лекция 4. Лекция Матричные биосинтезы
 Скачать 4.68 Mb.
|
Лекция 4. Матричные биосинтезыРепликация Транскрипция Трансляция Дисциплина: Б1.Б.13. Биохимия Специальность: 31.05.01 лечебное дело НГМУ, кафедра медицинской химии Д.б.н., доцент Суменкова Дина Валерьевна Структура наших ДНК – загадка жизни островка. Нет дна и крыши, нет сторон, Все это жизни вечной трон. Все это Миг и Вдохновенье, нерукотворное круженье... История исследований в молекулярной биологииАпрель 1953 г. - предложена модель пространственной структуры ДНК - двойная спираль (журнал “Nature” "Структура ДНК" Д. Уотсон и Ф. Крик) В биологии начался новый отсчет времени – развитие молекулярной биологии На этом пути сделаны серии блестящих открытий, большинство из которых отмечены Нобелевскими премиями Джеймс Уотсон (р. 1928) Френсис Крик (1916-2004)1952 г работа над моделированием ДНК Основа: правило Чаргаффа и рентгенограммы Р. Франклин и М. Уилкинса 1953 г – публикация результатов 1962 г – Нобелевская премия по физиологии и медицине "...выдающийся харизматический символ нашего времени - спиральная лестница, ведущая, я надеюсь, в небеса, - была разрекламирована с поистине выдающейся интенсивностью. Она использовалась как эмблема, ее рисовали на галстуках, она украшала фирменные бланки, ее устанавливали перед зданиями.... Она даже вторглась в высокие формы изящного искусства" . Апрель 2018 г – 65 лет с момента открытия структуры ДНК Какова роль молекулярной биологии в развитии современной медицины? Е. Чаргафф Актуальность темы лекции: открытия молекулярной биологии играют важную роль в развитии современной медицины Использование ДНК-технологийвыявление мутаций генов выявление наследственных заболеваний определение особенностей генома установление родства диагностика бактериальных и вирусных заболеваний производство рекомбинантных белков, гормонов…. производство лекарственных препаратов – ингибиторов матричных биосинтезов в опухолевых и бактериальных клетках расшифровка генома человека (международный проект под рук. Д. Уотсона, 1990-2003 г) с целью ранней диагностики и лечения заболеваний Генная и клеточная терапия – «небеса», к которым привела спиральная лестница ДНКГенная терапия – лечение путем введения в клетки пациентов генов, устраняющих генные дефекты или придающие им новые функцииПервый клинический опыт1990 г, США, 4-х летняя девочка с иммунодефицитным состояниемПричина заболевания:мутация гена аденозиндезаминазы → нарушение обмена нуклеотидов → нарушение пролиферации и созревания лимфоцитовЛечение: пересадка собственных лимфоцитов с предварительно введенным in vitro ретровирусом, содержащим нормальный ген ферментаКлеточная терапияТерапия с использованием стволовых клетокС помощью определенных генов можно перепрограммировать клетку и изменить путь ее дифференцировкиНапример, разработана технология получения плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов кожи человека с помощью генов Myc, Oct3/4, Sox2, Klf4 и их дальнейшая дифференцировка в кардиомиоциты(Шинья Яманака, Япония, Нобелевская премия 2012)Цель лекцииЗнать: строение и функции нуклеиновых кислот химико-биологическую сущность процессов репликации, транскрипции, трансляции Использовать знания о матричных биосинтезах для понимания химико-биологической сущности процессов роста и развития организма механизмов устойчивости организма к воздействиям внешней среды механизмов действия противоопухолевых и антибактериальных препаратов Использовать знания о матричных биосинтезах для формирования представлений о принципах ДНК-технологий в диагностике и терапии о механизме действия некоторых ядов и бактериальных токсинов о генетических аспектах полиморфизма генов и белков, наследственных заболеваний и канцерогенеза План лекции1. Строение и функции ДНК и РНК (самостоятельное повторение курса химии с использованием слайдов 10-18) 2. Репликация и репарация 3. Транскрипция 4. Трансляция Строение нуклеиновых кислотФункция: хранение, передача, реализация наследственной информации Нуклеиновые кислоты (НК) - биополимеры Мономер – нуклеотиды Строение нуклеотида: азотистое основание + пентоза + остаток фосфорной кислоты Азотистые основания (АО) Первичная структура НК: последовательность нуклеотидовХимические связи: 1 - 5′-фосфоэфирная 2 – N-гликозидная 3 - 3′,5′ - фосфодиэфирная Условные обозначения: Х – водород в ДНК или -ОН в РНК Вторичная структура ДНК: двойная спиральПравозакрученная спираль (виток = 10 н.п.)Цепи антипараллельны: 5′→3′ и 3′→ 5′Водородные связи между АО цепей Стэкинг-взаимодействия (гидрофобные) между АО «в стопке» Комплементарность цепей (А-Т, Г-Ц) Правило Чаргаффа: А=Т, Г=Ц, А+Т / C+G – характеристика видаТретичная структура ДНК: нуклеопротеидные комплексы (хромосомы)Гистоновые белки: белки с высоким содержанием лиз и арг 5 типов: Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 Негистоновые белки: белки и ферменты, участвующие в матричных биосинтезах Роль белков: обеспечивают суперспирализацию и компактизацию ДНК НуклеосомаДНК (≈146 н.п.) + 8 молекул гистонов (Н2А, Н2В, Н3, Н4)2Структура удерживается ионными связями между лиз, арг и остатками фосфорной кислотыЛинкерные участкиУчасток ДНК (≈30 н.п.) между нуклеосомами, с которым связаны молекулы гистона Н1Гетерохроматин – «компактный» хроматин, транскрипционно неактивныйЭухроматин – деспирализованный хроматин с низким содержанием гистонов и высоким содержанием негистоновых белков (период транскрипции)Структура нуклеосом Пространственная структура РНКОдноцепочечная Шпильки – спирализованные участки (водородные связи) Не соблюдается правило Чаргаффа Виды РНК: мРНК матрица в синтезе белка 2-4% от общего количества РНК, разнообразная первичная структура 5′ - «кэп»-конец: 7-метил ГТФ (защита от нуклеаз, участие в инициации трансляции) 3′ - поли(А)-«хвост»: 150-200 остатков АМФ (выход из ядра, защита от нуклеаз) тРНКСтруктура тРНК: 1 – шпильки 2 - петли молекулы-адапторы: переводят информацию мРНК в последовательность аминокислот в белке 15% содержат минорные нуклеотиды (например, метилированные АО) рРНКструктурный компонент рибосом 80% от общего количества РНК в клетке 4 типа у эукариот: 5S, 5,8S, 18S, 28S S – единица Сведберга, скорость осаждения при центрифугировании РЕПЛИКАЦИЯ: синтез ДНКПротекает в ядре в S-фазу клеточного цикла перед митозом Стимулы: гормоны, ростовые факторы, белки-циклины Матрица: обе нити ДНК, образуются 2 репликативные вилки Направление синтеза новых цепей: 5′ - 3′ по принципу комплиментарности и антипараллельности Участки синтеза – ориджины репликации Участок ДНК между соседними ориджинами - репликон Этапы репликации: инициация, элонгация, терминация Субстраты и источники энергии: дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ Кофактор: Mg2+ Полуконсервативный процесс синтеза: каждая дочерняя молекула ДНК содержит одну родительскую нить и одну синтезированную Образуется идентичная молекула ДНК (клетка 4n) 1 этап репликации: инициацияФормирование репликативной вилки: ДНК-топоизомераза расщепляет 3′,5′-фосфодиэфирную связь в одной из цепей ДНК и присоединяется к 5′-концу в точке разрыва 2. ДНК-хеликаза, используя энергию АТФ, разрывает водородные связи и обеспечивает локальное разделение двойной спирали ДНК ДНК-топоизомераза восстанавливает 3′,5′-фосфодиэфирную связь и отделяется SSB (single strand binding)–белки связываются с одноцепочечными участками, препятствуя комплементарному скручиванию цепей Схема инициации репликации2 этап репликации: элонгацияСинтез новых цепей ДНКЛидирующая цепь: 3′ - 5′ (синтез непрерывный по ходу движения репликативной вилки) Отстающая цепь: 5′ - 3′ (рост этой цепи начинается после того, как на лидирующей цепи синтезируется участок из ≈200 нуклеотидов, синтез идет против движения репликативной вилки в виде фрагментов Оказаки) Синтез цепей начинается с образования «затравки» (РНК-праймера из ≈10 нуклеотидов) Ферменты: ДНК-полимераза α синтезирует РНК-праймер и небольшой участок ДНК ДНК-полимераза δ удлиняет лидирующую цепь ДНК-полимераза δ или ε удлиняют отстающую цепь 3 этап репликации: терминацияИсключение праймеровЗавершение формирования отстающей цепи ДНКЭндонуклеаза (РНКаза) удаляет РНК-праймер ДНК-полимераза β заполняет «брешь» ДНК-лигаза объединяет фрагменты, затрачивая энергию АТФ Схема репликативной вилкиРепарация ошибок и повреждений ДНКПричина повреждений ДНК: действие факторов окружающей и внутренней средыПовреждение ДНК происходит с частотой от нескольких сотен до 1000 случаев в каждой клетке, каждый часВиды повреждений: дезаминирование АО (цитозин превращается в урацил), метилирование АО депуринизация, депиримидинизация образование пиримидиновых димеров (действие УФО) разрыв цепей, ковалентные сшивки между цепями ошибки репликации Система репарации – ферменты (нуклеазы, полимеразы, лигазы)Схема работы системы репарации ДНКРоль системы репарацииРепарация необходима для сохранения генома и возможна благодаря существованию 2-х цепей ДНКСнижение активности ферментов репарации приводит к накоплению мутацийПолагают, что от 80 % до 90 % всех раковых заболеваний связаны с нарушением репарации ДНКПРИМЕР: пигментная ксеродерма – наследственное заболевание, связанное с мутацией генов системы репарации ДНК; УФО таких больных приводит к накоплению мутаций в клетках кожи и развитию ракаТРАНСКРИПЦИЯ: синтез РНКПротекает в ядре вне зависимости от фаз клеточного цикла Матрица: нить ДНК 3′ - 5′ Субстраты и источники энергии: АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ Направление синтеза: 5′ - 3′ по принципу комплиментарности и антипараллельности Этапы: инициация, элонгация, терминация Участвуют факторы инициации, элонгации и терминации – белки Образуются комплиментарные матрице продукты: мРНК, тРНК, рРНК Ферменты: РНК-полимераза I (синтез пре-рРНК) РНК-полимераза II (синтез пре-мРНК) РНК-полимераза III (синтез пре-тРНК) 1 этап транскрипции: инициацияПромотор – последовательность ДНК (ТАТА), с которой связывается РНК-полимераза Сайт терминации – участок завершения синтеза РНК Транскриптон – участок ДНК ограниченный промотором и сайтом терминации «Активация» промотора с помощью ТАТА-фактора Взаимодействие промотора с РНК-полимеразой и факторами инициации Факторы инициации обеспечивают расплетение двойной нити ДНК длиной в один виток (10 н.п.)2 этап транскрипции: элонгация и терминацияЭлонгация: рост нити пре-РНК Факторы элонгации (E, H, F) повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей. Один ген может одновременно транскрибироваться несколькими молекулами РНК-полимеразыТерминация: прекращение транскрипцииФакторы терминации облегчают отделение пре-РНК и РНК-полимеразы от матрицы ДНКСхема транскрипцииПосттранскрипционные модификации пре-РНК«Созревание» пре-мРНК«Кэпирование» на стадии элонгации Образование поли(А)- «хвоста» после транскрипции Сплайсинг – удаление интронов (некодирующих последовательностей) и соединение экзонов Участвуют малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП), образующие комплексы – сплайсосомыВыход «зрелой» мРНК в цитоплазмуАльтернативный сплайсинг – механизм образования различных видов «зрелой» мРНК из одной и той же молекулы пре-мРНК в разных тканяхВ результате в разных тканях при считывании информации с одного и того же гена образуются различные мРНК, а соответственно и различные белкиСхема «созревания» пре-мРНК«Созревание» пре-тРНКУдаление интронов Модификация азотистых оснований (10-15%) Формирование акцепторного участка и антикодона 3. Выход зрелых тРНК в цитоплазму «Созревание» пре-рРНКТРАНСЛЯЦИЯ: синтез белкаМесто синтеза: рибосомы Матрица: мРНК Субстраты: аминокислоты (АК) Адапторы: тРНК Источники энергии: АТФ, ГТФ Кофактор: Mg 2+ (стабилизирует структуру рибосом) Факторы инициации (IF), элонгации (EF), терминации (RF) Активация АК: связывание с тРНК (аминоацил-тРНК-синтетазы) Инициирующая аминоацил-тРНК (аа-тРНК): мет-тРНК Инициирующий кодон мРНК: AUG Этапы: инициации, элонгации, терминации Образуется колинеарный матрице продукт – белок (последовательность АК соответствует последовательности кодонов мРНК) Биологический код: запись информации о последовательности АК в белке с помощью последовательности нуклеотидов Из школьного курса биологии вспомните и объясните свойства биологического кода! Свойства биологического кодаТриплетность (3 нуклеотида кодируют аминокислоту) Специфичность (триплет – одна аминокислота) Вырожденность (одна аминокислота может кодироваться несколькими разными триплетами) Универсальность (для всех живых организмов, независимо от уровня эволюционного развития) Наличие терминирующих стоп-кодонов: UAA, UAG, UGA Однонаправленность (триплеты «читаются» в направлении 5′ - 3′) Колинеарность (последовательность АК соответствует последовательности кодонов мРНК) Активация аминокислот1 этап трансляции: инициацияК мРНК присоединяется малая субъединица рибосомы, фактор инициации IF, мет-тРНК и ГТФ. Когда комплекс свяжется с кодоном AUG, происходит присоединение большой субъединицы рибосомы, что сопровождается гидролизом ГТФ и отделением IF. Формируется полноценная рибосома с пептидильным (Р) и аминоацильным (А) центрами 2 этап трансляции: элонгация (рост пептидной цепи)Стадии элонгации: Связывание аа-тРНК в А-центре при участии фактора элонгации EF1 и с затратой энергии ГТФ Образование пептидной связи между АК Р-центра и АК А-центра при участии пептидилтрансферазы Перемещение рибосомы по мРНК (транслокация) в направлении от 5′- к 3′-концу с использованием энергии ГТФ и при участии фактора элонгации EF2 Многократное повторение стадий 3 этап трансляции: терминацияВысвобождение пептида из связи с тРНК и рибосомой: Стоп-кодоны UAA, UAG, UGA попадают в А-центр Высвобождение полипептида при участии факторов терминации RF1, RF3 и энергии ГТФ Посттрансляционные модификации белков – образование функционально активных белковЧастичный протеолиз Фолдинг – формирование пространственной структуры (II, III) при участии белков-шаперонов Модификация аминокислот (гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование, метилирование……) Образование дисульфидных связей (цистеин-цистеин) Присоединение простетической группы (сложные белки) Сборка протомеров в олигомерные белки (формирование IV структуры) Регуляция матричных биосинтезовЭкспрессия генов — процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок (в процессе транскрипции и трансляции) Механизмы регуляции экспрессии генов различны: компактизация ДНК, модификация ДНК и гистонов, привлечение факторов транскрипции и др.Гены белков «домашнего хозяйства» экспрессируются с постоянной скоростью (конститутивные) и обеспечивают жизнеспособность клеток (например, гены ферментов энергетического обмена).Стойкая репрессия транскрипции определенных генов в различных клетках обеспечивает формирование специализированных клеток, тканей и органов. Адаптивная регуляция обеспечивает изменение скорости экспрессии генов в ответ на меняющиеся условия среды (индуцибельная экспрессия). Адаптивная регуляция осуществляется при участии: регуляторных белков, взаимодействующих с участками ДНК индукторов (стимулируют экспрессию) корепрессоров (подавляют экспрессию) Индукторы или корепрессоры стимулируют присоединение регуляторных белков к регуляторным участкам ДНКВ качестве индукторов и корепрессоров выступают гормоны, ростовые факторы, продукты метаболических путейРегуляторные участки ДНК:
Сайленсер – «тушитель» транскрипции Примеры адаптивной регуляции экспрессии геновКОРТИЗОЛ (как индуктор) стимулирует присоединение регуляторного белка к энхансеру и вызывает экспрессию гена ФОСФОЕНОЛПИРУВАТКАРБОКСИКИНАЗЫ (ключевого фермента синтеза глюкозы), что приводит к повышению уровня глюкозы в крови при голодании, стрессе и физической нагрузки ХОЛЕСТЕРИН (как корепрессор) стимулирует присоединение белка-регулятора к сайленсеру и вызывает подавление экспрессии гена ГМГ-КоА-РЕДУКТАЗЫ (ключевого фермента синтеза холестерина), что приводит к снижению синтеза холестерина (поэтому чем больше холестерина поступает с пищей, тем меньше его синтезируется в печени)Примеры ингибиторов матричных биосинтезовТоксин белой поганки аманитин ингибирует РНК-полимеразу II (синтез мРНК) Энтеротоксин возбудителя дифтерии ингибирует трансляцию, модифицируя фактор элонгации EF2 и нарушая транслокацию рибосом Интерфероны (гликопротеины лимфоцитов и макрофагов, обладающие противовирусной активностью): активируют РНК-азу, расщепляющую мРНК и рРНК стимулируют синтез протеинкиназы, которая фосфорилирует и тем самым инактивирует фактор инициации трансляции IF2 прекращается синтез белков в инфицированных клетках человека, клетка погибает, но останавливается размножение вирусов Задание для самостоятельной работыИспользуя интернет-ресурсы и учебник выполните задания и составьте конспект по вопросам:1. Принцип метода полимеразной цепной реакции и его применение в медицине. 2. Роль нерепарированных изменений ДНК (мутаций) в развитии биохимической индивидуальности человека (полиморфизме генов и белков), наследственных заболеваний и канцерогенезе. 3. Заполните таблицу «Лекарственные препараты – ингибиторы матричных биосинтезов» (см. следующий слайд). Противоопухолевые и антибактериальные препараты – ингибиторы матричных биосинтезов
ЗаключениеПроцессы репликации, транскрипции, трансляции (матричные биосинтезы) лежат в основе «производства» белков и ферментов, функционирование которых является основой жизниРегуляция данных процессов лежит в основе адаптацииНарушение данных процессов приводит к развитию заболеванийЗнания о нуклеиновых кислотах и механизмах матричных биосинтезов являются основой создания лекарственных препаратов, методов диагностики и терапииЛитература1. Биохимия: учебник для ВУЗов / Е. С. Северин - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. -768 с. (раздел 4)2. Биологическая химия с упражнениями и задачами: учебник / ред. С. Е. Северин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 624 с. (С. 113 – 171, для выполнения самостоятельной работы п.1 и 2 С. 153-165)3. Биохимия с упражнениями и задачами: учебник для студ. мед. вузов / ред. Е. С. Северин. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 384 с. (раздел 3, С. 54-79; для выполнения самостоятельной работы п. 1-3 С. 70, 73-77)4. Биологическая химия: учебник для студентов медицинских вузов / А.Я. Николаев. – М.: Мед. информ. агенство, 2007. – 568 с. |