№2 зертханалық жұмыс. №2 лабораторная работа. Лабораторная работа 2 Изучение физикохимических свойств белков
 Скачать 24.43 Kb.
|
|
Лабораторная работа 2 Изучение физико-химических свойств белков Опыт 1. Растворимость белка При разведении водой яичного белка и других биологических жидкостей, содержащих альбумины и глобулины, альбумины переходят в раствор, глобулины выпадают в осадок. Если в воде присутствуют в небольших концентрациях соли щелочных металлов (NaCl, KCl, NH4Cl, Na2SO4 и др.), то в раствор переходят обе фракции: альбумины и глобулины. Для извлечения растительных белков пользуются различными растворителями. Белки пшеничной, ржаной, ячменной муки хорошо растворяются в 0,2%-ном растворе NaOH, еще лучше в водно-спиртовом растворе едкого натра (0,2% NaOH в 50-60%-ном этиловом спирте). В раствор переходят альбумин, глобулин, проламин, глютелин. Глютелины хорошо растворяются в щелочи, так как имеют в своем составе большое количество дикарбоновых кислот (глутаминовая, аспарагиновая) и обладают кислым характером. Проламины не растворяются в воде и солевых растворах, а растворяются только в 50-80%-ном этловом спирте. Проламины содержат большое количество аминокислоты пролина и глутаминовой кислоты. Реактивы и материалы: 1%-ный раствор яичного белка 5%-ный раствор NaCl пшеничная мука 0,2%-ный раствор NaOH Фарфоровая ступка, фильтровальная бумага, маленькая стеклянная воронка, стеклянная палочка, пробирки Ход работы: К 2 каплям яичного белка добавляют 20 капель дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 3-5 минут. Яичный альбумин растворяется, а глобулин выпадает в виде небольшого осадка. Раствор фильтруют через складчатый фильтр, смоченный водой. Фильтра используют для реакций осаждения. 200 мг пшеничной муки растирают в фарфоровой ступке с 5 мл 0,2%-ного раствора щелочи. В раствор переходят альбумин, глобулин и глютелин. Содержимое ступки переносят в пробирку и после отстаивания верхний мутноватый слой используют для цветных реакций и реакций осаждения. Опыт 2. Определение изоэлектрической точки белка В водных растворах белки обладают свойствами слабых кислот или оснований в зависимости от преобладания в молекуле белка дикарбоновых кислот (глутаминовая, аспарагиновая) или двухосновных кислот (лизин, аргинин). Белки кислого характера (альбумины, глобулины) в водном растворе несут отрицательный заряд, белки основного характера (протамины, гистоны)- положительный. Заряд на частице белка стабилизирует его в растворе. Изменяя концентрацию Н+-ионов в среде (добавлением кислоты или щелочи) можно добиться нейтрализации заряда молекулы белка, т.н. достичь изоэлектрической точки. В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы. Молекулы белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. NH4+ NH3 │ │  R – COO- + H R – COO -│ │ COO- COOH Белок с кислыми белок в изоэлектрическом свойствами состоянии NH4+ NH4+ │ │ R – COO- + OH- R – COO - + H2O│ │ NH4+ NH2 Белок с основными белок в изоэлектрическом свойствами состоянии Выпадение белка в осадок в изоэлектрической точке можно ускорить добавлением водоотнимающих средств (спирта, ацетона, эфира) или танина. Органические растворители уменьшают степень гидратации белковых молекул, разрушают их гидратные оболочки, танин образует нерастворимые в воде соединения с азотистыми гетероциклическими группировками Реактивы и материалы: 0,1н раствор уксусной кислоты 0,1н раствор ацетата натрия 0,5%-ный раствор желатины Этиловый спирт танин пробирки Ход работы: В 5 пробирок наливают растворы уксусной кислоты и уксуснокислого натрия в количествах, указанных в таблице. Затем в пробирки добавляют по 1 мл раствора желатина и хорошо перемешивают. После этого прибавляют по 4 мл этилового спирта или по 1 мл танина. Через 5-10 минут просматривают пробирки и сравнивают степень мутности в каждой их них. рН наиболее мутной пробирки соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу
Опыт 3. Реакции осаждения белка Многие факторы влияют на физико-химические свойства белковых веществ, вызывая изменения структуры макромолекул. Этот процесс называется денатурацией. При денатурации нарушается активная конформация белковой молекулы. Факторы, вызывающие денатурацию, можно разделить на две группы: физические и химические. К физическим факторам относятся температура, механическое воздействие, воздействие ультразвуком и др. К химическим факторам относятся осаждение различными химическими соединениями (соли тяжелых металлов, минеральные и органические кислоты, соли аммония, соли щелочных и щелочноземельных металлов, органические растворители, алкалоиды). Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми. При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение вызывается воздействием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание), а также действием спирта и других органических растворителей. При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка, он становиться гидрофобным. Денатурированный белок не способен восстановить свои первоначальные физико-химические и биологические свойства. Необратимое осаждение вызывается действием высокой температуры, действием кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реактивов, красителей. Реактивы и материалы: 1%-ный раствор яичного белка (NH4)2SO4 насыщенный раствор (NH4)2SO4 кристаллический NaCl кристаллический MgSO4, кристаллический 1%-ный раствор уксусной кислоты спирт, ацетон, диэтиловый эфир 10%-ный раствор уксусной кислоты 10%-ный раствор NaOH насыщенный раствор NaCl HNO3, HCl, H2SO4 концентрированные 5%-ные раствора сульфата меди, уксуснокислого свинца, хлорного железа маленькая стеклянная воронка, фильтровальная бумага, пробирки, стеклянная палочка Ход работы: 3.1. Осаждение белков нейтральными солями щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание) В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтровывают. К фильтрату добавляют кристаллический порошок сульфата аммония до насыщения. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Если произошло полное осаждение, то реакция должна быть отрицательной. В две пробирки наливают по 2-3 мл раствора яичного белка и добавляют до получения насыщенного раствора в одну пробирку порошок NaCl, в другуюMgSO4. Через 5-6 минут в пробирках наблюдается выпадение осадков – глобулинов. Альбумины в нейтральных растворах щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются. Осадки отфильтровывают. Проверяют присутствие белка в фильтрате биуретовой реакцией. 3.2. Осаждение белков органическими растворителями В пробирку наливают 1-2 мл раствора яичного белка, добавляют немного (на кончике шпателя) порошок NaCl каплям добавляют этиловый спирт (ацетон, диэтиловый эфир) и взбалтывают. Через 5-8 минут выпадает осадок белка. Сразу же после появления осадка часть содержимого пробирки с осадком переливают в другую пробирку и приливают несколько мл дистиллированной воды. Концентрация спирта падает, и белок вновь растворяется. Органические растворители вызывают дегидратацию белковых молекул, разрушают их гидратную оболочку, что снижает их устойчивость и ведет к осаждению. Лучше всего происходит осаждение белков из нейтральных или слабокислых растворов. В щелочных растворах осаждение затормаживается. Осаждению способствует также присутствие электролитов (NaCl). Осаждение спиртом обратимо, если воздействие растворителя было кратковременным. 3.3. Тепловая денатурация белка В 5 пробирок наливают по 1-2 мл раствора яичного белка. В первой пробирке белок нагревают до кипения, раствор при этом мутнеет, разрушаются гидратные оболочки белковых молекул, но осадок при этом не выпадает, так как мицеллы сохраняют одноименные заряды, что препятствует их коагуляции. Во вторую пробирку помимо раствора белка добавляют 1 каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадок выпадает быстрее, так как заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку наливают 5-8 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадок не образуется, так как мицеллы приобрели заряд, теперь уже отрицательный, что является стабилизирующим фактором. В четвертой пробирке к раствору белка добавляют 5-8 капель 10%-ного раствора щелочи и нагревают: осадок не выпадает, так как мицеллы приобретают отрицательный заряд. В пятой пробирке к раствору белка добавляют 4-5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 5-6 капель насыщенного раствора NaCl, нагревают до кипения, осадок выпадает. 3.4. Осаждение минеральными кислотами. В три пробирки наливают по 1 мл концентрированных кислот. Пробирки наклоняют под углом 450 и осторожно из пипетки по стенкам пробирки наслаивают раствор белка. На границе соприкосновения жидкостей образуется белое кольцо. Пробирки осторожно встряхивают, затем добавляют избыток кислоты. Осадки растворяются в серной и соляной кислотах, но не растворяются в азотной. 3.5. Осаждение солями тяжелых металлов. В 3 пробирки наливают по 1-2 мл раствора яичного белка и по каплям добавляют растворы уксуснокислого свинца, сульфата меди и хлорного железа. Выпадают осадки. При добавлении избытка растворов солей осадки вновь растворяются. Срои тяжелых металлов, адсорбируясь на поверхности белковых мицелл, изменяют их электрический заряд. Осадок выпадает при достижении изоэлектрической точки. Денатурация белков солями тяжелых металлов сопровождается глубокими нарушениями вторичной и третичной структур макромолекул белка. Происходит разрыв связей между полипептидными цепями, что влечет за собой необратимое изменение структуры. Растворение осадка в избытке соли происходит вследствие перезарядки денатурированных молекул. |