Лекции по биофизике. Лекции по биофизике учебнометодическое пособие
 Скачать 1.98 Mb.
|
|
V. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БИОМЕМБРАН Введение Еще в 30-х годах ХХ века наличие дифференцированной мембранной структуры на поверхности клеток представлялось далеко не бесспорным. Прямые морфологические доказательства наличия мембраны были немногочисленны или отсутствовали. Первые указания на свойства клеточной поверхности, лимитирующей диффузию красителя внутрь клетки, сделал в середине XIX века К. В. Нагели. Он также показал, что клетки проявляют осмотические свойства: набухают в разбавленных растворах и сжимаются в концентрированных. Морфологические данные о существовании клеточной мембраны были получены только после разработки методов приготовления ультратонких срезов тканей. В настоящее время не вызывает сомнений, что биологические мембраны образуют наружную оболочку всех живых клеток, а также участвуют в формировании многочисленных внутриклеточных органелл. Мембраны выполняют многочисленные функции, обеспечивая целостность клеток и тканей и их активность. Функции биологических мембран Основные функции (выполняются всеми без исключения мембранами): 1. Компартментализация – участие мембран в образовании изолированных отсеков (компартментов). Мембраны всегда образуют замкнутые структуры, самая крупная из них – цитоплазматическая мембрана. 2. Барьерная функция – препятствие свободной диффузии различных веществ. В результате мембрана регулирует перенос веществ и их содержание в клеточных и субклеточных компартментах. 3. Рецепторная (сигнальная) функция – связывание мембранными рецепторами внеклеточных эффекторов – биологически (физиологически) активных веществ, что приводит к изменению активности регуляторных белков клетки. 4. Ферментативная функция обеспечивается мембранно-связанными белками-ферментами, которые образуют своеобразные конвейеры. 5. Факультативные функции, присущие не всем мембранам: Транспорт электронов и фосфорилирование в дыхательной цепи (способны выполнять мембраны митохондрий, хлоропластов). Преобразование внешних стимулов в электрические импульсы. Проведение биоэлектрических импульсов (характерны для мембран электровозбудимых клеток: нервной и мышечной ткани). Высвобождение синаптических нейромедиаторов и пиноцитоз. 68 Химический состав мембран Исследования показали, что основными химическими компонентами мембран являются липиды ( 30%), белки ( 60%) и углеводы ( 10%). Минорными компонентами мембран являются нуклеиновые кислоты, полиамины, неорганические ионы. Липиды, входящие в состав мембран, принадлежат к трем классам. Это фосфолипиды, гликолипиды и стероиды. Фосфолипидыпостроены по единому плану, их молекула имеет полярную головку и два неполярных хвоста. В состав головки фосфолипида обязательно входят: А) остаток спирта (реже аминокислоты); Б) остаток фосфорной кислоты; В) по вариантам, либо: - глицерин (глицерофосфолипиды), - многоатомный спирт сфингозин (сфингофосфолипиды). Неполярные хвосты всех молекул фосфолипидов образуются жирными кислотами, определяющими разнообразие их представительства. Глицерофосфолипиды мембран растительных клеток содержат в основном пальмитиновую (С 16:1(9) ), олеиновую (С 18:1(9) ), линолевую (С 18:2(9,12) ) жирные кислоты. Жирные кислоты с количеством атомов углерода более 20 – 24 в растительных клетках встречаются редко. Глицерофосфолипиды мембран животных клеток содержат пальмитиновую, олеиновую, стеариновую (С 18:0 ) жирные кислоты, а также кислоты (арахидоновая и др.) с числом атомов углерода, превышающим 20. Обычно из двух жирных кислот, образующих гидрофобный хвост глицерофосфолипида, одна ненасыщенная. Она образует связь со вторым атомом углерода глицерина и одна из ее двойных связей обязательно находится на уровне 9 атома углерода, считая от головки. Остаток спирта (аминокислоты) головки глицерофосфолипида связан сложноэфирной связью с фосфорной кислотой. Глицерофосфолипид, лишенный спирта (аминокислоты), называется фосфатидной кислотой, которая является промежуточным продуктом в биосинтезе фосфолипидов и в свободном виде практически не встречается. В зависимости от того, какой именно спирт (аминокислота) входит в состав головки молекулы, различают несколько классов глицерофосфолипидов. Самые распространенные: фосфатидилхолин, содержащий спирт холин; фосфатидилэтаноламин, содержащий спирт этаноламин; фосфатидилинозитол, содержащий циклический спирт инозитол; фосфатидилсерин, содержащий остаток гидроксиаминокислоты – серина. Примерами сфингофосфолипидов могут служить сфингомиелины, которые в составе полярной головки содержат фосфохолин или фосфоэтаноламин. В составе сфингофосфолипидов одна жирная кислота. 69 Роль второго неполярного хвоста выполняют углеродные структуры многоатомного спирта сфингозина. Таким образом, фосфолипиды содержат группировки двух видов – полярные гидрофильные головки и неполярные гидрофобные хвосты. Вследствие этого фосфолипиды обладают амфипатическими свойствами. При рН = 7 остаток фосфорной кислоты в полярной головке заряжен отрицательно. Гликолипиды – липиды, содержащие 2 остатка жирных кислот, спирт сфингозин и остатки моно- (цереброзиды) или олигосахаров (ганглиозиды). Стероиды содержат стероидное ядро, образованное тремя гексагональными полностью насыщенными кольцами и одним циклопентановым кольцом. Стероиды представлены в основном холестерином (в животных клетках) или ситостерином и стигмастерином (в растительных клетках). Физиологическая роль различных классов липидов Фосфолипиды выполняют структурную функцию, образуя липидный бислой мембраны. Кроме этого, они могут выполнять и важные физиологические функции. Так, арахидоновая кислота, состоящая из цепи с 20 атомами углерода и с 4 двойными связями, входящая в состав фосфолипидов, служит предшественником таких биологически активных веществ, как простагландины. Гликолипиды широко представлены в различных тканях, в частности, в нервной. Они локализованы преимущественно на наружной поверхности цитоплазматической мембраны, где их углеводные компоненты входят в число других углеводов клеточной поверхности. Ганглиозиды участвуют в дифференцировке нейрональной ткани. Ганглиозиды других клеток определяют видоспецифичность и регулируют межклеточные контакты. В иммуннокомпетентных клетках они участвуют в формировании иммунной реакции. Холестерин выполняет важную роль в модификации бислоя: он, в частности, регулирует упаковку и подвижность фосфолипидов мембраны. Кроме того, холестерин служит предшественником в образовании половых гормонов, гормонов коры надпочечников, а также желчных кислот. Липид–липидные взаимодействия. Динамика липидов в мембране Длина растянутой углеводородной цепи жирной кислоты, состоящей из 18 атомов углерода, составляет 2 нм, на полярную головку приходится еще 0,5 – 0,7 нм, следовательно, толщина бислоя липидов должна превышать 4 нм, но в действительности толщина двойного слоя липидов оказывается равной 3,5 – 4 нм. Причиной обнаруженного феномена является рыхлое, а не упорядоченное расположения остатков жирных кислот. Раз одна из двух жирных кислот, образующих гидрофобный хвост, ненасыщенная, как правило, увеличивается вероятность образования цис-конформации. Наличие цис-изомеров жирных кислот в составе фосфолипидов, а также высокая скорость вращения вокруг С-С связей жирно-кислотных радикалов 70 (например, частота вращения вокруг единичной С–С связи составляет 10 10, а вокруг двойной С=С связи – 10 8 с -1) обеспечивают неупорядоченное расположение гидрофобных хвостов. Различные конфигурации молекул жирных кислот, возникающие при поворотах вокруг С-С связей, называют ротамерами или конформерами. Процесс изменения конформации молекул за счет таких поворотов называется транс-гош-изомеризацией. Гош- конформация (―гош‖ – скошенный) аналогична цис-конформации. Вероятность транс-гош-перехода весьма велика и еще более возрастает при увеличении температуры. При переходе из транс- в гош-конформацию образуются складки или кинки (от англ. kink – петля). Такого рода изменения способны захватывать целые кластеры мембранных липидов. Считается, что именно с образованием кинков связан транспорт воды и других веществ через мембраны. Липиды способны совершать вращательные движения вокруг оси молекулы (вращательная диффузия), перемещаться вдоль одного слоя (латеральная диффузия), а также перемещаться из одного слоя в другой (трансмембранный переход или флип-флоп). Наибольшую скорость имеют вращательная и латеральная диффузия. Например, коэффициент латеральной диффузии составляет 1,8×10 -8 см 2 с -1. Это соответствует частоте парных перестановок соседних молекул 10 7 с -1. Наиболее медленным процессом является флип-флоп, что связано с высоким уровнем энергии, необходимой для проталкивания заряженных полярных головок через средний углеводородный слой мембраны. Поперечная диффузия молекул фосфолипидов на расстояние 5 нм занимает в 10 9 раз больше времени, чем диффузия на то же расстояние в латеральном направлении. Рис. 8. Виды диффузии липидов в мембране 1 – латеральная диффузия; 2 – трансмембранный переход или флип-флоп; 3 – вращательная диффузия. Сочетание быстрой диффузии молекул липидов вдоль мембраны и медленной диффузии поперек мембраны имеет большое значение для функционирования мембран. Благодаря этому поддерживается упорядоченность в молекулярной структуре мембраны, определенная ориентация белков поперек мембраны, что имеет значение для направленного переноса веществ через мембрану, кроме того, обеспечивается асимметрия бислоя липидов. Функциональная асимметрия мембраны – один из важнейших аспектов, характеризующих липид – 71 липидные взаимодействия. Асимметрия бислоя означает, что состав липидов каждого из слоев неодинаков. Фазовые переходы липидов В водной среде липидные структуры часто ведут себя как жидкие кристаллы – обладают анизотропией и некоторыми признаками упорядоченности. Это связано с тем, что они в качестве двуцепочечных амфифильных (амфипатических) молекул способны образовывать двойные слои в водной среде. Полярные головки при этом обращены в водную среду, а неполярные хвосты создают гидрофобную среду. Бислой обладает свойствами лиотропного мезоморфизма (зависимость состояния от гидратации) и термотропного мезоморфизма (зависимость состояния от температуры). Эти свойства связаны друг с другом – температура фазового перехода зависит от степени гидратации, а так же от рН, электрического заряда и от ионного состава раствора. При достижении критической температуры в липидном бислое происходит фазовый переход из состояния жидкого кристалла в гель и обратно. В полностью однородном бислое (состоящем из одного типа липидных молекул) фазовые переходы являются кооперативными. То есть в узком температурном интервале им охватывается весь бислой. В момент фазового перехода возрастает подвижность полярных головок и гидрофобных хвостов, меняется геометрия бислоя – увеличивается его площадь и возрастает гидрофобный объѐм мембраны. Фазовые переходы в мембране, обладают склонностью к кооперативности, то есть к генерализации с помощью так называемых конформационно–чувствительных сигналов. Белки мембраны и их функции Доля белка в общей массе мембраны может колебаться в очень широких пределах – от 18% в миелине до 75% в митохондриальной мембране. По расположению в мембране белки можно разделить на: интегральные и периферические. Интегральные белки являются, как правило, гидрофобными и легко встраиваются в липидный бислой. Рис. 9. Классификация белков по месту их расположения в мембране 1 – периферические 2 – интегральные 3 – полуинтегральные 72 Взаимодействие такого белка с мембраной происходит в несколько стадий. Сначала белок адсорбируется на поверхности бислоя, изменяет свою конформацию, устанавливая гидрофобный контакт с мембраной. Затем происходит внедрение белка в бислой. Глубина внедрения зависит от силы гидрофобного взаимодействия и соотношения гидрофобных и гидрофильных участков на поверхности белковой глобулы. Гидрофильные участки белка взаимодействуют с примембранными слоями по одну или обе стороны мембраны. Фиксация белковой глобулы в мембране происходит благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям. Углеводная часть белковых молекул (если она имеется) выступает наружу. Интегральные белки в силу тесной связи с бислоем оказывают на него существенное воздействие: конформационные перестройки белка приводят к изменению состояния липидов, так называемой деформации бислоя. Периферические белки обладают меньшей глубиной проникновения в липидный бислой, и, соответственно, более слабо взаимодействуют с липидами мембраны, оказывая, на них гораздо меньшее воздействие, чем интегральные. По характеру взаимодействия с мембраной белки делятся на монотопические, битопические, политопические: монотопические белки взаимодействуют с поверхностью мембраны (моно – одним из слоев липидов); битопические пронизывают мембрану насквозь (би – двумя слоями липидов); политопические пронизывают мембрану несколько раз (поли- многократное взаимодействие с липидами). Понятно, что первые относятся к периферическим белкам, а вторые и третьи к интегральным. Белки мембран можно так же классифицировать по выполняемой ими функции. В связи с этим выделяют структурные белки: белки – ферменты; белки – рецепторы; транспортные белки. Особую группу составляют белки цитоскелета клетки. Строго говоря, эти белки не являются компонентами мембраны, примыкая к ней с цитоплазматической стороны. Белки цитоскелета входят в состав всех его компонентов: миофиламенты содержат молекулы белка актина; в состав микротрубочек входит белок тубулин, промежуточные филаменты также содерждат более полиморфный белковый комплекс. Цитоскелет не только обеспечивают эластичность мембраны, противостоят изменениям объема клетки, но, по-видимому, участвует в и различных внутри- и внеклеточных механизмах регуляции. 73 Модель биологических мембран Первоначальные представления о существовании мембран опирались на физиологические исследования. Первые указания на лимитирующие диффузию свойства клеточной поверхности были получены в середине XIX века К.В.Нагели. Он отметил, что клеточная поверхность является барьером для свободной диффузии красителей внутрь клетки из внеклеточной жидкости. Кроме того, Нагели обнаружил, что клетки проявляют осмотические свойства. На основании этих наблюдений К.В.Нагели предположил, что существует некая плазматическая мембрана. Используя эритроциты в качестве осмометра, Э.Овертон в конце XIX века выявил тесную взаимосвязь между растворимостью вещества в липидах и его способностью проникать в клетку: чем больше эта растворимость, тем меньший осмотический эффект оказывает вещество. Эти данные явились первым свидетельством того, что мембраны содержат большое количество липидов. Морфологические данные о существовании клеточной мембраны были получены только после разработки методов приготовления ультратонких срезов тканей, фиксированных химическими методами для проведения электронно-микроскопических исследований. Тонкая структура мембран была исследована с помощью метода замораживания – скалывания. Первыми авторами, которые предложили модель структурной организации мембраны, были Э. Гортер и Ф. Грендель (1925). Они экстрагировали липиды из теней эритроцитов и приготовляли из них мономолекулярную плѐнку на поверхности воды. Амфифильные молекулы липидов распределялись таким образом, что их полярные головки были погружены в воду, а неполярные хвосты торчали наружу. Пленку диспергированных молекул на поверхности воды аккуратно сжимали в латеральном направлении и измеряли силу сжатия. Резкое возрастание этой силы происходило в момент формирования компактного монослоя. Оказалось, что площадь, занимаемая монослоем, в 2 раза превышала поверхность эритроцитов, взятых для экстракции. Именно это послужило основанием для создания Э. Гортером и Ф. Гренделем концепции липидного бислоя, которая впоследствии легла в основу всех дальнейших представлений о структуре мембран. Измерение поверхностного натяжения липидного бислоя показало, что оно гораздо больше, чем в мембране эритроцитов, и снижается при добавлении в бислой белков. На основании этих данных в 1931 году Дж. Ф. Даниэлли предложил модель «сэндвича» или унитарную мембранную модель. По его представлениям, белки покрывают обе поверхности липидного бислоя, связываясь с ним электростатическими силами. Из расчѐтов выходило, что белки находятся на мембране в фибриллярной форме. Этой модели неплохо соответствует миелин – мембрана леммоцитов. 74 Робертсон несколько модифицировал модель Даниэлли (1964), предположив, что глобулярные белки находятся на внешней стороне мембраны, а фибриллярные белки на внутренней. Однако с термодинамической точки зрения маловероятно, что белок может успешно конкурировать с водой за полярные головки липидных молекул и что слой белка смог бы экранировать их от водного окружения. Современные методы исследования окончательно опровергли «бутербродную модель» мембраны. На сегодняшний день общепризнанной является «мозаичная» модель мембраны, предложенная в 1972 году С. Сингером и Г. Николсоном. Основанием для создания жидкостно-мозаичной модели мембраны послужили данные следующих исследований. Оптические наблюдения показали, что мембранные белки имеют глобулярную структуру. Было установлено, что некоторые белковые молекулы свободно диффундируют в латеральном направлении, т.е. в плоскости мембраны. Исследования с использованием изотопов и др. показали, что белковые молекулы или их части, экспонированные с одной стороны мембраны, отличаются от других, выходящих на другую сторону мембраны. Согласно этой модели, глобулярные белки интегрированы в липидный бислой; при этом одни из них пронизывают его насквозь, другие лишь частично погружены в бислой. Мембрана является лабильной структурой, все еѐ компоненты имеют возможность осуществлять различные формы подвижности – латеральную диффузию, вращательные движения, «флип– флоп» переходы и другие. Жидкостно-мозаичная модель, по-видимому, дает наиболее адекватные представления о структурной организации поверхностной мембраны и многих внутриклеточных мембран. Рис. 10. Жидкостно-мозаичная модель биологической мембраны. 1 – липидный бислой; 2 – полуинтегральные белки; 3 – интегральные белки; 4 – периферические белки; 5 – углеводы. |