НК. НК- масимба. Лабораторная работа 1 Выделение нуклеиновых кислот из животных и растительных объектов
 Скачать 28.53 Kb.
|
|
Лабораторная работа 1 Выделение нуклеиновых кислот из животных и растительных объектов ДНК- носитель генетической информации, записанной в виде генетического кода. По последовательности нуклеотидов в ДНК можно установить степень родства людей, а по митохондриальной ДНК – точно устанавливать родство по материнской линии. Для этих целей используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе метода ПЦР лежит природный процесс – комплементарное достраивание (воспроизводство) ДНК-матрицы in vivo, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликация ДНК. ПЦР позволяет многократно воспроизводить (амплифицировать) выбранный фрагмент ДНК без помощи клетки-хозяина. Для этого нужно иметь в своем распоряжении два олигонуклеотида (праймера), каждый из которых будет гибридизоваться с одной из цепей на противоположных концах подлежащего амплификации фрагмента ДНК, достаточное количество дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) и термостабильную ДНК-полимеразу. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови животных Внеклеточная ДНК (ДНК плазмы эукариот) несет важную биологическую нагрузку. Увеличение ДНК в плазме крови (фрагменты хромосомной ДНК) часто является результатом воздействия на организм внешней среды (магнитные поля, электромагнитное излучение или канцерогены и т.д.). Аутоиммунные заболевания (заболевания, связанные с нарушением иммунного статуса) также приводят к повышению в кровотоке внеклеточных нуклеиновых кислот. Повышение нуклеиновых кислот часто связано с процессом нарушения апоптоза - программируемой клеточной гибели (механизма контроля за нормальным функционированием клеток.) В случае возникновения проблем в одной клетке, запускается механизм ликвидации этой единственной клетки. Нарушение механизма апоптоза ведет к возникновению различных заболеваний, например, торможение апоптоза ведет к возникновению опухолевых заболеваний (неконтролируемый процесс репликации ДНК и, как следствие, увеличение количества «лишних» клеток ткани). Возникновение нейродегенеративных заболеваний (рассеянный склероз, поражаются аксоны нейронов и прекращается передача сигналов) связано с увеличением скорости апоптоза. Часто эти нарушения связаны с заключительным этапом апоптоза, суть которого во фрагментировании ДНК «приговоренной» клетки и вывода ее из организма. В случае нарушения этого процесса такая ДНК и попадает в кровоток. Итак, низкомолекулярная фракция ДНК появляется в плазме крови при некоторых экстремальных и патологических состояниях. Для изучения этих проблем часто необходимо выделение внеклеточной ДНК с последующим изучением ее характеристик: формы, размера и т.д. различными методами, в том числе и электрофорезом, поэтому важно уметь выделять внеклеточную ДНК и готовить препараты для электрофореза. Оборудование: Спектрофотометр СФ-26 или СФ-46 для измерения концентрации ДНК; термостат или водяная баня 56ОС; центрифуги Т 23D, К 24, «Эппендорф»; вортекс (микрокачалка). Пробирки: полиэтиленовые (центрифужные); одноразовые полипропиленовые пробирки объемом 1.5 мл (типа «Эппендорф»); пробирки мерные («пальчики»); пипеточные дозаторы переменных объемов (200мкл, 1000 мкл); наконечники для них; стеклянная посуда. Реактивы: Подкисленный 95%-ный раствор этилового спирта; изопропиловый спирт; физиологический раствор; 0.5M ЭДТА-Na2; 0,1 М трис-ОН, (рН 8,0); 3М ацетатный буфер (рН 5,7), 0,1%-ный раствор поливинилсульфата калия, 3%-ная суспензия бентонита, проназа (100 мг/мл); додецилсульфат натрия (0,5% ДСН); раствор хлороформа с изоамиловым спиртом (раствор Х); 0,25% раствор БФС в 50 %-ном глицерине (бромфеноловый синий -краситель для электрофореза). Подготовка реагентов: «Лизирующий раствор» -ЛР для проназы (5мл):
РР-рабочий раствор; ЗР- запасной раствор 2. Физиологический раствор для разведения компонентов представляет собой 0.85% раствор хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7.2-7.4. 3. Подкисленый 95%-ный этиловый спирт (0,4 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л этанола). 4. Хлороформ-изоамиловый спирт (Х)- (24:1). Получение плазмы крови В качестве экстремального воздействия, индуцирующего появление в крови животных внеклеточной низкомолекулярной ДНК, можно использовать ионизирующее излучение (в диапазоне доз от 1 до 8 Гр) или сильнодействующие токсические агенты (в субтоксических дозах). Кровь у крыс следует забирать через 5 ч после воздейстия. К этому сроку достигается максимальный уровень низкомолекулярной внк ДНК, которая и является объектом анализа. Кровь собирается в пластиковые чашечки при покачивании. В качестве антикоагулянта используется 0,5 М ЭДТА-Na (рН 7,3), добавляемый в соотношении кровь: ЭДТА как 70:1. Следует подчеркнуть нежелательное использование гепарина, который ассоциируясь с молекулами ДНК, может искажать данные о количестве нуклеиновых кислот в крови. Для одного анализа требуется 5 мл крови. Плазму отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 810 g и 4 C в бакет-роторе. Для полного удаления форменных элементов ее подвергают еще двухкратному центрифугированию при 2200g в угловм роторе. Вариант А Схема работы: К 1мл плазмы добавить 1 мл ЛР (в мерном «пальчике»); закрыть пробкой и встряхивать 1 мин, выдержать 5 мин при 65ОС на водяной бане (раствор I). К полученному раствору I добавить равный объем раствора Х. Мягко экстрагировать, встряхивая в вортексе или вручную (3 мин). Перенести смесь в центрифужную пробирку. Центрифугировать 4500 об/мин, при температуре 20ОС, в течение 10 мин. (Процедуру повторять до исчезновения промежуточной фазы, каждый раз повторяя процедуру встряхивания и центрифугирования). Зарисовать центрифужную пробирку со смесью ДНК до и после центрифугирования (см рис. 26 на стр.49). Отобрать водную фазу с раствором ДНК в пробирку «Эппендорф» и добавить 0,6 V (объема) изопропилового спирта (должен образоваться рыхлый белесый осадок). Выделение ДНК из растительных тканей При выделении ДНК из тканей растений важным фактором является эффективное разрушение клеточных стенок. Многие методы, используемые для этого, приводят к сильной фрагментации ДНК (из-за гидродинамических разрывов в цепи!). Часто приходится находить компромисс между размером ДНК и еѐ количественным выходом, ведь молекулы ДНК – самые крупные полимерные биомакромолекулы. Высвобождение высокомолекулярной ДНК из клеток – это только часть задачи, поскольку растительные экстракты содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующих агентов, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счѐт связывания двухвалентных катионов. От белков ДНП-комплекса избавляются фенольной депротеинизацией образца. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ. После депротеинизации препарат всѐ ещѐ сильно загрязнѐн полисахаридами. Распространены методы с использованием двух детергентов CTAB (cetyl trimethyl aммonium bromid) и SDS (sodium dodecyl sulfate). Метод с использованием СTAB (Rogers, Bendich, 1985) позволяет получать препараты растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и гибридизационного анализа. CTAB хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного вещества. При высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные, но вместе с тем растворимые комплексы со CTAB. При снижении концентрации соли ниже 0.4М NaCl происходит выпадение в осадок комплексов CTAB/нуклеиновая кислота, тогда как большая часть полисахаридов остается в растворе. Осадок снова растворяют в высокосолевом растворе 1М NaCl и высаживают ДНК спиртом. Другая методика также предусматривает использование детергентов, в частности SDS, который также осуществляет солюбилизацию биомембран и быструю денатурацию протеинов (при этом инактивируются нуклеазы). Ниже приведена модификация одного из таких методов, изначально разработанного Делапорта с соавт. (Dellaporta et al., 1985). Белки и полисахариды в растительных экстрактах при 0ºС образуют комплексы с SDS и выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Высокомолекулярная ДНК, очищенная впоследствии от белков фенолом, осаждѐнная спиртом и растворѐнная в соответствующих буферах, пригодна для рестрикции и ПЦР. Приготовить навеску 200 мг листьев растений, замороженных заранее при –20 ºС в морозильнике, либо быстро заморозить навеску в жидком азоте. . Образцы растереть в предварительно охлаждѐнной фарфоровой ступке до гомогенного состояния. Если нет жидкого азота, то при растирании к замороженным листьям необходимо добавить 0.1 г оксида алюминия или прокалѐнного белого речного песка качестве абразива. В ступку при этом нужно добавить немного буфера для экстракции ДНК (300 мкл). Альтернативно, можно растирать в специальных гомогенизаторах – риболайзерах. Добавить в ступку 700 мкл буфера для экстракции, снова перемешать. Перенести растѐртую массу в 1.5 мл микропробирку так, чтобы объѐм составлял примерно 700 мкл (на пробирке есть метка 0.75 мл). Перемешать и инкубировать гомогенат при 65 ºС в течение 10 минут. Добавить 220 мкл ацетата калия и поместить пробирку на лѐд на 20 минут. Центрифугировать пробу в течение 3 минут при скорости 10000 об/мин. Перенести супернатант (надосадочную жидкость) в чистую пробирку. К супернатанту добавить равный объѐм изопропанола, перемешать и центрифугировать 10 минут при 10000 об/мин для осаждения ДНК. Осадок ДНК промыть 70% этанолом, растворить в 200 мкл буфера ТЕ. Провести процедуру фенольной депротеинизации образца. Для этого внести в пробирку с раствором ДНК равный объѐм фенол–хлороформной смеси, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу. Повторить ту же процедуру со смесью хлороформ–изоамиловый спирт. Отобрать водную фазу с ДНК в чистую пробирку. Высадить ДНК в 2.5 объѐмами холодного 96% этанола, предварительно прилив к образцу 1/10 объѐма 3М ацетата K (рН 5.0) или Na (pH 5.2). Пробу центрифугировать в течение 10 мин на максимальной скорости. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом. Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 50 мкл буфера ТЕ. Лабораторная работа 2 Определение концентрации нуклеиновых кислот Для многих методик манипуляции с ДНК (ПЦР, рестрикция, лигирование) необходимо знать ее концентрацию. Довольно часто количественную и качественную оценку препарату выделенной ДНК можно оценить при гель электрофорезе, следующим, как правило, сразу за процедурой выделения. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца с образцом известной концентрации (с маркерами молекулярной массы, концентрация которых указывается в описании). Определить концентрацию ДНК, а также степень ее чистоты, можно с помощью спектрофотометра, что точнее быстрее. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в области 240–290нм с максимумом при 260 нм. Хромофорами служат азотистые основания нуклеиновых кислот, особенно пиримидиновые. Пиримидины поглощают УФ свет примерно в 10–20 раз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул – триптофан, тирозин и фенилаланин имеющих максимум поглощения при 280нм. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей полученных при измерении 260 нм и 280 нм должно быть более 1,8. Оптическая плотность раствора нуклеиновых кислот при длине волны 260нм, равная 1, соответствует 50 мкг/мл двух-цепочечных ДНК и РНК, 40 мкг/мл одноцепочечных ДНК и РНК и 20 мкг/мл олиго-нуклеотидов. По известной оптической плотности раствора можно рассчитать концентрацию, мкг/мкл, по соответствующим формулам: для двух цепей полинуклеотидов: ΔА260 х разбавление х 0.05; для одиночных цепей ДНК: ΔА260 х разбавление х 0.037; для одиночных цепей РНК: ΔА260 х разбавление х 0.04; для олигонуклеотидов: ΔА260 х разбавление х 0.02, где ΔА260 - разница оптических плотностей раствора нуклеиновых кислот и растворителя, которым практически всегда является стерильная деионизованная вода. | ||||||||||||||||||||||||||