Ферменты. Лекция. Ферменты. Витамины как кофакторы ферментов
 Скачать 330.65 Kb.
|
|
Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 1 ЛЕКЦИЯ. ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ КАК КОФАКТОРЫ ФЕРМЕНТОВ. План лекции: 1. Понятие о ферментах. Сходства и различия с небиологическими катализаторами. 2. Общие свойства ферментов. 3. Строение ферментов. Витамины как коферменты. 4. Понятие об активных и аллостерических центрах. 5. Номенклатура и классификация ферментов. 6. Регуляция активности ферментов. 7. Гормональная регуляция активности ферментов. 8. Механизмы действия гормонов. 9. Применение ферментов в медицине. 1. Понятие о ферментах. Сходства и различия с небиологическими катализаторами. Ферменты – это белки, выполняющие роль катализаторов химических реакций. Ферментативной активностью обладают все жидкости организма человека: кровь, слюна, желудочный сок, сок поджелудочной железы, а также экстракты тканей. Выявить ферменты можно титрометрическими, спектрофотометрическими методами. С небиологическими катализаторами ферменты схожи тем, что: 1) Не влияют на направление реакции, и в обратимых реакциях ускоряют как прямое, так и обратное течение, 2) Не расходуются в реакции, поэтому о ходе реакции судят по уменьшению субстрата или по увеличению продукта, 3) Снижают энергию активации вещества за счет образования фермент-субстратного комплекса, тем самым ускоряя процесс химической реакции. Различия между ферментами и небиологическими катализаторами определяются белковой природой ферментов: 1. Ферменты намного эффективны, чем небелковые катализаторы, 2. Активность ферментов поддается регулированию, 3. Ферменты работают при физиологических значениях рН среды и температуры, 4. Ферменты обладают специфичностью. 2. Общие свойства ферментов. Ферменты обладают следующими свойствами: 1. Ферменты активны при физиологических значениях температуры. Это свойство определяется термином «термолабильность». Физиологическими являются температуры от +33 до +40+42°С. Снижение температуры приводит к инактивации фермента, а повышение – к денатурации белковой части. Температурный оптимум –значение температуры, при котором скорость химической реакции максимальна - для большинства ферментов находится при температуре +36 +37°С. Графическое отображение термолабильности имеет вид: Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 2 2. Ферменты работают при определенном значении рН среды. То значение среды, в котором функциональные группы максимально ионизированы (и заряжены) формирует оптимум рН. Для каждого фермента оптимум свой: амилаза слюны активна при рН =6,8, трипсин – при рН=8,0, ферменты крови – при рН =7-7,3, пепсин – при рН= 2-2,5. 3. Специфичность – способность избирательно катализировать определенную химическую реакцию. Виды специфичности: 1. Абсолютная – фермент катализирует превращение только одного субстрата. Например, сахараза гидролизует сахарозу, уреаза – мочевину. 2. Групповая или относительная – фермент катализирует превращение нескольких субстратов, общим свойством которых является одинаковый тип химической связи в молекуле субстрата. Пример: амилаза гидролизует α-1,4-гликозидные связи в крахмале и гликогене; трипсин действует на пептидные связи, липаза - на эфирные связи. 3. Стереохимическая – фермент ускоряет превращение одного из возможных стереоизомеров. Пример: фумараза действует на фумаровую кислоту (транс- изомер), а не на малеиновую (цис- изомер). Скорость протекания химических реакций в присутствии ферментов помимо температуры и рН среды определяется количеством фермента и количеством субстрата. Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 3 Зависимость скорости химической реакции от концентрации фермента выражается прямолинейной зависимостью и имеет вид: Зависимость скорости химической реакции от концентрации субстрата имеет следующую зависимость: на начальных этапах с увеличением концентрации субстрата скорость химической реакции увеличивается прямолинейно, но на определенном уровне фермент насыщается субстратом и увеличение концентрации последнего на скорость влиять не будет. Если на графике значение максимальной скорости разделить пополам и рассчитать количество субстрата при этом, то получится значение, называемое константой Михаэлиса-Ментен. 3. Строение ферментов. Витамины как коферменты. По химическому строению ферменты, как и белки, делятся на: А) простые, состоящие только из аминокислот, Б) сложные (холоферменты), состоящие из белкового компонента – апофермента и небелкового – кофактора. Кофакторы делятся по характеру связи с апоферментом: 1) Если кофактор связан прочно и постоянно, то его называют простетической группой, 2) Если кофактор и апофермент удерживаются относительно слабыми связями, то кофактор называют коферментом. В качестве проферментов могут выступать металлы, нуклеотиды и водорастворимые витамины. Витамины, участвующие в построении ферментов, являются водорастворимыми и принимают участие в катализе реакций. Без витаминов ферменты теряют активность. Так как витамины не могут быть синтезированы организмом человека, то они должны поступать с пищей. Недостаточное поступление витаминов приводит к развитию гиповитаминоза, а полное отсутствие витаминов называется авитаминозом. Данные явления могут наблюдаться при скудном, однообразном питании, после длительного приема антибиотиков, а также во время беременности и болезни. Избыток витаминов в организме – гипервитаминоз свойственен жирорастворимым витаминам (А, D, E, K, F), а для водорастворимых не наблюдается, т.к. их избыток выводится с мочой. Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 4 Примеры витаминных коферментов: 1. Витамин В 1 (тиамин) входит в состав ТПФ (тиаминпирофосфат)- кофермента транскетолаз; 2. Витамин В 2 (рибофлавин) входит в состав ФАД (флавинадениндинуклеотид) и ФМН (флавиномононуклеотид) – коферментов дегидрогеназ, осуществляющих окислительно- восстановительные реакции. 3. Витамин РР (никотинамид) входит в состав НАД (никотинамиддинуклеотид) – кофермента дегидрогеназ. 4. Витамин В 6 (пиридоксин, пиридоксамин, пиридоксаль) входит в состав ПАЛФ (пиридоксальфосфата), участвующего в работе трансаминаз и декарбоксилаз аминокислот. 5. Витамин Н или В 9 (фолиевая кислота) и ее активная форма ТГФК (тетрагидрафолиевая кислота) участвуют как коферменты в реакциях карбоксилирования. Другие примеры, а также формульный материал размещен на образовательном портале материалах к занятию «Витамины как кофакторы ферментов». 4.Понятие об активном и аллостерическом центрах. Согласно функциональному строению в ферментах выделяют А) активный центр – уникальный участок, формирующийся на третичном уровне организации белковой молекулы, который обеспечивает взаимодействие с субстратом. Активный центр состоит из двух участков: 1-субстратный (якорный, контактный) – служит для связывания с субстратом, 2-каталитический, в котором осуществляется химическое превращение субстрата. Активный центр есть у всех ферментов. У некоторых ферментов, называемых регуляторными, имеется также аллостерический центр. Б) аллостерический центр, присутствующий у аллостерических ферментов, формируется на третичном уровне и служит для связывания с модуляторами (эффекторами). Модуляторы, встраиваясь в аллостерический центр, меняют конформацию активного центра, нарушая связывание с субстратом (в случае ингибиторов или отрицательных модуляторов), или, напротив, улучшая связывание с активным центром (в случае активаторов или положительных модуляторов). 5. Номенклатура и классификация ферментов. Номенклатура – систематическое название ферментов. Существует 3 системы: - тривиальная (исторически сложившаяся) на основе случайных признаков, например, пепсин, трипсин. - рациональная, учитывающая химическое название веществ, например, лактаза, сахараза. - современная, которая учитывает название субстрата, тип химической реакции и окончание «аза», например, пируватдекарбоксилаза, аспартатаминотрансфераза. Классификация ферментов основана на типе катализируемой реакции. Существует 6 классов ферментов: 1. Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции. Некоторые подклассы: А) дегидрогеназы – катализируют отщепление атомов водорода, Б) оксидазы – переносят атомы водорода или электроны на атомы кислорода с образованием перекиси и встраивают кислород в молекулу субстрата. В) цитохромы – осуществляют перенос электронов по ферментам дыхательной цепи или в реакциях микросомального окислении. 2. Трансферазы – катализируют перенос функциональных групп от одного субстрата на другой. Делятся на подклассы в зависимости от переносимой группы: А) фосфотрансферазы (киназы), Б) аминотрансферазы, В) гликозилтрансферазы, Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 5 Г) ацилтрансферазы 3. Гидролазы катализируют расщепление молекул с присоединение воды по месту разрыва связей. Подклассы выделяют в зависимости от гидролизуемой связи: А) эстеразы, Б) фосфатазы, В) гликозидазы, Г) пептидазы, Д) амидазы. 4. Лиазы – катализируют реакции негидролитического отщепления атомов и групп. Подклассы: А) углерод-углерод лиазы (декарбоксилазы), Б) углерод-кислород лиазы (гидролиазы), В) углерод –азот лиазы (дезаминазы). 5. Изомеразы (мутазы) катализируют реакции внутримолекулярного переноса групп, т.е. реакции изомеризации. Например, фосфоглюкомутаза катализирует обратимую реакцию изомеризации глюкозо- 6-фосфата в глюкозо-1-фосфат. 6. Лигазы (синтетазы) катализируют реакции соединения (синтеза) веществ. 6.Регуляция активности ферментов Регуляция активности ферментов – отличительная их особенность от небелковых катализаторов, осуществляется несколькими способами: 1. Ковалентная модификация – присоединением или отсоединением функциональных групп, в частности, реакциями фосфорилирования и дефосфорилирования. Фосфорилирование - присоединение фосфорной кислоты, катализируемое протеинкиназами. Дефосфорилирование – отщепление остатка фосфорной кислоты, катализируемое протеинфосфатазами. 2. Частичный протеолиз – т.е. отщепление части белковой молекулы – ингибитора от молекулы профермента, сопровождающееся уменьшением молекулярной массы. Характерно для протеолитических (пищеварительных) ферментов. 3. Аллостерическая регуляция характерна для регуляторных ферментов (см. аллостерический центр). 4. По принципу отрицательной обратной связи (ретроингибирование)- осуществляется, когда конечный продукт цепи химических реакций тормозит работу фермента начального этапа синтеза. 5. С помощью веществ – регуляторов: активаторов и ингибиторов. Активаторы ускоряют работу ферментов, а ингибиторы - тормозят ее. Действие ингибиторов может быть необратимым, когда ингибитор связывается прочно с ферментом и его невозможно извлечь, ингибитор может при этом вызывать денатурацию; а также может быть обратимым, когда активность фермента при определенных условиях восстанавливается. Обратимое ингибирование может быть конкурентным и неконкурентным. При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор имеют схожее строение и конкурируют за связывание в активном центре. Данный вид ингибирования устраняется избытком субстрата. Неконкурентное ингибирование возникает, если ингибитор и субстрат не имеют сходства, тогда ингибитор встраивается в другой участок молекулы фермента, тормозя его активность. Данный вид ингибирования устраняется путем связывания и извлечения ингибитора. 6. Компартментализация – пространственное разделение ферментов, отвечающих за противоположно направленные процессы. Например, ферменты синтеза жирных кислот локализованы в цитоплазме, в ферменты окисления жирных кислот – в митохондриях. 7. Генетическая регуляция, когда осуществляется контроль синтеза ферментов. Регуляция активности ферментов осуществляется и с помощью гормонов. 7.Гормональная регуляция активности ферментов. Гормоны – биологически активные вещества, вырабатываемые железами внутренней секреции в малых количествах, секретируемые в кровь, доставляемые к Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 6 органам–мишеням и осуществляющие гуморальную регуляцию обмена веществ и координирующие функции организма. Гормонам свойственны: высокая биологическая активность, дистантность, высокая специфичность, короткий период жизни. Классификация гормонов: 1. По месту синтеза различают: гормоны гипофиза, гормоны гипоталамуса, щитовидной и паращитовидной желез и т.д. 2. По биологическим функциям различают: А) регулирующие обмен углеводов, белков, липидов (инсулин, глюкагон, адреналин, глюкокортикоиды), Б) регулирующие водно – солевой обмен (минералокортикоиды, вазопрессин), В) регулирующие обмен кальция Са 2+ и фосфатов (паратгормон, кальцитонин), и т.д. 3. По химическому строению различают: А) белково-пептидные (гормоны гипофиза, гипоталамуса, поджелудочной железы), Б) производные аминокислот (гормоны мозгового слоя надпочечников и гормоны щитовидной железы), В) стероидные (гормоны коры надпочечников и половые гормоны), 4. По механизму действия на клетку-мишень различают: А) гормоны проникающего действия (цитозольный механизм), Б) гормоны непроникающего действия (мембранно-внутриклеточный механизм), В) смешанного действия. 8. Механизмы действия гормонов. 1. Цитозольный (прямой или проникающий) характерен для гормонов стероидной природы и заключается в следующем: Гормон, являясь липофильным, проникает через клеточную мембрану внутрь клетки. Внутри клетки гормон соединяется со специфическим рецептором, образуя гормон-рецепторный комплекс, который погружается в ядро клетки и взаимодействует с ДНК. Если гормон связывается с энхансером, то увеличивается сродство промотера с РНК-полимеразой и увеличивается скорость транскрипции и трансляции, в результате которых образуются белки (в том числе и ферменты, регулирующие скорость протекания обменных процессов). Если гормон связывается с сайленсером ДНК, то синтез белка снижается. Таким образом, гормоны стероидной природы оказывают анаболический эффект, поскольку регулируют синтез белков, в том числе и ферментов. 2. Мембранно- внутриклеточный механизм (непроникающий, непрямой). Характерен для гормонов белково- пептидной природы и производных аминокислот (адреналина). Данный механизм заключается в связывании гормона на поверхности мембраны с рецептором и передаче сигнала внутрь клетки посредством вторичных посредников (например, циклических нуклеотидов - цАМФ, цГМФ). Сигнал передается на ферменты – киназы, которые участвуют в фосфорилировании белков (ферментов). Таким образом, под действием этих гормонов происходит ковалентная модификация ферментов. Различают несколько вариантов действия гормона по непрямому механизму. Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 7 А. Аденилатциклазный механизм. По аденилатциклазному механизму действуют гормоны гипофиза, кальцитонин, соматостатин, глюкагон, паратгормон, адреналин, вазопрессин. Связывание гормона с гликопротеиновым рецептором приводит к образованию гормон- рецепторного комплекса, который изменяет конформацию G-белка. В результате одна из субъединиц G-белка приобретает способность связываться с ГТФ. Комплекс ―G-белок-ГТФ‖ активирует аденилатциклазу (АЦ). АЦ начинает активно превращать молекулы АТФ в ц-АМФ. ц-АМФ (вторичный посредник) активирует фермент – протеинкиназу А путем диссоциации молекул на регуляторные и каталитические субъединицы. Активная протеинкиназа А (каталитические единицы) катализирует реакции фосфорилирования различных белков с участием АТФ. При этом в состав белковых молекул включаются остатки фосфорной кислоты. Главным результатом этого процесса фосфорилирования является изменение активности фосфорилированного белка. В различных типах клеток фосфорилированию в результате активации аденилатциклазной системы подвергаются белки с разной функциональной активностью. Например, это могут быть ферменты, ядерные белки, мембранные белки. В результате реакции фосфорилирования белки могут становятся функционально активными или неактивными. Б. Инозитолфосфатная система. Связывание гормона с рецептором и образование гормон-рецепторного комплекса способствует фосфорилированию G-белка с помощью ГТФ и приводит к диссоциации его на субъединицы. Отделившаяся α-субъединица, связанная с молекулой ГТФ, приобретает сродство к фосфолипазе С и активирует ее. Под действием фосфолипазы С происходит гидролиз липида мембраны фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата(ФИФ 2 ). В ходе гидролиза образуется и выходит в цитозоль инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ 3 ). Другой продукт реакции диацилглицерол (ДАГ) остаѐтся в мембране и участвует в активации фермента протеинкиназы С (ПКС). ИФ 3 связывается специфическими центрами Са 2+ -канала мембраны ЭР, это приводит к изменению конформации белка и открытию канала — Са 2+ поступает в цитозоль. Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 8 Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле клетки увеличивает скорость взаимодействия Са 2+ с неактивным ферментом протеинкиназой С (ПКС) и белком кальмодулином, таким образом сигнал, принятый рецептором клетки, раздваивается. Комплекс кальмодулина с кальцием не обладает ферментативной активностью, но взаимодействие комплекса с различными белками и ферментами приводит к их активации. Связывание протеинкиназы С с ионами кальция и диацилглицеролом активирует протеинкиназу С и она фосфорилирует специфические ферменты по серину и треонину, вызывая их активацию или инактивацию. 3. Смешанный механизм. Особым механизмом действия обладает инсулин. Инсулиновый рецептор представляет собой сложный интегральный белок клеточной мембраны, построенный из 2 субъединиц (α и β), причѐм каждая из них образована двумя полипептидными цепочками. Инсулин с высокой специфичностью связывается и распознаѐтся α-субъединицей рецептора, которая при присоединении гормона изменяет свою конформацию. Это приводит к появлению тирозинкиназной активности у субъединицы β, что запускает разветвлѐнную цепь реакций, которая начинается с самофосфорилирования (аутофосфорилирования) рецептора. Тирозинкиназа фосфорилирует внутриклеточные белки - субстраты инсулинового рецептора. Дальнейшее развитие событий обусловлено двумя направлениями: MAP- киназный путь и ИФ 3 -киназный механизмы действия. При активации фосфатидилинозитол-3-киназного (ИФ 3 -киназного) механизма результатом являются быстрые эффекты – активация ГлюТ-4 и поступление глюкозы в клетку, изменение активности ферментов – ТАГ-липазы, гликогенсинтазы, гликогенфосфорилазы, киназы гликогенфосфорилазы, ацетил-SКоА-карбоксилазы и других. При реализации MAP-киназного механизма (от англ. MAP - mitogen-activated protein) регулируются медленные эффекты – индукция или репрессия синтеза мРНК и белков, пролиферация и дифференцировка клеток, процессы апоптоза и т.д.. Лектор: старший преподаватель кафедры биохимии, к.б.н. Чесовских Юлия Сергеевна 9 8. Применение ферментов в медицине Применение ферментов в медицине – медицинская энзимология – возможна по трем направлениям: 1. Энзимотерапия – применение ферментов в качестве лекарственных средств. Например, фестал, гастал, мезим содержат пищеварительные ферменты (амилазу, липазу, трипсин, пепсин) и применяются при сниженной функции ЖКТ. Трипсин может использоваться в хирургии для обработки швов. Лидаза применяется для обработки рубцов. Лизоцим применяют для лечения конъюктивитов. 2. Энзимодиагностика – использование ферментов для диагностики заболеваний. Ферменты при этом могут использоваться как реагенты для определения какого-либо метаболита (например, глюкозооксидаза для определения концентрации глюкозы в крови, холестреролэстераза – для определения уровня холестерина), а также ферменты используются как индикатор какого-либо патологического процесса. Для этого исследуют активность ферментов в крови. Ферменты крови представлены: а) секреторными ферментами, которые синтезируются в печени и секретируются в кровь, где функционируют. Активность таких ферментов в крови в норме высокая и снижается при патологии печени. Например, холинэстераза, липопротеинлипаза. б) эксреторными ферментами, которые синтезируются пищеварительными железами и по протокам поступают в 12-ти перстную кишку. Активность таких ферментов в крови в норме низка, увеличение происходит при патологических процессах в пищеварительных железах. Например, активность амилазы в крови увеличивается при панкреатитах. в) клеточными ферментами, которые вырабатываются и функционируют внутри клеток, поэтому патологические состояния, сопровождающиеся увеличением проницаемости клеточных мембран, приводят к появлению данных ферментов в крови. Например, активности аспартатаминотрансферазы (АСАТ) и креатинфосфокиназы (КФК) увеличены при повреждении миокарда, активность щелочной фосфатазы увеличивается при остеопорозах, повреждении костной ткани. 3. Энзимопатии – заболевания, возникающие вследствие нарушения синтеза какого-либо фермента. Могут быть врожденными и приобретенными. Например: А) фенилкетонурия. Отстутствует фермент – фенилаланингидроксилаза (фенилаланин-4- монооксигеназа), которая катализирует превращение фенилаланина в тирозин. Характеризуется выделением фенилпирувата и фениллактата – токсических метаболитов. При данном заболевании наблюдается задержка в физическом и психическом развитии (олигофрения). Б) альбинизм – заболевание, при котором отсутствует тирозиназа, катализирующая превращение тирозина в диоксифенилаланин и меланин. Отсутствие меланина приводит к нарушению устойчивости к УФ-лучам. В) алкаптонурия возникает в результате отсутствия оксидазы гомогентизиновой кислоты, приводит к накоплению алкаптона, вызывающего потемнение мочи, а также характеризуется нарушением работы суставов. |