Лекция. Краткий курс лекций по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии Часть вторая. Общая микробиология
 Скачать 1.51 Mb.
|
|
3-й день (III этап). 1.Описывают культуральные свойства накопленной чистой культуры. 2.Проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка ( мазок окрашивают по Граму, в мазке должны быть однородные по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам клетки). При однородности исследуемых бак- терий выделение чистой культуры можно считать законченным. 3. Идентификация выделенной культуры проводится по: - биохимическим свойствам. Среды Гисса дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий. Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 – бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет. В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов. Пёстрый ряд Гисса для E.coli. - чувсвительности к антибиотикам. 30 - антигенным свойствам - фагочувствительности - токсигенности и другим признакам. Фаготипирование по методу Фишера. Испытуемую культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага. Чувствительность к фагуустанавливают по наличию лизиса культуры (стерильных пятен) Фагоидентификация по методу Отто. На чашку с МПА шпателем или петлёй выполняется посев выделенной культуры бактерий. Затем наносят каплю известного бактериофага и, наклонив чашку, дают капле несколько растечься по поверхности питательной среды. Через сутки наблюдают полную задержку роста в месте внесения диагностического фага. 4. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С. 4-й день (IV этап). Учет результатов и выдача ответа. 31 Лекция 7 Методы выделения анаэробов Анаэробы растут и размножаются в условиях, исключающих доступ кислорода воздуха. Молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие. Необходимую для существования энергию анаэробы получают путем расщепления органических и неорганических соединений, входящих в состав питательной среды. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и пространства, окружающего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. А также условием может быть и режим инкубации – посевы со многими анаэробными культурами выдерживают в термостате при 42 0 С 2-3 суток. Удаление кислорода из питательной среды. Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане в течение 10—20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1—1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. Можно использовать вещества, связывающие кислород. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, глютатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта—Тароцци, широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха. Удаление кислорода из окружающего пространства. Для создания бескислородных условий используют физические, химические и биологические факторы. Физические способы культивирования анаэробов. 1.Способ Виньяля - Вейона. Берут 4-5 пробирок с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45 °С сахарным агаром. В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала (1 мл.) и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым 32 каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, кончик их, пока он не обломан, погружают на 3-5 минут в стерильную воду температуры 45-50°С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают на спиртовке, а широкий заливают парафином и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микроба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду. 2. Метод Перетца — в расплавленный и охлаждённый сахарный агар вносят культуру бактерий и заливают под стекло, помещённое на пробковых палочках (или фрагментах спичек) в стерильную чашку Петри. Чашку помещают в термостат на 2-3 суток при 42 0 С. Для дальнейшего исследования стекло снимают, оплавляют бак. петлёй среду вокруг колонии и берут материал. Метод наименее надежен из всех, но достаточно прост в применении. Метод Перетца 3. Выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, который представляет собой толстостенный металлический (пластиковый, стеклянный) цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана, затем присоединяют его к насосу и выкачивают воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды. Можно создать бескислородные условия при помощи эксикатора, если эксикатор с краном, то по тому же принципу откачивается воздух, как и в анаэростате. Если эксикатор без крана, то в этом случае чашки с посевами кладут внутрь, ставят свечу и её зажигают, затем плотно притирают крышку. Пламя свечи выжгет весь кислород в эксикаторе и погаснет, таким образом, внутри эксикатора создадутся бескислородные условия. Анаэростаты. 33 Эксикаторы. Химические способы культивирования анаэробов. Способ Аристовского. Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 °С на 24 - 48 ч. Биологический метод выращивания анаэробов. Способ Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем сахарный агар. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1—1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину - культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палочкой (Е. coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги - не могли попасть на другую сторону чашки. Чашка закрывается, ее края запаиваются парафином (с целью не допустить попадания воздуха внутрь чашки). . В термостате чашки устанавливают вверх дном. Сначала вырастают в присутствии кислорода аэробы, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов. Метод Фортнера. Питательные среды для выращивания анаэробов. 1. Среда Китта-Тароцци. обеспечивает рост многих спорообразующих и строгих аспорогенных анаэробов. Состоит из питательного бульона, 2% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла. Выросшие анаэробы вызывают помутнение питательной среды. 34 Среда Кита-Тароцци. 2. Среда Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар) используется для выделения анаэробных бактерий. Готовится из питательного агара, к которому добавляют 1% глюкозу, хлорид железа и сульфит натрия. Анаэробы образуют на среде колонии черного цвета за счет образования соединений железа с серой. Посев можно делать на поверхность среды, налитой в чашку Петри, а также в расплавленную среду в пробирке (рост в виде черных прожилок). Среда Вильсона-Блера. 3.Среда Цейсслера - сахарный агар с кровью для выращивания и дифференциации анаэробов. Готовится следующим образом: к обычному мясопептонному агару добавляют 1- 2% глюкозу (рН среды =7,2—7,4) и стерилизуют в автоклаве при температуре 112° 20 минут. К 100 мл расплавленного, охлажденного до 45° агара добавляют 10 - 15 мл стерильно взятой дефебрилированной человеческой, лошадиной или бараньей крови, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Перед использованием чашки следует выдерживать сутки при комнатной температуре. В основу определения вида анаэробов положена форма роста их на среде Цейсслера в анаэробных условиях. Колонии анаэробов на ср. Цейсслера с зоной гемолиза вокруг. 4. Молоко по Тукаеву. К 1% пептонной воде прибавляют 5-6% обезжиренного молока, среду стерилизуют дробно при 100 0 C 3 дня подряд по 30 мин. Анаэробы дают рост в виде белого сгустка и просветления над ним среды. 5. 1% сахарный агар. Мясо-пептонный агар с добавлением 1% раствора глюкозы, стерилизуют в автоклаве при температуре 112° 20 минут, разливают в пробирки и в чашки Петри. Посев делают чаще в расплавленную среду, где анаэробы в толще среды дают колонии разнообразной формы. 35 Лекция 8 Лекция 9 Учение об инфекции. Патогенность микроорганизмов Инфекционный процесс Учение об эпидемическом процессе.Классификация инфекционных болезней 36 Термин «инфекция» [от лат. infictio, вносить что-либо вредное, + позднелатинское infectio, заражение] может определять и сам инфекционный агент, и факт его попадания в организм, но более правильно его применять для обозначения всей совокупности реакций между микроорганизмом и макроорганизмом. Проникновение любого микроорганизма в организм приводит к развитию защитных реакций – возникновению ответа, то есть инфекционного процесса. Спектр этих реакций широк, крайние его полюса — инфекционная болезнь и бессимптомная циркуляция микроорганизма. Таким образом, термины «инфекционный процесс» и «инфекционная болезнь» не тождественны, так как инфекционная болезнь — лишь частный случай инфекционного процесса, выявляемая клиническими или лабораторными методами. Для возникновения инфекционного заболевания необходимо сочетание следующих факторов: 1) наличия патогенного микробного агента; 2) восприимчивости макроорганизма; 3) наличия среды, в которой происходит это взаимодействие. Существенное значение для возникновения инфекционного заболевания имеет инфицирующая доза возбудителя – минимальное количество микробных клеток, способных вызвать инфекционный процесс. Инфицирующие дозы зависят от видовой принадлежности возбудителя, его вирулентности и состояния неспецифической и иммунной защиты. Ткани, лишенные физиологической защиты против конкретного вида микроорганизма, служат местом его проникновения в макроорганизм, или входными воротами инфекции. Входные ворота определяют локализацию возбудителя в организме, патогенетические и клинические особенности заболевания. Многих возбудителей отличает тропизм [от греч. trope, направление] к определённым тканям. Некоторые микроорганизмы способны, вызвать заболевание вне зависимости от пути проникновения, приводя к развитию полиморфных поражений, варьирующих в зависимости от места проникновения. Для таких патогенов характерен пантропизм. Проникнув в организм, возбудитель начинает размножаться в месте внедрения, формируя первичный очаг поражения (первичный аффект), либо распространяется (диссеминирует) в другие органы и ткани. Деление инфекций в зависимости от источника и восприимчивого организма, достаточно условно, однако по этому признаку можно выделить несколько групп: антропонозные инфекции - заболевания, при которых единственным источником возбудителя является человек. К ним относятся менингококковая инфекция, дизентерия, холера, дифтерия, сифилис, гепатит В, эпидемический сыпной тиф, эпидемический возвратный тиф и другие. зоонозные инфекции - заболевания, при которых единственным источником возбудителя являются животные. К ним относят туляремию, бруцеллез, бешенство. зооантропонозные инфекции - заболевания, при которых источником являются животное и больной человек (в том числе и трупы умерших). К ним относятся чума, сибирская язва, туберкулез, риккетсиозы. сапронозные инфекции - заболевания, основным местом обитания и размножения возбудителей которых являются объекты окружающей среды, откуда и попадают в организм человека. К таким инфекциям можно отнести заболевания, вызванные легионеллами, синегнойной палочкой и другими; Внешняя среда может оказывать влияние как на макроорганизм, так и на микробов- возбудителей. Это природно-климатические, социально-экономические, культурно- бытовые условия. 37 Классификация инфекций. 1. По этиологии: 1) бактериальные; 2) вирусные; 3) протозойные; 4) микозы; 5) микст-инфекции. 2. По количеству возбудителей: 1) моноинфекции – заболевание вызывается только одним возбудителем. 2) полиинфекции (смешанные) – вызывают заболевание несколько видов возбудителей. 3. По тяжести течения: 1) легкие; 2) тяжелые; 3) средней тяжести. 4. По длительности: 1) острые. Такие инфекционные болезни имеют ряд характерных особенностей, отличающих их от других болезней: а) имеют своего возбудителя – микроорганизм; б) контагиозны, т. е. способны передаваться от больного к здоровому; в) оставляют после себя более или менее выраженную невосприимчивость или повышенную чувствительность к данному заболеванию; г) характерен ряд общих признаков: лихорадка, симптомы общей интоксикации, вялость, адинамия; д) имеют четко выраженную стадийность, этапность (периоды). Выделяют следующие периоды инфекционных болезней: 1) инкубационный - от момента проникновения возбудителя в организм до появления первых признаков заболевания. Продолжительность – от нескольких часов до нескольких недель. Больной не заразен. 2) продромальный - характеризуется появлением первых неясных общих симптомов. Возбудитель интенсивно размножается, колонизирует ткань, начинает продуцировать ферменты и токсины. Продолжительность – от нескольких часов до нескольких дней; 3) разгар болезни - характеризуется появлением специфических симптомов. Возбудитель продолжает интенсивно размножаться, накапливаться, выделяет в кровь токсины и ферменты. Происходит выделение возбудителя из организма, поэтому больной представляет опасность для окружающих. В начале данного периода в крови обнаруживаются специфические антитела; 4) исход. Могут быть разные варианты: а) летальный исход. б) выздоровление (клиническое и микробиологическое). Клиническое выздоровление: симптомы заболевания угасли, но возбудитель еще находится в организме. Этот вариант опасен формированием носительства и рецидивом заболевания. Микробиологическое – полное выздоровление. в) хроническое носительство. Реинфекцией называют заболевание, возникающее после перенесенной инфекции в случае повторного заражения тем же возбудителем. Рецидивом называют возврат симптомов заболевания. Суперинфекция возникает, когда на фоне течения одного инфекционного заболевания происходит заражение еще одним возбудителем. Вторичная инфекция инфекционное 38 заболевание, вызванное условно-патогенной флорой, вследствие снижения защитных сил организма. 2) хронические. 3) латентные (скрытые или бессимптомное носительство) – в организме идёт инфекционный процесс, но клинических проявлений болезни нет. 4) подострые (стёртая форма заболевания) – отсутствует ряд клинических признаков. 5. По путям передачи: 1) горизонтальные: а) аэрогенный, то есть через воздух. Относятся воздушно-пылевой и воздушно-капельный путь б) алиментарный (фекально-оральный) – через желудочно-кишечный тракт. в) контактный (бытовой) г) трансмиссивный – через кровососущих насекомых. д) половой. 2) вертикальные: а) от матери к плоду (трансплацентарный) б) от матери к новорожденному в родовом акте 3) артифициальные (искусственные) – при инъекциях, обследованиях, операциях и т. д. 6. В зависимости от локализации возбудителя различают: 1) очаговую инфекцию, при которой микроорганизмы локализуются в местном очаге и не распространяются по всему организму. 2) |