Лабораторная работа Определение микробиологических показателей пищевых продуктов: КМАФАМ, БГКП, дрожжи и плесневые грибы. Лабораторная работа ФПК. КМАФАМ, дрожжи,плесени, БГКП. Лабораторная работа 2 Методы определения микробиологических показателей продовольственного сырья и продуктов питания

• Название: Лабораторная работа 2 Методы определения микробиологических показателей продовольственного сырья и продуктов питания
• Анкор: Лабораторная работа Определение микробиологических показателей пищевых продуктов: КМАФАМ, БГКП, дрожжи и плесневые грибы
• Дата: 13.10.2020
• Размер: 31.79 Kb.
• Имя файла: Лабораторная работа ФПК. КМАФАМ, дрожжи,плесени, БГКП.docx
• Тип: Лабораторная работа; #142614

Лабораторная работа 2 Методы определения микробиологических показателей продовольственного сырья и продуктов питания.
Цель работы: освоить методику микробиологического исследования пищевых продуктов по показателям: КМАФАМ, БГКП, дрожжи и плесневые грибы.
Содержание работы
Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ).

КМАФАнМ (общее микробное число) – количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Это обширная группа различных микроорганизмов, которыми может быть обсеменен пищевой продукт. КМАФАнМ – наиболее распространенный тест на микробную безопасность.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяют по ГОСТ 10444.15 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных и факультативно-анаэробных мик­роорганизмов».

Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно- анаэробных микроорганизмов посевом в агаризованные питательные среды основан на высеве продукта или разведения навески продукта в питательную среду, инкубировании посевов, подсчете всех выросших видимых колоний.

Метод основан на подсчете выросших на пи­тательных средах при термостатировании посевов при темпе­ратуре 30 °С в течение 72 ч колоний, видимых при двукратном увеличении (с помощью лупы).

Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП) (колиформных бактерий).

Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) имеют большое санитарно-гигиеническое значение. В этой группе определяют пять родов энтеробактерий: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Seratia. Особое место в этой группе занимают бактерии, которые являются показателем свежего фекального загрязнения, типичный представитель - Еscherichia coli.

Определение бактерий группы кишечных палочек проводят согласно ГОСТ 31747-2012 «Продукты пищевые. Методы выявле­ния и определения количества бактерий группы кишечных пало­чек (колиформных бактерий)».

Бактерии группы кишечных палочек - анаэробные и факуль­тативно-анаэробные, грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и га­за при температуре 37  С в течение 24 ч (бродильная проба), не обладающие оксидазной активностью, каталазоположительные, обычно цитратотрицательные, отрицательные по признакам об­разования H₂S, гидролиза мочевины и активности липазы.

Бактерии хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, плёнка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с тёмным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (E. aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки (B. paracoli) характерны бесцветные колонии.

Определение дрожжей и плесневых грибов. Дрожжи — одноклеточные организмы овальной, продолговатой или округлой формы. Плесени имеют сложное строение в виде грибницы, образующейся на поверхности пищевых продуктов.

Определение дрожжей и плесневых грибов проводят согласно ГОСТ10444.12-2013 «Продукты пищевые. Методы определения дрожжей и плесневых грибов». Метод основан на высеве продукта или гомогената продукта или их разведений в питательные среды, определении принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам и дрожжам по характерному росту на питательных средах и по морфологии клеток.

Перечень необходимых материалов, реактивов, оборудования, посуды, наглядных пособий

Материалы: пептонно-солевой раствор, питательные среды: мясопептонный агар, среда Сабуро или суслоагар, среда Кёсслер, среда Эндо.

Реактивы: 70%ый этиловый спирт, набор красителей для окраски по

Граму.

Оборудование и посуда:весы, электрическая плитка, водяная баня, спиртовка, стерильные чашки Петри, пипетки, колбы, пробирки, предметные стекла.

Методика выполнения работы

Данная работа выполняется на двух занятиях и включает три задания.

Задание 1. Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАМ)

Перед работой стол и руки протирают спиртом. Мясопептонный агар (МПА) расплавляют и охлаждают до 45-50 °С. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе.

Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в продукте предполагаемое количество мезофильных аэробных и факультативно- анаэробных микроорганизмов или количество, указанное в нормативно- технической документации на конкретный продукт.

Для приготовления первого десятикратного разведения 10 г образца при соблюдении правил асептики помещают в колбу с 90 см³ стерильного физраствора. Подготовлен­ную пробу тщательно перемешивают. Взвесь отстаивают в тече­ние 5 мин. Надосадочную жидкость используют для приготовле­ния последующих разведений.

Для приготовления второго стократного разведения в пробирку с 9 см³ стерильного физраствора стерильной пипеткой пере­носят 1 см³ исходного разведения и перемешивают полой стериль­ной пипеткой.

Для приготовления тысячного и десятитысячного разведения поступают аналогичным образом.

В чашку Петри стерильной пипеткой вносят по 1 см³ раз­веденного продукта или смыва, заливают расплавленным и осту­женным до 45°С мясопептонным агаром (15-20 см³), размеши­вают, вращая чашку не отрывая её от поверхности стола. На чашке указывают данные об анализе (номер пробы, разведение, дату посева). После застывания агара чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре 37 °С до следующего занятия.

На следующем занятии изучают посевы визуально. Подсчитывают колонии бактерий выросшие чашках Петри. Для подсчета отбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 300 колоний. Колонии подсчитывают невооруженным глазом или с помощью линзы с шестикратным увеличением, или с помощью специально предназначенного для подсчета колоний прибора.

Колонии микроорганизмов на плотных средах подсчитывают в посевах того разведения, которое содержит от 15 до 300 . По результатам подсчета вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний из всех посевов одного разведения.
Если число колоний соответствует требованиям в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведениях, то вычисляют среднее арифметическое количество микроорганизмов в каждом из этих разведений отдельно.
Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем в 2 раза, то оценку проводят по результатам посева наибольшего разведения.
Полученные среднеарифметические значения округляют до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100; до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчиваются цифрой 5; до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчиваются цифрой 5.

Количество микроорганизмов в 1 г (1 см³) рассчитывают по формуле

Κ=AB/C, (1)

где К - количество микроорганизмов в 1 г или 1 см³ или на 1 см², КОЕ;

А - среднее арифметическое число колоний в чашках;

В - разведение 10, 100, 1000 и т.д.;

С -объем внесенной суспензии (см³) .

Результаты выражают в колониеобразуюших единицах - КОЕ (г, см³, см²). Результат вычисления выражают числом от 1,0 до 9,9х10^п.

Для изучения клеток выросших микроорганизмов из изоли­рованных колоний готовят фиксированные препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Задание 2 Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП)

Для определения БГКП 1 см³ исходного или другого разведения продукта засевают в пробирки с 10 см³ среды Кесслера и инкубируют при температуре 37 °С; засевается такое количество продукта, в кото­ром ГОСТом нормируется отсутствие бактерий группы кишеч­ных палочек. Например, если не допускается содержание кишечных палочек в 0,1 г продукта, то вносится 1 см³ первого разведения, если не допускается содержание кишечных палочек в 0,01 г продукта, то вносится 1 см³ второго разведения..

Через 24-48 ч из пробирок, в которых наблюдается интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помут­нении среды, образовании газа, подкислении среды (т. е. изменение цвета среды), проводят посев на плотную диффе­ренциально-диагностическую среду Эндо. Для этого на поверхность среды Эндо (с соблюдением асептики) вносят одну бактериологическую петлю (одну каплю) среды Кесслера и аккуратно растирают по поверхности для получения отдельных колоний бактерий. Посевы помещают при температуре 37 °С на 24 ч. Чашки оставляют до следующего занятия

На следующем занятии посевы на среде Эндо просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для Escherichia coli колоний.

При наличии на среде Эндо красных (с металлическим бле­ском или без него), розовых, бледно-розовых и бесцветных коло­ний, не обладающих протеолитической активностью, из изоли­рованных колоний (не менее пяти колоний) готовят препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных без спор палочек делают заключение о присутст­вии в пробе БГКП. Таким образом, делают вывод о том, что исследуемый продукт не соответствует ГОСТу по показателю БГКП.

Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП) (колиформных бактерий). Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) имеют большое санитарно-гигиеническое значение. В этой группе определяют пять родов энтеробактерий: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Seratia. Особое место в этой группе занимают бактерии, которые являются показателем свежего фекального загрязнения, типичный представитель - Е. coli.

Определение бактерий группы кишечных палочек проводят согласно ГОСТ 30518-97 «Продукты пищевые. Методы выявле­ния и определения количества бактерий группы кишечных пало­чек (колиформных бактерий)».

Бактерии группы кишечных палочек - анаэробные и факуль­тативно-анаэробные, грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и га­за при температуре 37  С в течение 24 ч (бродильная проба), не обладающие оксидазной активностью, каталазоположительные, обычно цитратотрицательные, отрицательные по признакам об­разования H₂S, гидролиза мочевины и активности липазы
Задание 3 Определение дрожжей и плесневых грибов.

Для подсчета дрожжей и плесневых грибов в исследуемой пробе степень разведения навески для высева на плотные среды выбирают так, чтобы общее количе­ство колоний, выросших на чашке, колебалось в пределах от 15 до 150. Первое разведение готовят аналогично заданию 1 (Определение показателя КМАФАМ).

Обратить внимание на особенности внесения пробы в чашки Петри!

Перед отбором 1 см³разведения раствор встряхивают, чтобы избежать осаждения частиц, содержащих микроорганизмы. По причине быстрого осаждения спор в пипетке ее следует держать в горизонтальном (не вертикальном) положении при заполнении соответствующим объемом разведения.

В две стерильные чашки Петри параллельно переносят с помощью стерильной пипетки 1 см³ испытуемой пробы.
чашки Петри и заливают 15-20 см³ расплавленной и охлаж­денной до 45°С питательной средой (Сабуро или суслоагар). Содержимое чашки премеши­вают, вращая чашку по кругу, не отрывая от горизонтальной поверхности стола. На чашке указывают данные об анализе (номер пробы, разведение, дату посева).

После застывания агара чашки инкубируют аэробно крышками вверх в термостате при температуре 24 °С до следующего занятия.
Рост дрожжей на плотных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем.
Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия (пушистого налета) различной окраски.

Для подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 КОЕ (колониеобразующих единиц) дрожжей и (или) от 5 до 50 КОЕ плесневых грибов. Колонии подсчитывают и, если необходимо, отличие дрожжевых колоний от бактериальных устанавливают путем микроскопирования препаратов, приготовленных из этих колоний. Препараты готовят методом раздавленной капли.

Количество дрожжей или плесневых грибов на грамм или кубический сантиметр пробы продукта рассчитывают исходя из количества колоний, выросших на чашках Петри с учетом разведения, используемого для посева.
Количество дрожжей и плесневых грибов подсчитывают отдельно.

Если количество выросших дрожжей или плесневых грибов определяют в двух последовательных разведениях, то количество их на 1 г или 1 сантиметр кубический продукта  вычисляют по формуле
, 

где ∑С - сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных разведениях;

 n₁- количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

 n₂- количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

 n- степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Для микроскопического изучения клеток дрожжей из изоли­рованных колоний готовят препараты раздавленная капля и микроскопируют с увеличением 40х. Плесневые грибы микроскопируют непосредственно в чашках с увеличением 10х.

Оформление отчета

Отчет по работе включает: краткую теоретическую часть, методику выполнения работы (КМАФАМ, дрожжи и плесени, БГКП); визуальные наблюдения (рисунки микроорганизмов); выводы по соответствию исследуемых проб требованиям нормативной документации (СанПиН, ГОСТ, ТУ).