Лекции по биофизике. Лекции по биофизике учебнометодическое пособие
 Скачать 1.98 Mb.
|
|
, где [К + ] i и [Cl ] i -концентрации внутриклеточных ионов, [К + ] e и [Cl ] e - концентрации внеклеточных ионов, в итоге будет выражать дисбаланс: ) ( 1 X C X 2 2 ) ( X C Величина этого дисбаланса будет итогом решения уравнения: 2 1 2 2C C C X Таким образом, на границе раздела фаз осуществляется возможность образования двойного электрического слоя, за счет избирательного связывания отдельных ионов гелем цитоплазмы. В результате такой гель окружен областью ионов противоположного заряда – двойным электрическим слоем. Ионная теория электрогенеза Бернштейна Современная теория электрогенеза вытекает исторически из положений Бернштейна (1940), связавшему впервые ионную проницаемость мембран с природой биопотенциалов. Ее основные положения: 1. В состоянии покоя мембрана проницаема только для ионов калия. 2. Ионы калия, выходя из клетки, создают потенциал, величина которого рассчитывается по уравнению Нернста: ex in K K K Ln F RT где [К + ] i и [К + ] e – концентрации внутриклеточных – i и внеклеточных ионов – e, соответственно. 3. Этот потенциал равновесный, так как различие концентраций [К+]i и [К+] e присутствует в клетках постоянно. В качестве доказательства своей теории Бернштейн указывал на зависимость мембранного потенциала от температуры, изменений внеклеточной концентрации ионов калия [К + ] e , т.е. от расчетных показателей уравнения Нернста. 104 Теория постоянного поля и потенциал покоя (ПП) Современные представления об электрогенезе основаны на положениях теории постоянного поля. Ее основные создатели: Ходжкин, Хаксли и Катц (1949) разработали ряд упрощений для возможного анализа протекания электрических процессов на мембране: 1. Ионы движутся в мембране по градиенту концентрации и электрического поля, как в растворе. 2. Напряженность электрического поля в мембране постоянна и потенциал падает линейно ее толщины по мере удаления от источника электрического поля. 3. Мембрана гомогенна, имея постоянную диэлектрическую проницаемость по всей толщине. 4. Концентрация ионов в мембране на границе с раствором пропорциональна концентрации ионов в самом растворе. Из первого выражения вытекает, что плотность ионного тока через мембрану: dx dV c u Fz dx dc RT u z I i i i i i i i 2 , где: z i –валентность i-го иона, V- потенциал в точке, x – расстояние по толщине мембраны от наружной ее границы. Т.е. плотность ионного тока определяется разностью между диффузионным потоком i-го иона по концентрационному градиенту (1-ое слагаемое) и противоположно направленным потоком этого иона, обусловленным электрическим полем, возникшем при его диффузии (2-ое слагаемое). При постоянстве электрического поля dV/dx =const=V/a, где а – толщина мембраны константа проницаемости мембраны (P i ) определяется относительной подвижностью и растворимостью в мембране: aF RT u P i i i , где: β i – коэффициент распределения i-го иона между водным раствором и мембраной, u i – подвижность этого иона в электрическом поле. На основании представленных положений теории постоянного поля Ходжкин, Гольдман и Катц вывели уравнение зависимости плотности ионных токов от мембранного потенциала и ионной проницаемости: RT EF RT EF K K RT E F u P I i i i K K exp 1 exp 0 2 105 RT EF RT EF Na Na RT E F u P I i i i Na Na exp 1 exp 0 2 RT EF RT EF CL Cl RT E F u P I i i i Cl Cl exp 1 exp 0 2 Предполагая, что при потенциале покоя (ПП) суммарный ионный ток равен нулю Ходжкин, Гольдман и Катц вывели уравнение: K Na Cl e e i п K Na Cl i i e P K P Na P Cl RT ПП F P K P Na P Cl , где: [К + ] i , [Na + ] i , [Сl ] i и [К + ] e [Na + ] e и [Cl ] e – концентрации внутриклеточных – intra и внеклеточных ионов – extra соответственно, P K, P Na и P Cl – проницаемость соответствующих ионов. Для ПП гигантского аксона кальмара соотношение: 45 , 0 : 04 , 0 : 1 : : Cl Na K P P P Таким образом, ПП имеет в основном калиевую природу, что и определяет его вклад в изменения мембранного потенциала при модуляции концентрации ионов калия. Распределение ионов между клеткой и средой при ПП устанавливается на постоянном уровне, и суммарный ионный ток равняется нулю: 0 Cl K Na I I I Постоянно существующий градиент, поддерживающий пассивный поток ионов через клеточную мембрану, требует процессов, его восстанавливающих. Их выполняет система активного транспорта – Mg 2+ - зависимая Na + /K + –АТФ-аза, которая осуществляет противоградиентный транспорт ионов Na + и K + . Энергозависимый процесс происходит в режиме одновременного выброса 3-х ионов Na + из клетки и закачивания 2-х ионов K + внутрь. Создание дополнительного дефицита внутриклеточного содержимого в положительном заряде позволило режим работы данной системы, кроме энергозависимого, считать еще и электрогенным. Потенциал действия (ПД) Раздражение, как уже упоминалось, лишь при достижении порога возбуждения вызывает самоподдерживающийся процесс изменения значений биопотенциалов в клетке – потенциал действия. Пороговые условия начала развития ПД определяются многочисленными условиями (законами), 106 подробно рассмотренными в соответствующих электрофизиологических литературных разделах. Например, они включают в себя силу (амплитуду) и длительность раздражающего стимула. Взаимосвязь этих параметров представляет собой известную гиперболическую зависимость "сила – длительность" ( Рис. 19). Рис. 19. Зависимость сила – длительность по оси абсцисс – длительность стимула; по оси ординат – амплитуда стимула. С – полезное время; А – хроноксия; О – реобаза Такие характеристики, как полезное время, реобаза, хронаксия являются общими для электровозбудимых тканей (там же). Электротонический потенциал и локальный ответ. Изменения, проходящие на мембране при действии раздражения до порогового уровня, проявляются в виде электротонического потенциала и локального ответа. Электротонический потенциал представляет собой изменения пассивных (омических и емкостных) электрических характеристик мембран в ответ на раздражение, амплитуда которого меньше 50 – 70% пороговых (100%) значений. Локальный ответ представляет собой изменения подпороговых активных (ионная проницаемость) электрических характеристик мембран в ответ на раздражение, амплитуда которого ниже пороговых значений. Таким образом, основной причиной инициации процесса развития ПД является достижение критического (порогового) уровня смещения мембранного потенциала. Современные методы регистрации биопотенциалов Регистрация биопотенциалов осуществляется с помощью специальных методов исследования электровозбудимых мембран, различающиеся вне- и внутриклеточными способами отведения мембранного потенциала. Исследования ПД методами внеклеточного отведения в настоящее время производятся редко, так как они имеют один существенный недостаток, мешающий регистрировать электрические параметры одной клетки. Он проявляется в значительном внеклеточном шунтировании параметров потенциала из-за недостаточно плотного контакта регистрирующего устройства с биологической мембраной. С другой 107 стороны, простота и доступность этого способа регистрации электрических параметров позволило его широко использовать в диагностической практике для регистрации суммарного потенциала электровозбудимых тканей (ЭКГ, ЭМГ, ЭЭГ и т.д.). Метод сахарозного мостика является внеклеточным способом регистрации параметров ПД. Использование изолирующих межклеточные участки сахарозных протоков (мостиков) позволяет ограничить внеклеточное шунтирование и достаточно уверенно регистрировать параметры биопотенциалов ( Рис. 20). Рис. 20. Схема метода двойного сахарозного мостика 1 – биологический объект; 2 – изолирующие межклеточные участки сахарозных протоков (мостиков) 3 – рабочая камера (поток раствора Кребса); 4 – регистрирующие электроды; 5 – раздражающие электроды. Основное развитие в настоящее время получила техника внутриклеточного отведения параметров биопотенциалов. С помощью микроэлектродов, много меньших, чем гигантские одиночные клетки по размерам (0,5-1 мкм против 100 мкм), прокалывалась биологическая мембрана, и регистрировались электрические параметры внутриклеточного содержимого (Рис.8). Изменение материалов, из которых изготовлялись микроэлектроды, происходило одновременно с техническим прогрессом по пути использования металлов, стекла, полимеров и снова стекла. Применимость и точность этого способа регистрации мембранных потенциалов подтверждают уникальные эксперименты многократного введения микроэлектродов внутрь одной клетки при незначительном изменении значений биопотенциалов. Возможности микроэлектродной техники позволили регистрировать ионный ток, протекающий через мембрану в момент развития ПД. Для этого использовался метод фиксации потенциала (clamp-voltage), представляющий электронную схему поддержания постоянного уровня мембранного потенциала за счет источника обратной Э.Д.С., включенной через усилитель 108 с обратной связью. На Рис. 21 представлен один из вариантов такой схемы с соответствующими блоками и объектом – биологической мембраной. Рис. 21. Метод фиксации потенциала (объяснения в тексте) Точные измерения значений ионных токов из-за своих малых величин при методе clamp-voltage осложнялись возможностью их шунтирования на границе микроэлектрод-мембрана, существующей даже при достаточно высоком мегаомном (10 6 Ом·см) удельном сопротивлении контакта с клеткой. Настоящий прорыв в данной области был совершен при достижении контакта с клеткой гигаомных (10 9 Ом·см) значений удельного сопротивления контакта микроэлектрода и объекта. Особые материалы и способы заточки микроэлектродов позволили регистрировать на целой клетке (whole cell) и на участках мембраны (patch clamp) динамику одиночных ионных токов. Возможные модификации этого метода представлены на Рис. 22. Рис. 22. Модификации метода patch clamp на целой клетке 1 – whole cell 2 – patch clamp inside 3 – patch clamp outside Ионная природа потенциала действия (ПД). Формальное описание ионных токов ПД, регистрируемый впервые на гигантском (до 500 мкм в диаметре) аксоне кальмара, состоит из нескольких фаз (Рис. 23). 109 Рис. 23. Фазы потенциал действия и ионные токи аксона кальмара Исходно от уровня потенциала покоя (-90 мВ) начинается I-я фаза деполяризации, сменяющаяся на уровне нулевого (0 мВ) мембранного потенциала противоположным знаком овершутом (+ 40 мВ) и затем переходящая в II-ю фазу реполяризации по пути возвращения значений мембранного потенциала к потенциалу покоя. Отклонения от пути возвращения называют III-й фазой – следовым потенциалом: а) положительным – при продолжающейся реполяризации. б) отрицательный – при развитии деполяризации. Метод фиксации потенциала и модификации ионного состава растворов позволили вскрыть ионные механизмы каждой фазы ПД. Основное участие в развитии фазы деполяризации принимает входящий в клетку поток положительных ионов натрия (Na + ), перезаряжающих внутреннюю поверхность мембраны. На смену быстрой активации натриевой проницаемости пороговым раздражителем приходят процессы инактивации входа Na + и активации выхода из клетки ионов калия (K + ), что проявляется фазой реполяризации – возвращения зарядов на внутренней поверхности мембраны к отрицательным значениям. С помощью ряда упрощений Ходжкину и Хаксли (1950) в виде уравнений удалось произвести формальное (математическое) описание кинетики ионных токов электровозбудимой мембраны. По их мнению, ионный ток (I) складывается из суммы натриевого (I Na ) калиевого (I K ) и тока утечки (I l ): , L K Na I I I I В отличие от натриевого и калиевого тока, ток утечки не подчиняется потенциал-зависимым механизмам активации и инактивации. Каждый из токов рассчитывается по закону Ома: ), ( Na Na Na V V g I 110 ), ( K K K V V g I ), ( L L L V V g I где: g Na, g K и g l – проводимость для ионов натрия, калия и ионов утечки соответственно. (V-V (Na,K,L) ) – величины электрохимических потенциалов для соответствующих ионов, где V – является отклонением от абсолютных значений мембранного потенциала Е, а V (Na,K,L) ) – равновесные потенциалы, рассчитанные по уравнению Нернста. С помощью выражений: m E E V и соответственно: , ) , , ( ) , , ( m L K Na L K Na E E V откуда: , ) , , ( ) , , ( L K Na L K Na V V E E Для гигантского аксона кальмара: Е Na =+55мВ, Е K = -72мВ, Е L = -50мВ. В свою очередь, величины ионных проводимостей мембраны равны: , 3 h m g g Na Na , 4 n g g K K где: g Na и g K – максимальные проводимости мембраны (при сильной деполяризации ĝ Na = 120 мСм /см 2 , ĝ К = 36 мСм/ см 2 , g l = 0,3 мСм/с м 2 ) для ионов натрия и калия соответственно. Величины m и n – переменные процесса активации, h – переменная инактивации. Их значения в зависимости от мембранного потенциала изменяются в пределах от 0 до 1 и рассчитываются из системы дифференциальных уравнений: , ) 1 ( m m dt dm m m , ) 1 ( n n dt dn n n 111 , ) 1 ( h h dt dh h h где m , m , n, n , h , h - константы скоростей, зависящие от мембранного потенциала, температуры и концентрации двухвалентных ионов в наружном растворе, но не от времени. При деполяризации мембраны значения m , n и h увеличиваются, а m , n и h - уменьшаются. Решения этих уравнений проще представить в виде экспоненциальных характеристик – постоянных времени изменения m, n и h: , 1 m m m , 1 n n n 1 h h h Стационарные значения переменных m, n и h будут равны: m m m m , n n n n , h h h h Графики зависимости стационарных значений m, n и h (m , n и h ) и постоянных времени m , n и h от мембранного потенциала представлены на Рис. 24. Рис. 24. Зависимости стационарных значений m, n и h (m , n и h ) и постоянных времени m , n и h от мембранного потенциала На основании представленных выше теоретических выкладок Ходжкиным и Хаксли были рассчитаны параметры потенциала действия, которые сравнивались с экспериментальными. В состав мембранного тока (I m ) кроме ионной компоненты входит и емкостная составляющая: dt dV C I c и тогда: 112 K Na m I I dt dV C I При поддержании потенциала на постоянном уровне (метод clamp- voltage) емкостная составляющая исчезает, и мембранный ток удается зарегистрировать как сумму натриевого и калиевого ионных токов (Рис. 23) Использование блокаторов ионных каналов позволило получить отдельные вольтамперные характеристики для натриевого и калиевого ионных токов и вскрыть ионные механизмы развития потенциала действия. На Рис. видно, что отличия рассчитанных и экспериментальных параметров незначительны. Показанные изменения ионных проницаемостей (а) и ионных токов (б), рассчитанные с помощью уравнений Ходжкина–Хаксли при возникновении ПД в гигантском аксоне кальмара в ответ на очень короткий стимул позволили избежать емкостной составляющей мембранного тока. Видно, что первый нуль I i соответствует моменту, когда входящий натриевый ток становится равным выходящему ионному току I l +I K . Это момент критической деполяризации, когда локальный ответ начинает переходить в ПД. В начале этого периода P Na и I Na совпадают с началом развития ПД, однако, затем ход изменений их становится разным: 1. Изменения P Na имеют одну вершину, совпадающую в максимальной точке с вершиной ПД. 2. Кривая изменений I Na характеризуется двумя максимумами, из которых один приходится на примерно на середину восходящего ПД, а второй – на первую треть фазы реполяризации. Вершине ПД соответствует точка наибольшего падения кривой I Na в области «седла» между двумя ее вершинами. Различия в динамике изменения между P Na и I Na обусловлены тем, P Na является прямым следствием деполяризации в момент ПД, а I Na зависит также от электрохимического потенциала (V-V Na ), величина которого по мере деполяризации снижается. В результате продолжающего компенсаторного возрастания P Na , I Na продолжает нарастать до момента выравнивания V и V Na , когда суммарный ионный ток (I i ) и изменения ПД достигают максимума. Наличие емкостных свойств мембраны позволяет ПД нарастать еще некоторое время, даже в отсутствии усиления I i . Остановка в нарастании ПД будет происходить при равенстве плотностей выходящих и входящих ионных токов, что соответствует максимальной величине ПД. Преобладание выходящей компоненты ионных токов будет приводить развитию фазы реполяризации, которая будет замедляться вторичным повышением I Na , связанным с увеличением электрохимического потенциала (V-V Na ) при еще достаточно высоком P Na . В фазу реполяризации P Na падает сначала круто, а затем, более полого из-за усиления инактивации деполяризованной мембраны. Расчеты, проведенные позже на миелиновых нервных волокнах в области перехвата Ранвье показали, что кинетика изменений ионных 113 проницаемостей в момент развития ПД качественно не отличается от таковой в гигантском аксоне кальмара (см. выше). Следует отметить характерную для перехватов Раньве более высокую (3 раза) скорость нарастания ПД. Известные же отличия в скорости проведения по мякотным и безмякотным нервным волокнам определяются, как показывают дальнейшие расчеты, параметрами сопротивления и емкости мембраны с таковыми в перехватах Ранвье. При высоких сопротивлениях миелиновой оболочки (до ГОм·см 2 ), в области перехватов низко сопротивление мембраны (см. ниже). |