях, т.е. заболеваниях с наследственным предрасположением, основой оценки риска являются эмпирические данные о популяционной и семейной частоте каждого из них.

Специфический генетический риск до 5% принято считать низким, до 10% —повышенным в легкой степени, до 20% —средним, выше 20% — высоким. Генетический риск средней степени расценивают как противопоказание к зачатию или показание к прерыванию уже имеющейся беременности. Возможность проведения пренатальной диагностики является определяющей для принятия положительного решения в отношении завершения беременности.

На третьем этапе консультирования врач-генетик в доступной форме объясняет семье степень генетического риска рождения наследственно аномального потомства, сущность пренатальной диагностики и помогает принять правильное решение в отношении деторождения. Однако окончательное решение этого вопроса остается за родителями.

Широкое использование медико-генетического консультирования, разработка способов пренатальной диагностики наследственных заболеваний позволяют существенно уменьшить вероятность появления потомства с наследственной патологией в отдельных семьях.