Лекция. Краткий курс лекций по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии Часть вторая. Общая микробиология
 Скачать 1.51 Mb.
|
|
факторов элективности – различных веществ : определённых антибиотиков, солей, изменения pH. Жидкие элективные среды называют средами накопления (обогащения), используются для облегчения выделения чистой культуры возбудителя в том случае, когда возбудителя заведомо мало в материале. 21 элективно – диффреренциальные – содержат элективный фактор и компаненты, позволяющие определить какой-либо дифференциальный (отличительный) признак выделенной культуры. Например: ЖСА, где повышенная концентрация соли - это элективный фактов, а желток куриного яйца позволяет определить наличие фермента лецитиназы – дифференциальный признак патогенного стафилококка. дифференциально-диагностические - позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом: · Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д. · Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами. · Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов. · Среды для определения редуцирующей способности микробов. В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка. консервирующие - предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. 3.По происхождению. Натуральные (естественные) среды - готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, костная и рыбная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.) синтетические среды - готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде. Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим промышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. 22 Их преимущества: 1. стандартность. 2. простота приготовления – рецепт на упаковке и приготовление не занимает много времени, указан режим стерилизации. Навеску, указанную на этикетке, всыпают в стеклянную колбу или бутыль с холодной дистиллированной водой. Смесь следует хорошо размешать до полного смачивания порошка водой. Затем в водяной бане или лучше в текучепаровом аппарате смесь нагревают до кипения, периодически помешивая. Кипятят до тех пор, пока порошок окончательно не растворится. Растворение на голом огне возможно, но требует большого внимания, чтобы не допустить пригорания среды. Перед разливкой следует среду хорошо перемешать. Сухие среды выпускаются основные, элективные и дифференциальные. 3. сбалансированность всех ингредиентов среды. 4. соблюдены рН и изотоничность. 5. экономичность – их делают из заменителей мяса – гидролизатов. 6. дешевизна. Сухие питательные среды следует хранить герметически закрытыми и по возможности не на свету, так как препараты гигроскопичны и светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, не содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии же в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о порче. Требования к питательным средам. 1. Содержать необходимые для питания микроорганизма вещества - быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. В состав сред, применяемых для выращивания бактерий должны входить: А. необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород – органогены. Б. минеральные соли - неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу натрий, магний, железо. В. микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Г. факторы роста, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др. 2. иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - pH, т.к. только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2-7,4). 3. Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена. 23 4. быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая физиологической концентрации NaCl. 5. плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса. Потребность в Н 2 и О 2 бактерии удовлетворяют за счет поступающей в клетку воды. 6. обладать определённым окислительно - восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH 2 . Например, анаэробы размножаются при RH 2 не выше 5, а аэробы - при RH 2 не ниже 10. 7. быть по возможности унифицированными, т.е. содержать постоянное количество отдельных ингредиентов. 8. желательно, чтобы среды были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами. 9. быть стерильными, т.к. посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды. Этапы приготовления питательных сред. 1. варка: среды варят используя сухие среды или продукты животного и растительного происхождения на газовой плите. 2. установление pH: ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор. 3. осветление производят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок куриного яйца или сыворотку крови. 4. фильтрация жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена - они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр, можно использовать воронку с подогревом. 5. разливают среды не более чем на ¾ емкости, т.к. при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность. 6. стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте. 7. контроль для контроля стерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают, если не проросли, то их используют в работе. химический контроль - окончательное устанавление pH, содержание общего и амминого азота, пептона, хлоридов. для биологического контроля (определение ростковых свойств) несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды. 24 Режимы стерилизации питательных сред. Среды Режим стерилизации Аппарат Температура, давление Время Простые среды автоклав + 120 0 С, 1 атм. 20 мин. Сложные среды с углеводами, молоком, желатином автоклав герметично автоклав негерметично + 112 0 С, 0,5 атм. + 100 0 С текучим паром 20 мин. дробно 30-60 мин. 3 дня Белковые с уплотнением водяная баня или свертыватель Коха + 80-85 0 С или + 95 0 С дробно 60 мин. 3 дня Белковые жидкие водяная баня + 56-58 0 С дробно 60 мин. 3-4 дня 25 Лекция 6. Методы выделения аэробов. Бактериологический метод: назначение, цель, этапы Бактериологический (культуральный) метод — комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Это метод выделения, выращивания и определения свойств чистой культуры микроорганизмов с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация. Выделение чистой культуры основа бактериологического метода. Чистая культура — микроорганизмы одного вида, полученные из одной или нескольких клеток в результате размножения на искусственной питательной среде. Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для санитарно-гигиенической характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования. Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания. В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование. Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме: 1-й день (I этап) . - Основная цель этого дня – произвести посев исследуемого материала таким способом и методом, чтобы получить рост изолированных колоний. 1. Макроскопическая оценка исследуемого материала (объём, цвет, характер, консистенция). От этой оценки зависит подготовка материала к посеву и выбор сред. Механический метод выделения чистой культуры используют если: Материала много и он жидкий (моча, СМЖ), то материал центрифугируют и для посева используют осадок, предварительно слив надосадочную жидкость, таким образом, посевной материал содержит все микроорганизмы исследуемого материала. Если материал вязкий ( гной, мокрота, фекалии), то небольшую порцию материала растирают со стерильным физ. раствором и полученную эмульсию используют для посева. Если материал плотный (кусочки ткани или кости), то с них делают смыв стерильным физ. раствором и засевают на среды смывы. Физический метод используют, если исследуемый материал по направлению предполагает наличие споровых культур, в таком случае часть или весь материал прогревают до + 80 0 С, при этом сопутствующая вегетативная флора погибает, а сохранившиеся споры после посева прорастают и дают чистую культуру возбудителя. Химический метод используют, если материал может предполагать наличие кислотоустойчивых бактерий, то в этом случае порцию материала обрабатывают 2-4 % раствором H 2 SO 4, а затем нейтрализуют щёлочью под контролем индикатора и используют для посева. При такой обработке погибает вся сопутствующая флора, сохраняются только кислотоустойчивые бактерии. Соответственно поступают и при наличии щёлоче- и спиртоустойчивых бактерий. Биологический метод. К этому методу относят добавление в питательную среду антибиотика, к которому устойчив предполагаемый возбудитель, этом случае гибнет под воздействием данного антибиотика вся сопутствующая флора в исследуемом материале. Также к биологическому методу относят заражение исследуемым материалом лабораторных животных, чувствительных к данному возбудителю, после чего у животного берут материал и высевают на питательные среды. 26 Метод элективных сред позволяет выделить определённого возбудителя, за счет нахождения в питательной среде элективного фактора к которому чувствительна сопутствующая флора. 2. В некоторых случаях проводят микроскопию мазка из исследуемого материала, ок- рашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой и ориентировочного ответа, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. 3. Если в исследуемом материале заведомо мало выделяемого возбудителя, то такой материал засевают на среды обогащения, в этом случае бактериологическое исследование длиться дольше на один или несколько дней. 4.Затем посев материала на питательные среды для получения изолированных колоний. Среды подбирают также исходя из особенностей предполагаемого возбудителя и характера материала. Способ посева может быть открытым или закрытым, что зависит от возможности предполагаемого возбудителя находиться в воздухе. Для того чтобы получить рост изолированных колоний можно использовать методы посева, выполненные с помощью бак. петли, шпателя, стеклянной палочки и ватного тампона : Шпатели и бак.петля. А.Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии. Метод Дригальского. Б.Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора - метод посева по секторам. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, делая посевную площадку, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во 27 второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии. Посев по секторам с посевной площадкой. Посев по секторам можно произвести и без посевной площадки. Начав с первого сектора без прокаливания петли произвести посев последовательно во втором, третьем и четвёртом секторах. Посев по секторам. В. Можно использовать и другие техники посева. Например, посев бактериологической петлёй штрихами или зигзагообразно по всей поверхности чашки Петри. Для этого исследуемый материал набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки. После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделана посевная площадка, проводят один-два раза по поверхности и делают штрихи по остальной среде. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний. Посев шпателем и тампоном в чашки Петри. Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями распределяют материал равномерно по поверхности среды. 28 5.Засеянные чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат для инкубации на 24 часа при 37 0 С. 2-й день (II этап). Начинают данный этап с изучения культуральных свойств полученных колоний. На основании изучения этих характеристик, выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью изучения морфологических и тинкториальных свойств и проверки однородности микробов в колонии (приготовление мазка, окраска по Граму). Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром с целью накопления чистой культуры. Пробирку инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С. Посев на скошенный агар. Техника посева в пробирки со скошенной средой: На скошенные среды переносят культуру из другой пробирки или с колоний на чашках. Прокалённой петлёй берут часть необходимой колонии с чашки Петри, чашку закрывают и отставляют. Пробирку держат в левой руке наклонном положении между большим и указательным пальцами так, чтобы поверхность среды можно было наблюдать. Петля - в правой руке. Пробку пробирки вынимают, зажимая их между мизинцем и ладонью. В таком положении она остаётся до конца посева. Край пробирки обжигают, переносят петлю, не прикасаясь к стенкам, в 29 пробирку и делают сплошной штриховой посев. Петлю прокаливают, ставят в штатив, край пробирки прокаливают и закрывают пробкой. Техника посева в конденсационную воду: выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей, открывают пробку, обжигают края пробирки, осторожно, не касаясь среды и стенок, вносят в конденсационную воду петлю с культурой. У выраженных подвижных культур рост с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность косяка. |