Лекция. Краткий курс лекций по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии Часть вторая. Общая микробиология
 Скачать 1.51 Mb.
|
|
постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов. количество время Культуральные свойства бактерий. К культуральным свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на искусственных питательных средах. Характер роста зависит от питательной среды и особенностей бактерий. При росте на жидких питательных средах характер роста во многом зависит от типа дыхания. Рост бактерий с равномерным помутнением среды, что характерно для факультативных анаэробов. Степень помутнения может быть слабая, умеренная, сильная. Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка: скудного, обильного, рыхлого, слизистого, хлопьевидного, зернистого. Питательная среда может быть прозрачной или мутной. 4 3 2 1 13 Пристеночный рост - образование зерен, рыхлых хлопьев на внутренней поверхности стенок сосуда. Питательная среда при этом остается прозрачной. Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности среды пленки. Ее внешний вид может быть различен: тонкая, плотная, рыхлая, гладкая, складчатая, влажная, сухая, кольцеобразная, сплошная. Такой рост наблюдается при культивировании аэробных бактерий. Некоторые бактерии дают характерный вид плёнки: сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую, нежную (холерный вибрион), рыхлую, с отходящими вниз отростками — «сталактитами» (возбудитель чумы). В каждом случае цвет среды может окрашиваться в цвет водорастворимого пигмента, который образуют бактерии. 1. Облигатные аэробные 2. Облигатные анаэробные 3. Факультативные 4. Микроаэрофилы 5. Аэротолерантные. На полужидких питательных средах. Подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду. Еще более разнообразен рост бактерий на плотных питательных средах. Для того чтобы учесть культуральные свойства микроорганизмов на плотной питательной среде, необходимо получить рост в виде изолированных колоний. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием, они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ. Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну. При описании поверхностных колоний учитывают следующие признаки: размер (диаметр) колонии - точечные (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-1 мм), средние (2-4 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре); форму колонии - правильная округлая, неправильная амебовидная, ризоидная и т.д.; 14 Форма колоний: а – круглая; б – круглая с фестончатым краем;в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем;ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная; л – концентрическая; м – сложная поверхность колонии – определяется по трем характеристикам : гладкая, влажная, блестящая – S- форма шероховатая (складчатая, морщинистая), сухая, матовая - R- форма Встречаются также колонии с концентрическими кругами или радиально исчерченные; рельеф (профиль) колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, стелющийся, каплевидный, типа «ватрушки», кратерообразный и т.д.; Профиль колоний: а – изогнутый; б – кратерообразный; в – бугристый; г – врастающий в агар; д – плоский; е –выпуклый;ж – каплевидный; з - конусовидный край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д. 15 Край колоний: а - гладкий; б – волнистый; в – зубчатый;г – лопастный; д – неправильный; е – реснитчатый; ж – нитчатый; з – ворсинчатый; и - ветвистый структура колонии - однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая, нитевидная. Хорошо определяется у прозрачных колоний. Рельеф, край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз. консистенция колонии - определяют при взятии культуры петлей, колония может быть, мягкой, пастообразной (легко снимается петлёй), плотной врастающей в агар ( трудно взять), слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей). цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием; 16 Лекция 3 Ферменты и их роль в жизнедеятельности бактерий Ферменты бактерий. Микроорганизмы синтезируют различные ферменты - специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов. 1. Оксидоредуктазы - катализируют окислительно- восстановительные реакции. 2. Трансферазы - осуществляют реакции переноса групп атомов. 3. Гидролазы - осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений. 4. Лиазы - катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям. 5. Лигазы или синтетазы - обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата. 6. Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов. По строению выделяют: 1) простые ферменты (белки); 2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов. В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий различают также: 1) конститутивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата); 2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата). 3) адаптивные ферменты (образуются только при определённых условиях) Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства, что используется для дифференциации микроорганизмов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов: 1.Сахаролитические. 2.Протеолитические. 3.Аутолитические. 4.Окислительно - восстановительные. 17 5.Ферменты патогенности (вирулентности). Основные ферменты вирулентности - гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза, фибринолизин. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии. 6. Липолитические. Биохимические свойства бактерий в соответствии с набором ферментов: сахаролитические –расщепление углеводов; протеолитические – расщепление белков, липолитические – расщепление жиров и т.д. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и в некоторых случаях для вида. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксиредуктаз, используя специальные методы и среды. Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. После инкубации посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты - индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку. Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2 - 6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом». Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара. Для того чтобы определить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный при более низких значениях рН. Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды. При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса - Проскауэра на ацетон — промежуточное соединение при образовании бутандиола из 18 пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода. Для определения цитохромоксидазы применяют реактивы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидро-хлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2-5 мин. Для определения нитритов используют реактив Грисса: Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов. По месту действия выделяют: 1) экзоферменты (действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий); Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов являются ферментами агрессии. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред. 2) эндоферменты (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ). Токсины Это микробные яды, которые вырабатываются патогенными бактериями. По биологическим свойствам делятся на две группы: 1. эндотоксины – вырабатываются Гр (-) микроорганизмами, тесно связанны с телом микробной клетки, поэтому накапливаются в нутрии её, во внешнюю среду попадают только после гибели бактерии. По своей химической структуре являются липополисахаридами. Эндотоксины не обладают специфичностью, термостабильны, менее токсичны, обладают слабой иммуногенностью. При поступлении в организм больших доз эндотоксины угнетают фагоцитоз, гранулоцитоз, моноцитоз, увеличивают проницаемость капилляров, оказывают разрушающее действие на клетки, оказывают общеотравляющее действие. Обезвреживаются только частично. 2. экзотоксины – вырабатываются как Гр (+) так и Гр (-) микроорганизмами, по мере накопления в процессе жизнедеятельности бактериальной клеткой такие токсины выделяются во внешнюю среду. По степени связи с бактериальной клеткой экзотоксины делятся условно на три класса. • Класс А - токсины, секретируемые во внешнюю среду; 19 • Класс В - токсины частично секретируемые и частично связанные с микробной клеткой; • Класс С - токсины, связанные и с микробной клеткой и попадающие в окружающую среду при разрушении клетки. По своей химической структуре это белки. По молекулярной организации экзотоксины делятся на две группы: • экзотоксины, состоящие из двух фрагментов; • экзотоксины, составляющие единую полипептидную цепь. По механизму действия экзотоксина на клетку различают несколько типов: цитотоксины, мембранотоксины, функциональные блокаторы, эксфолиатины и эритрогемины. Механизм действия белковых токсинов сводится к повреждению жизненно важных процессов в клетке: повышение проницаемости мембран, блокады синтеза белка и других биохимических процессов в клетке или нарушении взаимодействия и взаимокоординации между клетками. Экзотоксины являются сильными антигенами, на которые образуются в организме антитела. Они высокотоксичны, оказывают избирательное токсическое действие на определенные органы и ткани. Анатоксин – это обезвреженный экзотоксин, то есть потерявший свои токсические свойства, но сохранивший антигенные. Их используют в качестве вакцин. Пигменты бактерий. Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Пигменты – красящие вещества, различающиеся по цвету, химическому составу (химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды , антоцианы, меланины) и растворимости ( растворимые в воде, растворимые в органических растворителях и нерастворимые). Если пигменты нерастворимы в воде, окрашивается только колонии микроба, растущая на питательной среде, а если растворимы - окрашивается и питательная среда. Пигмент образуется на свету, при комнатной температуре и хорошем доступе кислорода. Цвет пигмента используется в качестве теста для идентификации пигментообразующих бактерий. Пигменты обеспечивают: защиту от УФ радиации участвуют в реакциях синтеза обладают антибиотическим действием. участвуют в процессе дыхания. Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров ( уксусноэтилового , уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты. В природе существуют, и так называемые, фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются, главным образом, в речной или морской воде. Фосфоресценция (люминесценция) продолжается иногда несколько часов и даже суток. Она представляет собой особую форму освобождения энергии возбужденных электронов. К светящимся бактериям - фотобактериям - относятся физиологически сходные, но морфологически отличающиеся аэробные бактерии (вибрионы, палочки, кокки). 20 Лекция 4 и Лекция 5 Принципы культивирования бактерий. Питательные среды. Основы приготовления питательных сред. Контроль качества. Питательная среда — вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов. Питательные среды служат основой бактериологических работ, нередко определяя своим качеством результаты исследования. Они необходимы для выделения из исследуемого материала чистых культур возбудителя и изучения их свойств ( культуральных, биохимических, подвижности и др.). Классификация питательных сред. 1.По консистенции (степени плотности): o жидкие o полужидкие o плотные Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым прибавляют уплотнители или клеевые вещества Чаще используют агар-агар или желатин. Агар-агар (по-малайски – желе) - полисахарид, продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80 - 86°С, застудневает при 36 - 40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин - вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32 - 34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество - при их росте среда разжижается. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свёрнутую сыворотку крови, свёрнутые яйца, картофель, среды с селикагелем. 2.По назначению: основные (общие) - служат для культивирования большинства патогенных микробов и являются основой для приготовления специальных сред. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода. специальные - служат для выделения и выращивания того или иного вида микроорганизмов, не растущих на простых средах. Среди специальных выделяют: элективные (избирательные) - служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов, это достигается путём добавления |