Лекции по биофизике. Лекции по биофизике учебнометодическое пособие
 Скачать 1.98 Mb.
|
|
Люминесценция (флюоресценция и фосфоресценция), ее механизмы, законы и методы исследования Высвечивание кванта света при переходе с возбужденного состояния в основное называется люминесценцией. Она подразделяется нафлюоресценцию и фосфоресценцию. Флюоресценция – высвечивание кванта света при переходе с нижнего возбужденного синглетного состояния в основное. Переход с высшего возбужденного синглетного уровня на нижний синглетный возбужденный уровень сопровождается выделением тепла и называется внутренней конверсией. Характеристики флюоресценции: Спектр флюоресценции: зависимость интенсивности флюоресценции от длины волны. Квантовый выход флюоресценции: отношение числа квантов высветившихся к числу квантов поглощенных. Время жизни кванта флюоресценции 10 -8 – 10 -9 сек. Законы флюоресценции: Закон Стокса: спектр флюоресценции сдвинут в длинноволновую область по сравнению со спектром поглощения. Правило Левшина: коротковолновая часть спектра флюоресценции симметрична длинноволновой области спектра поглощения. Закон Вавилова: квантовый выход флюоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света. Методы изучения: флюорометрические исследования отличают от спектрофотометрических необходимость применения особого светофильтра после объекта, не пропускающего длину волны возбуждающего света, но позволяющего регистрировать длину волны флюоресценции образца. Фосфоресценция – высвечивание кванта света при переходе с триплетного уровня в основное состояние. Переход с высшего синглетного возбужденного 46 уровня на триплетный уровень сопровождается выделением тепла и называется интеркомбинационной конверсией (Рис. 3). Характеристики и законы фосфоресценции – те же, что и для флюоресценции. Рис. 4. Спектральные характеристики при поглощении света (1) и его люминесценции (2). По оси абсцисс – длина волны По оси ординат – оптическая плотность. Миграция энергии. Виды и условия миграции. Правила Ферстера Миграция энергии – безизлучательный обмен энергией между возбужденной молекулой (донором) и молекулой в основном состоянии (акцептор) без кинетических соударений донора и акцептора и на расстояния, превышающие межатомные. Виды миграции: 1. Индуктивно-резонансная миграция. Для этого необходимо, чтобы донор и акцептор имели одинаковые разности энергии между определенными энергетическими уровнями, взаимодействие должно быть достаточно интенсивным. Выполняется при 3-х правилах Ферстера: Донор должен обладать способностью к флюоресценции. Длинноволновая часть спектра флюоресценции донора должен перекрываться с коротковолновой частью спектра поглощения акцептора. Донор и акцептор должны располагаться на определенном (не далее 2 нм) расстоянии друг от друга. 2. Обменно-резонансный тип миграции происходит в результате переноса энергии с триплетного уровня донора на триплетный уровень акцептора, происходит при перекрывании триплетных уровней на расстоянии 1-2 нм. 3. Полупроводниковая миграция энергии. Полупроводники характеризуются наличием валентной зоны, зоны проводимости, которые разделены 47 запрещенной зоной. Переход из валентной зоны в зону проводимости может произойти вследствие влияния кванта света (фотопроводимость). 4. Экситонная миграция наблюдается в кристаллах. Пара «электрон – дырка» называется экситоном. Переноса заряда нет. Методы исследования миграции энергииоснованы на том, что при этом процессе поглощает свет одно вещество, а люминесцирует - другое. Сенсибилизированная люминесценция: h A погл * A ; B A* * B A ; * B h B* фл Сенсибилизированная фотохимическая реакция: h A погл * A ; B A* * B A ; * B C – фотохимическая реакция. Фотохимические реакции. Законы фотохимии Фотохимическими реакциями называют реакции, идущие под действием света. В этом случае энергия поглощенного кванта трансформируется в энергию химической связи. Виды фотохимических реакций: Фотоокисление (в фотосинтезе) Фотовосстановление Фотоизомеризация (реакции превращения фотопигмента в палочках) Фотодиссоциация Законы фотохимии: 1. Гротгуса – Дрейпера: фотохимическое действие оказывает поглощенный свет. 2. Эквивалентности: один квант вызывает один фотохимический акт. 3. Правило Бунзена – Роско: количество фотопродукта зависит от дозы облучения P=I t. n n t I t I t I 2 2 1 1 , то n P P P 2 1 Скорость фотохимических реакций пропорциональна количеству квантов, поглощенных в единицу времени: dt dN dt dc Но следует учесть, что не все поглощенные кванты вызывают фотохимическую реакцию, поэтому следует учесть квантовый выход реакции – 48 , определяющий отношение числа квантов участвующих в химической реакции к общему числу поглощенных квантов. В результате скорость будет равна: dt dN dt dc Скорость поглощения квантов пропорциональна интенсивности падающего света (I 0 ), концентрации вещества (c), участвующего в поглощении и эффективному поперечному сечению молекулы – площади (S):, при попадании в которую, квант поглощается: c I S dt dN 0 С учетом квантового выхода реакции, уравнение примет вид: c I S dt dc 0 Решая дифференциальное уравнения имеем: dt I S c dc 0 ; и далее, интегрируя, имеем: dt I S c dc 0 В итоге с учетом константы интегрирования: t SI e c c 0 0 s = – поперечное сечение фотореакции, это площадь, при попадании в которую, квант не только поглощается, но и вызывает реакцию. Можно заключить, что концентрация реагирующего вещества убывает экспоненциально в зависимости от интенсивности действующего света. Задачи 1. Через пластинку из прозрачного вещества толщиной l = 4,2 см проходит половина падающего на нее светового потока. Определите натуральный показатель поглощения данного вещества. Рассеянием света в пластинке пренебречь; считать, что 10% падающей энергии отражается на поверхности пластинки. 2. В 4%-ном растворе вещества в прозрачном растворителе интенсивность света на глубине l 1 = 20мм ослабляется в 2 раза. Во сколько раз ослабляется интенсивность света на глубине l 2 = 30мм в 8%-ном растворе того же вещества? 49 3. Какова концентрация раствора, если одинаковая освещенность фотометрических полей была получена при толщине l 1 = 8мм у эталонного 3%-ного раствора и l 2 = 24мм – у исследуемого раствора? 4. Коэффициент пропускания раствора = 0,3. Чему равна его оптическая плотность? 5. Оптическая плотность раствора D = 0,08. Найдите его коэффициент пропускания. 6. При прохождении света через слой раствора поглощается 1/3 первоначальной световой энергии. Определите коэффициент пропускания и оптическую плотность раствора. 7. При прохождении монохроматического света через слой вещества толщиной l = 15см его интенсивность убывает в 4 раза. Определите показатель рассеяния, если показатель поглощения равен 0,025 см -1 8. Вычислите толщину слоя половинного ослабления параллельного пучка - излучения для воды,если натуральный показатель ослабления ' = 0,053см -1 9. Интенсивность света, прошедшего через раствор, уменьшилась в 10 раз. Известно, что данное вещество имеет молярный показатель поглощения на данной длине волны, равный 500. Длина кюветы с раствором 1см. Найдите концентрацию вещества в растворе. 10. Чему равен молярный показатель поглощения вещества, на длине волны 400 нм, если при прохождении света через раствор с концентрацией 0,5М интенсивность света уменьшилась в 10 раз? Длина кюветы 0,3 см. Ответы на задачи 1. 0,14 см -1 . 2. N = 8. 3. 1%. 4. 0,52. 5. 0,83. 6. 0,67; 0,18. 7. 0,015 см -1 . 8. 13,1 см. 9. 0,46 М. 10. 1500 л/(М . м). Тест–задания 1. Предметом фотобиологии является воздействие на биологические системы: A. Гамма - излучения B. ультрафиолетового и видимого излучения C. рентгеновских лучей D. медленных нейтронов 2. Физиологические фотохимические процессы подразделяются на следующие группы: A. Энергетические B. Двигательные 50 C. Информационные D. Фотосинтетические E. Дегидратационные 3. Деструктивно - модификационные фотохимические процессы подразделяются на следующие группы: A. Патофизиологические B. Мутационные C. Аллергические D. Летальные 4. Поглощение энергии квантов видимого света происходит на уровне: A. Нейтронов и протонов B. Ядра атома C. Электронов D. Ковалентных связей 5. "Разрешенные" электронные уровни это: A. Величина энергии, которой может обладать электрон B. Расстояние от ядра, на котором может находиться электрон C. Расстояние от соседнего атома до электрона на внешней орбитали 6. Основной электронный уровень: A. Это уровень с максимальной энергией B. Это уровень с минимальной энергией C. Это уровень, максимально удаленный от ядра D. Это уровень, максимально приближенный к ядру 7. Электронный уровень расщепляется на подуровни: A. Индукционные B. Колебательные C. Вращательные 8. Если спины электронов ориентированы параллельно и не компенсируют друг друга, уровень является: A. Синглетным B. Триплетным C. Неравновесным 9. Переход электрона на триплетный уровень возможен: A. С нижележащего синглетного B. С нижележащего триплетного C. С вышележащего синглетного 10. Необходимыми условиями для отражения света являются следующие: A. Одна из сред должна быть прозрачна B. Среды должны находится в различных фазовых состояниях C. Среды должны иметь различные коэффициенты преломления. 11. Явление полного внутреннего отражения наблюдается: A. Когда длинна волны падающего света лежит вне области поглощения B. Когда угол падения света менее критической величины C. Если поверхность является оптически гладкой 51 12. Принцип используемой в медицине оптоволоконной техники основан на: A. Явлении преломления света B. Явлении поглощения света C. Явлении полного внутреннего отражения света 13. Метод молекулярной спектроскопии основан на : A. Явлении преломления света B. Явлении поглощения света C. Явлении полного внутреннего отражения света 14. Молекулярные механизмы преломления света связаны: A. С частичным поглощением квантов света B. С излучением возбужденных атомов C. Со смещением электронов на внешних орбиталях 15. Коэффициент преломления зависит от: A. Молекулярной массы молекул B. Поляризуемости молекул C. Межмолекулярных связей 16. Рефрактометрическая дисперсия - это: A. Зависимость оптической плотности от длинны волны света B. Зависимость поляризации молекул от длинны волны света C. Зависимость показателя преломления от длинны волны света 17. Для определения величины показателя преломления могут быть использованы следующие приборы: A. Гониометр B. Рефрактометр C. Колориметр D. Нефелометр E. Иммерсионный микроскоп 18. Спектр поглощения - это: A. Зависимость оптической плотности от длинны волны света B. Зависимость оптической плотности от длинны оптического пути C. Зависимость оптического пути от длинны волны света 19. Закон Ламберта-Бэра выполняется для: A. любых растворов B. разбавленных растворов C. монохроматического света 20. Виды размена энергии возбужденного состояния атома включают: A. рассеяние в виде тепла B. люминесценцию C. фотохимические процессы D. радиоактивный распад E. миграцию энергии F. фосфорилирование белков Правильные варианты ответов 1. B 2. A, C, D 3. A, B, D 52 4. C 5. A 6. B 7. B, C 8. B 9. C 10. A, C 11. B 12. C 13. C 14. C 15. B 16. C 17. A, B 18. A 19. B, C 20. A, B, C, E 53 IV. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА Предмет молекулярной биофизики Молекулярная биофизика изучает структуру и физические закономерности организации биомакромолекул, силы и связи, обеспечивающие их функции в биологических системах. К биомакромолекулам относят белки и нуклеиновые кислоты. Их молекулярная масса и размеры весьма вариабильны 1-1000 кD. Состоят биомакромолекулы из множества (десятки и сотни тысяч) соединенных ковалентными связями атомных групп. Такая сложность строения требует особых методов исследования. Методы исследования биомакромолекул 1. Методы, связанные с оценкой подвижности макромолекул в растворе, что позволяет судить об их форме и молекулярной массе. Например, оценка поступательной и вращательной диффузии макромолекул. Первая используется для молекул преимущественно сферической формы, вторая – эллипсоидной. Известно, что при движении молекул в растворе возникает сила трения: F = f , где f – коэффициент внутреннего трения (фракционный коэффициент), - скорость. Для сферической макромолекулы эта сила будет равна (формула Стокса): F=6 r, где – вязкость среды, r – радиус молекулы Для определения величины f можно использовать коэффициент диффузии: f T k D 0 и тогда: , 1 6 , 6 0 0 D T k r D T k r f а так как масса молекулы равна: 54 3 0 2 3 1 162 3 4 D T k r m , то есть масса молекулы обратно пропорциональна коэффициенту диффузии в третьей степени. Для макромолекул вытянутой формы используется коэффициент вращательной диффузии 2 0 f T k Q ; для оценки которого используют метод двойного лучепреломления в потоке. Способ определения коэффициента диффузии лежит в основе методов: Квазиупругое рассеяние света. Этот метод основан на свойстве рассеянного света изменять . Изменение при движении молекул приводит к возникновению эффекта Доплера. Получается информация о динамических свойствах молекул (поступательная и вращательная диффузия, внутримолекулярное время релаксации). При спонтанной диффузии молекул, обусловленной тепловым движением молекул, спектр рассеянного света подчиняется распределению Лоренца: , ) ( ) , ( 2 2 2 2 qD w D q N w q I где: I – интенсивность рассеянного света, w – круговая частота (2 ) света, N – число макромолекул в исследуемом объѐме, 2 sin 4 q – фактор рассеяния, D – коэффициент поступательной диффузии, – угол рассеяния света, – молекулярная поляризуемость. Полуширина спектра: 2 sin 4 2 2 2 2 1 D D q w . Измеряя полуширину как функцию sin 2 /2, можно получить коэффициент диффузии D. Сидементация молекул – осаждение веществ в жидкости под действием силы тяжести. 55 Допустим, в пробирке имеются молекулы с молекулярной массой 10 5 , высота столба жидкости 10 -2 м, тогда: 10 4 10 93 , 2 10 38 , 1 , 10 6 , 1 10 10 10 16 , 0 , 10 16 , 0 10 6 10 , 21 2 23 23 2 21 21 26 5 Дж Е Дж Е кг m mgh E ДВИЖЕНЯ ТЕПЛ СЕДИМ Следовательно, тепловая энергия в 200 раз больше энергии седиментации. Для регистрации седиментации нужно увеличить уровень энергии на 4 – 5 порядков, что делают с помощью центрифуги. Обычно используют 350000 g (60-70 тыс.об./мин). dt dx – скорость седиментации. Определяя положение шлирен – пик в различные моменты времени, вычисляют скорость седиментации. На молекулу действуют силы относительно оси вращения ротора: F c – сила сопротивления, F в – сила выталкивания, F ц – центробежная сила. Седиментация заканчивается, когда , 3 4 , 2 3 x w r x mw F F F F Ц С В Ц где m – масса, w-объем, r – радиус молекулы, а F 30 т ц с -1 , n – об/мин. x w r x w m F В 2 0 3 2 0 3 4 |