Лекция по бх. Лекция 3 бх. Лекция 3 клиническая энзимология, или использование ферментов в медицине

• Название: Лекция 3 клиническая энзимология, или использование ферментов в медицине
• Анкор: Лекция по бх
• Дата: 08.10.2019
• Размер: 6.27 Mb.
• Имя файла: Лекция 3 бх.pptx
• Тип: Лекция; #89117

Лекции: ЭНЗИМОЛОГИЯ

Дисциплина: биохимия (Б1.Б.13)

Специальность: лечебное дело (31.05.01)

НГМУ, кафедра медицинской химии

Д.б.н., доцент Суменкова Дина Валерьевна

ЛЕКЦИЯ № 3

КЛИНИЧЕСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ, или ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ

Актуальность темы

Широкое использование ферментов в медицинской практике – диагностике и терапии, - диктует необходимость изучения клинических аспектов энзимологии

План лекции

Применение ферментов как реагентов в диагностике заболеваний
Применение ферментов в качестве лекарственных препаратов (энзимотерапия)
Исследование активности ферментов для диагностики заболеваний (энзимодиагностика)
Дополнительные вопросы клинической энзимологии:
Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
Энзимопатии

Цель лекции

Знать:
пути использования ферментов в медицинской практике (примеры)
ферменты, используемые в энзимодиагностике, и сущность катализируемых ими химических реакций
На основе полученных знаний формируется умение трактовать данные энзимологических исследований сыворотки крови детей и подростков(биохимический анализ крови)

Ферменты как реагенты

ПРИМЕРЫ:

Глюкозооксидаза грибов (аэробная дегидрогеназа ) – FAD-содержащий специфический фермент для определения глюкозы в моче и крови
Используется в глюкозооксидазных биосенсорах


β-D-глюкоза + O2 → глюконолактон + Н2О2

Н2О2 в присутствии ионов меди окисляет фенолфталин до фенолфталеина (красный цвет при рН>7, интенсивность окраски пропорциональна концентрации перекиси и глюкозы)

Ферменты как реагенты

Определение лактата в крови для оценки тяжести шока, гипоксических состояний, сахарного диабета с помощью

лактатоксидазы и пероксидазы

Лактат + O2 → пируват + Н2О2
Н2О2 + 4-аминоантипирин + фенол → окрашенный комплекс

(интенсивность окраски пропорциональна содержанию лактата)

Ферменты как реагенты

Рестриктазы бактерий (специфические эндонуклеазы) используются для исследования генома, например, в пренатальном скрининге наследственных заболеваний
Taq-полимераза термофилов(Thermus aquaticus) необходима для проведения ПЦР-анализа в диагностике наследственных и инфекционных заболеваний, определении родства, судебной медицине

Энзимотерапия

Применение ферментов (гидролазы)

в качестве лекарственных препаратов Заместительная терапия – использование ферментов в случае их недостаточности

ПРИМЕРЫ:

лечение желудочно-кишечных заболеваний, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков

Препараты панкреатических ферментов трипсина, амилазы, липазы: энзистал, мезим форте, фестал, панкреатин, пензитал

Энзимотерапия

Комплексная терапия – применение ферментов в качестве дополнительного терапевтического средства

ПРИМЕРЫ:

фитогидролазы: бромелаин, папаин (широкая субстратная специфичность, широкий диапазон рН)– пищеварение, косметология, рассасывание тромбов, активация иммунитета, удаление «сшивок» между биополимерами

Энзимотерапия

коллагеназа (преп. коллализин)- рассасывание спаек и рубцов (фиброзных процессов) после ожогов и операций
гиалуронидаза (преп. лидаза)- лечение фиброзных процессов, увеличение проницаемости тканей для анестетиков

Энзимотерапия

трипсин, химотрипсин – лечение гнойно-некротических ран, эмфиземы легких, бронхита
фибринолизин (плазмин)– разрушение тромба при тромбозах
РНК-аза и ДНК-аза – противовирусное и антибактериальное действие (аденовирусный конъюктивит, герпетический кератит)

Энзимотерапия

аспарагиназа, глутаминаза – лечение лейкозов
Лейкозные клетки не способны синтезировать асн и глн – аминокислоты, содержащие амидные группы, поэтому получают их из крови. Гидролитическое дезаминирвание данных аминокислот с образованием аспартата и глутамата ограничивает опухолевые клетки в незаменимых для них аминокислотах, что и приводит к нарушению роста опухоли

Трудности энзимотерапии

нестабильность ферментов антигенные свойства трудности доставки к пораженным органам

ПРИМЕР: действие фибринолизина не является строго специфичным (только для белка фибрина – основы тромба), он может повреждать факторы свертывания крови, вызывая геморрагический диатез

Пути решения проблем

Направленный транспорт ферментов
Использование иммобилизованных ферментов

Иммобилизованные ферменты

Иммобилизация (лат. immobilis – неподвижный) – связывание молекул ферментов с носителем
Преимущества: устойчивость, нерастворимость в воде, пролонгированное действие, возможность многократного использования
Носитель: полимер (целлюлоза, сефароза, агароза, полиакриламид)
Способы иммобилизации:
образование ковалентных и нековалентных связей с носителем полимеризация носителя в присутствии фермента инкапсулирование (например, включение в липосому)

Использование иммобилизованных ферментов: примеры

Иммобилизация протеолитических ферментов на целлюлозе: повязки, тампоны для обработки и лечения ран (см. слайд 12, повязка с трипсином на диальдегидцеллюлозе)
Иммобилизация ферментов на колонках для экстракорпоральной перфузии крови типа «искусственная почка», «искусственная печень»

Энзимодиагностика

Постановка диагноза на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека

Используются ферменты, которые по месту «работы» делят на 3 группы:

СЕКРЕТОРНЫЕ

ЭКСКРЕТОРНЫЕ

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ

Секреторные ферменты
синтезируются в печени
«работают» в крови (субстрат фермента находится в крови)
активность в крови выше, чем в ткани
Характеризуют белок-синтезирующую функцию печени: снижение активности свидетельствует о патологии печени, на фоне которой нарушается синтез белков

ПРИМЕРЫ:

псевдохолинэстераза (ПХЭ)
проферменты свертывающей системы крови (факторы свертывания крови)


Экскреторные ферменты
синтезируются в экзокринных железах
«работают» в полости органов активность в крови незначительная и обусловлена диффузией фермента
Активность в крови повышается при остром воспалении железы и, как следствие, затруднении оттока секрета в полость органа

ПРИМЕРЫ:

щелочная фосфатаза печени (маркер синдрома холестаза, например, при желчнокаменной болезни)
амилаза и липаза поджелудочной железы (маркеры острого панкреатита)


Внутриклеточные ферменты:
цитоплазматические: лактатдегидрогеназа (ЛДГ), аланин (аспартат) аминотрансфераза (АЛТ, АСТ), креатинкиназа (КК)
митохондриальные: АСТ
лизосомные: кислая фосфатаза
Активность в ткани высокая
Активность в крови незначительная и является следствием нормально идущих процессов разрушения клеток (например, эритроцитов), повышенной проницаемости мембран в детском возрасте, выполнения тяжелой физической работы (повышение активности креатинкиназы)
Значительное повышение активности в крови – признак патологии (воспаление, цитолиз, некроз)
Незначительное повышение в крови цитозольных ферментов свидетельствует о воспалительном процессе, их резкое повышение – о цитолизе
Повышение в крови митохондриальных или ядерных ферментов – результат некроза

«Требования» к ферментам энзимодиагностики

Органоспецифичность (тканеспецифичность) фермента или его изоформ: преимущественная или абсолютная локализация в определенных органах

ПРИМЕРЫ:

панкреатическая липаза
печеночная гистидаза и аргиназа
ЛДГ1 и ЛДГ2 кардиомиоцитов
неспецифические ферменты АЛТ и АСТ присутствуют во многих органах, но основным источником повышения их активности в крови являются патологии печени и сердца
Количество высвобождаемого в кровь фермента должно быть пропорционально степени повреждения ткани и достаточно для определения его активности
Стабильная активность ферментов в течение достаточно длительного времени (сутки)

Изоферменты

Множественные формы одного олигомерного фермента (имеющего IV структуру), обусловленные различными комбинациями разных по структуре субъединиц катализируют одну и ту же реакцию

Различия изоформ

физико-химические свойства (так как разная I структура, М.м., заряд)
органоспецифичность субстратная специфичность активность способы регуляции, чувствительность к ингибиторам и активаторам

Пример изоферментов

Фермент	М.м. кДа	Орган	Субстрат	Км, ммоль/л	Активность мкмоль/мин на 1 г ткани	Регуляция
Гексокиназа (I–III)	104	Раз.	глюкоза фруктоза галактоза	≈ 0.01	Мозг – 10 Сердце – 4.8 Мышцы – 1.5 Жир – 0.15	Продукт – аллостерический ингибитор
Глюкокиназа (гексокиназа IV)	2000	Печень, Поджелудочная железа	глюкоза	10-20	Печень – 0.4 П.жел. – 2.1	Не аллостерический фермент

Тип катализируемой реакции:

перенос фосфатной группы с АТФ на гексозы

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)

пируват + NADH+Н+ ↔ лактат + NAD+

Внутриклеточный фермент
Диагностика патологии сердца, печени, мышц
Олигомерный белок: 4 субъединицы двух типов
М (англ. muscle – мышца)
Н (англ. heart – сердце)

Назовите возможные комбинации субъединиц, образующие 5 изоформ, и предположите органы их преимущественной локализации!

Лактатдегидрогеназа 1 и 2 – сердечные изоформы
Специфичность ЛДГ 1 и 2 выше к лактату, чем к пирувату, т.е. данные изоформы катализируют реакцию «лактат → пируват» при поступлении лактата из крови, где его постоянным источником являются эритроциты. Таким образом лактат используется кардиомиоцитами как источник энергии (АТФ образуется при дальнейшем катаболизме пирувата).
Реакция «пируват → лактат» протекает при анаэробном гликолизе. Так как в кардиомиоцитах гликолиз преимущественно аэробный, активность ЛДГ других изоформ невысокая.
Определение активности ЛДГ 1 и 2 используют в диагностике инфаркта миокарда на более поздних сроках после болевого приступа (через 2-3 суток), а также в динамике восстановления: чем быстрее нормализуется активность фермента, тем лучше.


Креатинкиназа (КК)

креатин + АТФ ↔ креатинфосфат + АДФ

Креатинфосфат – энергетический субстрат в мышечной и нервной тканях
Внутриклеточный фермент
Олигомерный белок: димер из субъединиц 2-х типов
М (англ. muscle – мышца)
В (англ. brain – мозг)

Назовите возможные комбинации субъединиц, образующие 3 изоформы и предположите орган их преимущественной локализации!

КК-ММ (скелетная мышца) – диагностика повреждений скелетных мышц
КК-МВ (сердечная мышца) – диагностика инфаркта миокарда
КК-ВВ (головной мозг) – не проникает через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах (не имеет диагностического значения)

Почему важно определять изоферментный состав, а не просто суммарную активность фермента?

Суммарная активность фермента не предоставляет информации о локализации патологического процесса. Так, например, суммарная активность ЛДГ может быть повышена при патологиях различных органов. А в некоторых случаях суммарная активность фермента не предоставляет информации даже о наличии патологического процесса.

ПРИМЕР: болезнь Тея-Сакса (ганглиозидоз)

Причина: нарушение синтеза α-субъединиц гексозоаминидазы → снижение активности изоформы А

Изоформа А (2α2β)

Изоформа В (4β)

Суммарная активность фермента при данной патологии оказывается нормальной (за счет компенсаторного повышения синтеза субъединицы β и, как следствие, повышенной концентрации изоформы В)

Основные ферменты энзимодиагностики патологии сердца, сопровождающейся цитолизом и некрозом (инфаркт миокарда)

КК-МВ (креатинкиназа, изоформа МВ)
АСТ (аспартатаминотрансфераза)
АЛТ (аланинаминотрансфераза)

АСТ / АЛТ – коэффициент де Ритиса

(в норме 1,33±0,42)

Коэффициент де Ритиса повышен за счет преимущественного повышения активности АСТ (митохондриальной формы)
ЛДГ 1 и ЛДГ2 (лактатдегидрогеназа, изоформы 1 и 2)

Динамика изменения активности ферментов энзимодиагностики инфаркта миокарда

Динамика изменения активности АСТ и АЛТ при инфаркте миокарда

Воспаление, цитолиз, некроз (гепатит, цирроз)

АЛТ, АСТ
Коэффициент де Ритиса при вирусном гепатите < 1 за счет преимущественного повышения цитозольного АЛТ вследствие цитолиза при сохранении целостности внутриклеточных органоидов
Коэффициент де Ритиса при циррозе ≈ 1 на фоне высокой активности обоих ферментов за счет «выхода» АСТ из разрушенных митохондрий
ЛДГ 4, ЛДГ 5

Динамика изменения активности АЛТ и АСТ при вирусном гепатите

Синдром холестаза

Повышается активность экскреторного фермента печени в крови – ЩФ (печеночной изоформы щелочной фофатазы – гидролазы фосфоэфирных связей)
Повышается активность ГГТ, или ГГТП (гамма-глутамил трансферазы, или транспептидазы) – фермента цитоплазматической мембраны клеток различных органов, участвующего в транспорте аминокислот в клетку. Причина повышения активности ГГТ при холестазе – отщепление фермента от ЦПМ под действием желчных кислот.
ГГТ является также маркёром алкогольной болезни печени.

Основные ферменты энзимодиагностики острого панкреатита

Повышается активность экскреторных ферментов в крови:

Амилаза (диастаза мочи)
Липаза

Энзимопатии

Использование ингибиторов ферментов

Ингибиторы протеаз в терапии острых панкреатитов (контрикал, трасилол, пантрипин и др.)


Ингибиторы протеаз в терапии HCV инфекции - новый класс препаратов для лечения гепатита С
Действие препаратов направлено непосредственно на вирус гепатита: они подавляют или блокируют ключевые внутриклеточные этапы размножения вируса
В настоящее время одобрено использование препаратов: симепревир (Россия), телапревир (Incivek) и боцепревир (Victrelis) (США, страны ЕС). Их применение в составе комбинированной терапии существенно повышает эффективность лечения пациентов.


Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента – лечение гипертонии (берлиприл, вазолонг и др.)
Ингибиторы ксантиноксидазы – лечение падагры (аллопуринол)
Ингибиторы ферментов синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот – лечение бактериальных, вирусных инфекций, онкологических заболеваний, например ингибиторы обратной транскриптазы – лечение ВИЧ-инфекции

Энзимопатии

Патологические процессы, основанные на нарушении ферментативного катализа по причине мутации генов ферментов или нарушения экспрессии (синтеза фермента)

первичные (наследственные)
нарушается образование конечного продукта

ПРИМЕР: Альбинизм

нарушение синтеза меланина из-за дефекта тирозиназы

накапливаются токсические метаболиты

ПРИМЕР: Фенилкетонурия

снижение образование тирозина из фенилаланина из-за недостатка фенилаланингидроксилазы приводит к накоплению фенилпирувата и фенилацетата → токсическое действие на мозг

нарушение транспорта тир в мозг → снижение синтеза дофамина, норадреналина

вторичные (приобретенные)

Задание № 1 для самостоятельной работы

В современной клинической лабораторной диагностике широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Используя интернет-ресурсы, изучите информацию о данном методе и составьте конспект по вопросам:

1. Принцип метода ИФА.

2. Роль ферментов как реагентов в ИФА-диагностике.

3. Значение ИФА в диагностике заболеваний.

Задание № 2 для самостоятельной работы Используя интернет-ресурсы, заполните таблицу «Ферменты энзимодиагностики» и определите класс фермента

Фермент и его изоформы	Норма в крови для взрослых (с учетом пола)	Клинико-диагностическое значение (с указанием изоформ)
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)
Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
Креатинкиназа (КК)
Гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ)
Щелочная фосфатаза (ЩФ)
Псевдохолинэстераза (ПХЭ)
Панкреатическая липаза
Панкреатическая амилаза

Заключение

Ферменты используются в диагностике заболеваний как специфические реагенты
Препараты ферментов используются в заместительной и комплексной терапии
Определение активности ферментов – важный этап диагностики заболеваний, а также контроля эффективности проводимой терапии
В основе многих наследственных заболеваний лежит нарушение ферментативного катализа

Литература

Биохимия: учебник для вузов / ред. Е. С. Северин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -784 с. (С. 118-123)
Биологическая химия с упражнениями и задачами: учебник / ред. С.Е. Северин. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. -624 с. (С. 99-112)
Биологическая химия: учебник для студентов медицинских вузов / А.Я. Николаев. – М.: Мед. информ. агенство, 2007. – 568 с.
Клиническая биохимия: электронное учебное издание / Новосиб. гос.мед.ун-т; сост. И. В. Пикалов [и др.]. - Новосибирск: Центр очно-заочного образования ГОУ ВПО НГМУ Росздрава, 2008