Радиобиология. Лекция Предмет радиобиологии. История возникновения и развития науки 9
 Скачать 1.3 Mb.
|
|
Анализ экспериментов с облучением белковых препаратов позволило выявить следующие типы повреждений этих молекул. Изменение аминокислотного состава. Нарушение высших ( четвертичной, третичной и вторичной) структур молекул Возникновение разрывов полипептидной цепи. Появление агрегатов молекул с высокими молекулярными массами. Разрыв SH-связей и возникновение свободных SH- групп Разрушение аминокислотных остатков. Большое число исследований посвящено выяснению механизмов поражения молекул нуклеиновых кислот в водных растворах. При помощи методов седиментации, хроматографии, электрофореза зарегистрированы появление поперечных сшивок и одиночных разрывов полинуклеотидных цепей в растворах ДНК после облучения. Показано, что возникновение однонитевых разрывов связано с повреждением азотистых оснований вследствие их взаимодействия с радикалами ОН Потеря инфекционной активности ДНК фага j 29 происходит в результате двухнитевых разрывов цепи. Вероятность появления двухнитевых разрывов пропорционально дозе облучения. Двухнитевые разрывы в молекуле ДНК появляются в результате накопления одиночных разрывов, т.е. при совпадении близкорасположенных разрывов в каждой цепи. Расчеты показывают, что уже при поглощенной дозе 1 Гр в каждой клетке человеческого организма повреждается до 5000, что приводит к возникновению около 1000 одиночных и до 100 двойных разрывов нуклеотидов в молекулах ДНК. Схематично представить процессы, происходящие в облученных клетках и живых организмах можно следующим образом: Молекулы, атомы ® ионы, свободные радикалы ® изменения в органических молекулах ® радиобиологический эффект ( например, мутация, болезнь, гибель ). Конечный (радиобиологический) эффект зависит от типа и дозы, от условий облучения и от свойств облучаемого ионизирующего излучения, объекта. Вопросы и задания. За счет какого механизма ( прямого или косвенного) происходит инактивация рибулозадифосфаткарбоксилазы листьев при облучении растений γ- излучением. Опишите, какие повреждения структуры молекул могут возникать при облучении рентгеновскими лучами: а) лиофильного высушенного препарата ДНК б) водного раствора ДНК. При облучении тканей происходит нарушение специфических свойств и функций биологических мембран, в частности нарушается избирательная проницаемость клеточной мембраны. Какие изменения в структуре мембран приводят нарушению функций мембран? Чем Вы объсните неодинаковую радиочувствительность различных ферментов? Дайте объяснения данным, приведенным на рис.3. Какие методы можно использовать для определения радиочувствительности молекул белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов? Почему при растворении кристаллов трипсина в буфере, радиочувствительность молекул повышается в десятки и сотни раз? Опишите физико-химические процессы, происходящие при облучении дистиллированной воды. Какие типы реакций могут иметь место при облучении а) раствора уксусной кислоты; б) раствора олеиновой кислоты; в) раствора глицина; г) раствора белка; д) раствора ДНК. Будут ли одинаковы велечины LD50, для молекул фермента в растворенном состоянии, в среде с кислородом и в среде без свободного кислорода. Опишите схематично процессы, происходящие при облучении живых организмов ионизирующими излучениями. Задачи. Рассчитайте величину поглощенной дозы при инактивации 50 % молекул, если число мишеней равно 1. Постройте дозовую кривую инактивации фермента по следующим данным: LD100 = 500 Гр, LD75 = 450, LD50 =300 Гр, LD37 = 180 Гр. При облучении раствора ДНК было повреждено 300 азотистых оснований, что составило 10 % от количества азотистых оснований в одиночной цепи ДНК. Рассчитайте молекулярную массу облучаемой молекулы ДНК. При какой дозе облучения инактивруется 80 % молекул РНК-азы (по данным рис. 3) Во сколько раз снижается активность химотрипсина при повышении поглощенной дозы от 100 до 1000 Гр ( по данным рис. 3). Лекция 7. Действие ионизирующих излучений на клетку . Радиочувствительность клеток. Любой радиобиологическийх эффект, проявляющийся на уровне органа и целого организма, возникает на клеточном уровне. Экспериментально показано, что облучение может повреждать все внутриклеточные структуры. Реакции на облучение на клеточном уровне могут проявляться в разнообразной форме: от незначительного повреждения отдельной структуры клетки до полной деградации и лизиса клетки. Степень выраженности клеточных реакций на облучение зависит, в большей степени, от количества поглощенной энергии (дозыионизирующего излучения), в меньшей степени, от генетической конституции и физиологического состояния клетки. Как известно, жизнь клетки между двумя последовательными делениями (от деления до деления) называют интерфазой. Условно интерфаза подразделяется на три периода: синтетический или S-период, в течение которого происходит синтез (удвоение) ДНК, предсинтетический G1- период и постсинтетический G2 –период. Митоз (деление соматических клеток) обозначают символом М. Продолжительность различных периодов клеточного цикла у разных клеток неодинакова. Как правило, для большинства типов клеток, по продолжительности различные клеточные фазы, располагаются следующим образом: М < G2 < S < G1. Абсолютная продолжительность периодов зависит от типа клеток. В малообновляющихся тканях млекопитающих (например, в нервной ткани) большинство клеток находится в G1- периоде в течение длительного промежутка времени, от нескольких месяцев до нескольких десятков лет. Тогда как клетки регенерирующих тканей, например, клетки крипт кишечного эпителия человека делятся в среднем через каждые 20 часов (G1-период занимает 10 ч, S-период - 8 ч, G2 -период и митоз - 2 ч). Часть лучевых повреждений могут легко переноситься клеткой, так как они являются повреждениями множественных структур, утрата которых быстро восстанавливается. Легко переносимые и быстро восстанавливающиеся повреждения клетки, проявляются в виде физиологических или кумулятивных эффектов (реакций). К таким повреждениям относятся, например, нарушения структуры отдельных макромолекул, отдельных органоидов, незначительные нарушения в структуре плазмалеммы. Такие структурные изменения могут выхзвать нарушения отдельных стадий метаболизма клетки, например, инактивацию ферментов, нарушения окислительного фосфорилирования в митохондриях, нарушения обмена белков, НК, углеводов и т. д. Как правило, эти реакции проявляются сразу после облучения и с течением определенного промежутка времени исчезают. Наиболее универсальной физиологической хорошо изученной реакцией клетки на облучение является временная задержка процесса клеточного деления (радиационное блокирование митоза). Суть ее состоит в том, что интерфазная клетка, облученная в определенной дозе, не начинает делиться в ожидаемый момент, а приступает к делению через определенный промежуток времени. Эта реакция является универсальной, т.е. проявляется у различных типов клеток всех живых организмов. Задержка клеточного деления хорошо изучена и в количественном отношении на клетках различных групп живых организмов. Выраженность и продолжительность времени задержки клеточного деления зависит от дозы ионизирующего излучения, от типа клетки и от того, на какой стадии клеточного цикла произошло облучение. Наибольший эффект наблюдается при облучении клеток находящихся в S-периоде и G2 –периоде. Судьба облученных клеток после задержки деления может быть различной, она также зависит от величины поглощенной дозы. Большая часть облученных клеток после задержки деления проходит митоз и делится. Часть из них после этого гибнет, еще больше клеток гибнут после второго, третьего и последующих делений. Часть облученных клеток и их потомков, вступив в митоз, не способны разделиться. В результате возникают так называемые гигантские клетки, по своим размерам в десятки и сотни раз больше нормальных клеток. Длительность задержки клеточного деления зависит от поглощенной дозы излучения: чем выше доза, тем больше время задержки деления. В результате проведения многочисленных экспериментов установлено, что для большинства изученных типов клеток, время задержки деления составляет примерно 1 час на каждый 1 Зиверт эквивалентной дозы. Таким образом, универсальность этой реакции клеток на облучение проявляется и в количественном отношении. Необходимо отметить, что с увеличением дозы излучения возрастает не доля прореагировавших клеток, а продолжительность времени задержки деления каждой клетки. В этом состоит принципиальное различие физиологических эффектов облучения от летальных поражений клеток. Продолжительность задержки клеточного деления зависит и от стадии клеточного цикла, на которой находилась облученная клетка. Наиболее длительно время задержки при облучении клеток в S-периоде и G2 –периоде, самое короткое – при облучении в митозе. Большинство клеток, вступивших в митоз, даже при облучении очень высокими дозами, заканчивают деление без задержки. Молекулярные механизмы, ответственные за задержку клеточного деления, пока не известны и они активно обсуждаются. Многие исследователи связывают торможение митозов с подавлением синтеза ДНК. Однако, экспериментальные данные свидетельствуют, что снижение содержания ДНК в клетках является не причиной, а следствием задержки деления. Предполагается, что блокирование митозов вызывается повреждением внутриклеточных структур, ответственных за регуляцию процесса деления ядра и клетки. По-видимому, задержка клеточного деления не является специфическим ответом на действие ионизирующего излучения, а представляет универсальный защитный механизм организма на любые внешние воздействия. Задержка клеточного деления реакция наблюдается и при действии на организм или на культуру клеток других физических и химических факторов. Задержку клеточного деления на определенное время необходимо отличать от полного подавления митозов при высоких дозах облучения, когда клетка в течение значительного промежутка времени продолжает функционировать, но необратимо утрачивает способность к делению. Интервал доз, в котором происходит временная задержка деления клеток, зависит радиочувствительности организма и от типа облучаемых клеток. Так, для большинства типов делящихся клеток млекопитающих этот интервал находится в пределах от 0 до 10 Зв. Летальные реакции клеток. Формы клеточной гибели при облучении. В радиобиологии принято различать две формы гибели клеток: репродуктивную и интерфазную гибель. Под репродуктивной гибелью подразумевается утрата клеткой способности к неограниченному размножению (пролиферации), т.е. к образованию клона. Репродуктивная гибель клеток заключается в необратимой потере способности к делению, облученными клетками или их потомками. Репродуктивная гибель клеток имеет место при относительно невысоких дозах облучения. Этот радиобиологический эффект хорошо изучен количественными методами на различных типах клеток. Репродуктивная гибель делящихся клеток происходит не сразу после облучения, а постепенно, в процессе нескольких циклов деления. Так показано, что при облучении культуры фибробластов мышей в дозе 4 Гр, около 80 % клеток заканчивали 1 деление, а второе и третье деление завершали только 30 % начавшихся делиться клеток. Репродуктивная гибель клеток проявляется в образовании гигантских клеток в результате слияния нескольких клеток или при длительной задержке цитокинеза. Вторая форма радиационной гибели клеток - интерфазная гибель - наступает при облучении клеток высокими дозами радиации. Интерфазная гибель клетки обуславливается появлением в ее структуре значительных нарушений, после которых она теряет способность к функционированию как живая система. При очень высоких поглощенных дозах ( сотни и тысячи Грей) гибель клеток наступает мгновенно или вскоре после облучения. В диапазоне небольших доз ( до 10 Гр для клеток млекопитающих) гибель клеток наступает в первые часы после облучения. Интерфазную гибель клеток можно зарегистрировать цитологическими методами: на препаратах облученных клеток хорошо видны различные дегенеративные изменения в структуре (лизис ядра, разрывы мембран, хромосомные аберрации ). У мертвых клеток изменяются биохимические и физиологические параметры: теряется избирательная проницаемость плазмалеммы, активируются гидролитические ферменты, подавляется процесс клеточного дыхания. Одним из универсальных показателей интерфазной гибели клеток является окрашиваемость цитоаплазмы клеток различными красителями. Окрашивание цитоплазмы связано с потерей избирательной проницаемости клеточной мембраны, и неспособностью мертвой клетки удалять из цитоплазмы красители. При анализе облученной популяции клеток, можно руководствоваться следующей закономерностью: чем выше поглощенная доза и радиочувствительность клеток, тем выше вероятность интерфазной гибели этих клеток. Детальные механизмы, вызывающие репродуктивную и интерфазную гибель клеток остаются пока невыясненными. Предполагается, что основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения молекул нуклеиновых кислот, в первую очередь, хромосомной ДНК. Такие повреждения легко обнаруживаются цитологическими методами в виде различных хромосомных перестроек (аберраций). Основными типами таких аберраций являются фрагментация хромосом, образование различных межхромосомных стяжек, появление кольцевых хромосом, внутри и межхромосомный обмен участками. Аберрации нарушают процесс деления ядра и клетки, приводят к частичной утрате генетического материала и клетка гибнет из-за неспособности синтезировать белковые молекулы. Интерфазная гибель клеток наступает вследствие многочисленных структурных нарушений, в первую очередь нарушений в структуре мембран, приводящей к потере клеточного гомеостаза. Предполагается, в интерфазной гибели клеток большую роль играют гидролитические ферменты, которые расщепляют молекулы белков и нуклеиновых кислот. Более подробно механизмы клеточной гибели будут рассмотрены ниже. Оценка клеточной радиочувствительности. Кривые выживания. Для определения количества живых клеток после облучения используют способность живых клеток к неограниченному размножению, вследствие чего одиночные клетки образуют колонии или так называемые «бляшки» на поверхности питательных сред. Рассмотрим некоторые классические опыты, которые явились основой для создания методов, используемых для количественной оценки радиочувствительности клеточных культур. Впервые количественнй метод для определения выживаемости клеток был разработан в 1965 году Г.Паком и П. Маркусом на культуре клеток HeLa. Суть этого метода заключается в следующем. Определенное количество культуральных клеток высевают на твердую питательную среду в чашках Петри. После этого чашки с клетками облучают различными дозами радиации и инкубируют в оптимальных, для роста этих клеток, условиях. Через определенный промежуток времени подсчитывают число образовавшихся колоний на поверхности питательной среды. Выживаемость клеток при определенной дозе облучения определяют как отношение числа колоний выросших в облученных чашках, к числу колоний в контрольной чашке Петри (без облучения). Этот метод и в настоящее время широко используется для оценки радичувствительности клеток in vitro. Другой метод определения выживаемости клеток in vivo (в организме) был предложен в 1961 году Дж. Тилл и Е. Мак-Кулох. Клетки костного мозга, печени или селезенки вводят в вену летально облученных мышей. Через неделю на селезенке мышей появляются колонии, состоящие из потомства введенных клеток. Число колоний, образующихся на селезенке, показывает пролиферативную (клоногенную) способность введенных клеток. Эта способность зависит от дозы облучения вводимых клеток. Путем сравнения числа колоний, полученных от облученных в различных дозах клеток, и числа колоний на селезенках контрольных мышей (с клетками без облучения), получают кривые, описывающие зависимость доза-эффект, или кривые выживания. Современные технологии выращивания культур клеток и тканей позволяют экспериментаторам оценить in vitro радиочувствительность любых типов клеток микроорганизмов, растений и животных. Кривые выживания клеток Кривой выживания называют кривую, описывающую зависимость количества выживших клеток, организмов от дозы облучения. Кривая выживания представляет кривую «доза-эффект», когда критерием радиобиологического эффекта является смерть клетки. Как уже отмечалось, кривые «доза-эффект» имеют экспоненциальный характер. Кривые выживания, полученные опытным путем на различных типах клеток, отличаются от теоретических ожидаемых кривых. Они также отличаются и от классических дозовых кривых, полученных в экспериментах с макромолекулами. Кривые выживания описываются уравнением N/ N0 = 1 - (1- e-D/D0)n где n - экстраполяционное число, которое определяется как значение ординаты в месте ее пересечения с экстраполированным прямолинейным участком кривой выживания. D0 - приращение дозы, снижающее выживаемость клеток в е раз на прямолинейном участке кривой выживания. Как видно, кривые выживания имеют так называемое «плечо», т.е. относительно горизонтальный участок кривой до определенной дозы, где повышение дозы незначительно снижает количество живых клеток. Рис. 1. Основные показатели кривой выживаемости клеток при облучении культуры клеток ELD рентгеновскими лучами (Ярмоненко и др., 1976) Таким образом, построив на основе экспериментальных данных, кривую выживаемости можно определить значения величин D37, D0, Dq, n, которые характеризуют радиочувствительност клеток и их способность восстанавливать радиационные повреждения. При дозе D37 (среднелетальной) погибает 37 % облученных клеток. D0, Dq - характеризуют регенерационную способность клеток, которая в кончном счете характеризует устойчивость клеток к облучению. Чем выше значение Dq, чем длиннее плечо, тем выше способность клеток посрадиационному восстановлению и следовательно, их устойчивость к облучению. Не докончнена. Доделать Механизмы радиационной гибели клеток Интерфазная гибель клетки при облучении обуславливается, прежде всего, нарушением структуры ее основных компонентов: ядра, органоидов и других цитоплазматических структур. Вопрос о том, какой из структурных компонентов наиболее ответственен за гибель клетки при облучении, до сих пор остается дискуссионным. Существует большое количество работ, свидетельствующих о большей радиочувствительности ядерных компонентов по сравнению с цитоплазматическими структурами. Так, летальный эффект на клетках яиц беспозвоночных достигается при локальном облучении ядер микропучками рентгеновского излучения, в интервале доз 500 - 1000 Гр. При облучении цитоплазмы аналогичный эффект наблюдался при более высоких дозах, в интервале 90 - 140 кГр. Убедительные данные о более высокой радиочувствительности ядра по сравнению с цитоплазмой, получены в экспериментах И. Орда и К. Даниели. Они установили, что пересадка летально облученных ядер в необлученную цитоплазму приводит к гибели клетки, тогда как пересадка необлученных ядер в летально облученные клетки обеспечивает почти 100 % их выживаемость. Нужно отметить и работы Б.Л. Астаурова на тутовом шелкопряде, который показал роль ядра в выживаемости облученных клеток. Раскрыть! На основании этих и других экспериментов, некоторые исследователи считают, что поражение ядра является первопричиной лучевой гибели клеток. Однако, другие эксперименты свидетельствуют, что в реализации летального эффекта при облучении клеток несомненна и роль цитоплазматических структур. Исходя из этих данных, определены основные процессы в облученной клетке, которые, в конечном счете, приводят к ее гибели. Структурные повреждения в молекулах нуклеиновых кислот нарушают процессы репликации, транскрипции, трансляции, т.е. реализации генетической информации. Нарушения в структуре белковых молекул приводят к потере активности ферментов, двигательных белков, переносчиков ионов и молекул. Перекисное окисление молекул липидов приводит к деструкции клеточных мембран. Это сопровождается потерей избирательной проницаемости мембран, изменением градиентов концентрации вещества, энергии в клетке и клеточных структурах. Одновременно, накопление продуктов перекисного окисления приводит к развитию токсического эффекта в клетках. Исходя из сказанного, можно заключить, что интерфазная гибель клетки не связана с повреждением какой либо одной структуры, а происходит в результате дисперсного ее поражения. Структурные повреждения могут усиливаться за счет инициируемых радиацией физико-химических процессов. Однако, необходимо учитывать, что деструктивным процессам, вызванным облучением, в клетках противостоит система восстановления повреждений структур (репарационная система). Поэтому летальный эффект облучения в клетке, определяется соотношением двух противоположных процессов, деструктивных и репарационных. Пострадиационное восстановление клеток Многочисленные эксперименты показывают, что живые организмы способны восстанавливать, по крайней мере, какую-то часть лучевых повреждений. На это указывают следующие факты. Количество погибших клеток, организмов, случаев задержки клеточного деления, различные морфологические и биохимические эффекты облучения при определенной дозе уменьшаются, если эта доза поглощается дискретно, т.е. порциями с определенными промежутками времени. Перерывы между облучениями клетки используют для восстановления от ряда повреждений структур. Уменьшение интенсивности радиобиологического эффекта наблюдается и в том случае, если определенную дозу клетке или организму давать в течение длительного промежутка времени, т.е. облучение с малой мощностью дозы менее эффективно, чем облучение высоким мощностями дозы. Восстановление после облучения - это процесс ликвидации явных или скрытых повреждений, которые могли бы привести тому или иному радиобиологическому эффекту. Различают летальные и потенциально-летальные (потенциальные) повреждения. Повреждения называют потенциальными, если они могут привести к гибели клетки, но в определенных условиях такие повреждения могут быть восстановлены репарационной системой клетки. Реализация потенциальных повреждений зависит от физиологического состояния клетки и от внешних условий. Влияние условий пострадиационного культивирования показано на различных живых объектах: вирусах, бактериальных клетках, клетках грибов, клетках растений и животных. Впервые такой факт был обнаружен еще в 1949 году Ф. Шерманом и К. Чейзом, в экспериментах с дрожжевыми клетками. Они показали, что выживаемость облученных дрожжей увеличивается, если клетки помещать в питательную среду не сразу после облучения, а после инкубации их в течение определенного времени в буферном растворе. Однако, тогда эти авторы не смогли дать объяснение этому явлению. Способность клеток к пострадиационному восстановлению впервые экспериментально показал В.И.Корогодин. В его экспериментах суспензию дрожжей облучали в дозе 1,2 кГр, затем делили суспензию на две равные части. Одну часть клеток сразу высевали на питательную среду в чашки Петри, другую часть клеток перед посевом выдерживали в течение 2 суток в буфере без питательной среды. Оказалось, что в первом случае выжило только 0,2 % клеток, то из второй части суспензии выживало около 40 % облученных клеток. Результат этого опыта свидетельствует, что клетки обладают способностью к самовосстановлению после летального облучения, и эта способность не зависит от наличия в популяции нелетально пораженных особей. В радиобиологии принято различать медленное и быстрое восстановление облученных клеток. В описанном выше эксперименте В. Корогодина обнаружено медленное восстановление, т.е. протекание процессов занимает несколько часов. Наряду с такими долго протекающими физиологическими реакциями в клетках при облучении появляются и другие потенциальные повреждения, которые реализуются в летальные в течение нескольких минут после облучения. Восстановление таких повреждений называют быстрым восстановлением. Явление быстрого восстановления было обнаружено в 1981 году, в экспериментах с дрожжевыми клетками. Оказалось, что понижение температуры среды после облучения с 20 С до 3 С приводит к существенному снижению выживаемости клеток. Наоборот, выдерживание клеток при температуре 28 С после их облучения при 0 С, повышает выживаемость клеток. На рисунке 9 динамика выживаемости облученных клеток, выращенных в различных питательных средах, при инкубации их в дистиллированной воде при температуре 28 С. Рис. 2. Динамика восстановления жизнеспособности дрожжевых клеток после облучения в дозе 40 Гр. - клетки, выращенные на стандартной питательной среде, клетки, выращенные на питательной среде с 10 % NaCl Как видно, в первые 1,5 часа происходит быстрое повышение выживаемости клеток, выращенных на соленой среде, что соответствует стадии быстрого восстановления. Примерно через 2 – 25 часов после облучения показатель выживаемости клеток изменяется медленно. В этот промежуток времени происходит репарация повреждений в клетках за счет медленного восстановления. У клеток выращенных на стандартной питательной среде наблюдали повышение выживаемости только за счет медленного восстановления. Молекулярные механизмы пострадиационной репарации. Как уже отмечалось, ведущая роль в деструктивных процессах, ответственных за радиационное поражение клеток, принадлежит макромолекулам и макромолекулярным комплексам. Радиобиологический эффект начинается с нарушения структуры молекул, в первую очередь НК, белков, полисахаридов, липидов. Способность клеток к восстановлению после облучения, главным образом, связано с репарацией молекул ДНК и РНК. Как известно, эти молекулы ответственны за синтез новых молекул белков, и соответственно, всех других биологически важных молекул. Имеющиеся в распоряжении исследователей методы позволяют в настоящее время детально охарактеризовать макромолекулы по различным физико-химическим, биохимическим параметрам. Молекулярные механизмы репарации клеток интенсивно изучаются и в настоящее время известны определенные закономерности протекания этих процессов. Рассмотрим механизмы посрадиационной репарации молекул ДНК. Репарация молекул ДНК может быть дорепликативной, репликативной и пострепликативной, в зависимости от того, на какой стадии клеточного цикла находилась облучаемая клетка. Дорепликативная репарация происходит путем восстановления разрывов полинуклеотидной цепи, удаления поврежденных оснований и замены их неповрежденными. Все эти процессы происходят с участием специальных ферментативных систем. В самом простейшем случае, воссоединение одиночного разрыва цепи может быть осуществлено ферментом ДНК- лигазой. Репарация более сложных повреждений требует участия нескольких ферментов, эндо- и экзонуклеаз, ДНК- полимераз и других ферментов, которые подготавливают молекулу для заключительного акта репарации - восстановление связи с помощью лигаз. По продолжительности времени протекания, выявлены три типа репарации одиночных разрывов молекулы ДНК: сверхбыстрая, быстрая и медленная. Сверхбыстрая репарация происходит в течение 1-2 минут и осуществляется всего лишь одним ферментом: ДНК -лигазой. Быстрая репарация ДНК занимает время до 10 минут. В этих реакциях восстановления, кроме лигаз, принимают участие и ДНК-полимеразы. Медленная репарация молекул осуществляется в течение 1 часа, воссоединяя около двух разрывов на каждую молекулу ДНК. Феномен репарации молекул ДНК показано на всех исследованных объектах, от бактериальных клеток до клеток млекопитающих. Наряду с разрывами полинуклеотидной цепи при облучении в молеукле возникают множество повреждений нуклеотидов, которые ликвидируются системой экцизионной репарации. Этот вид репарации представляет собой процесс выщепления поврежденного нуклеотида и замены его неповрежденным мономером. Вначале специфические эндонуклеазы разрезают нить ДНК вблизи поврежденного основания с захватом нескольких интактных нуклеотидов, затем ДНК-полимераза 1 синтезирует удаленную последовательность оснований, потом полинуклеотидлигаза присоединяет синтезированный участок к основной цепи ДНК. Нужно описать детально Необходимо отметить, что репарация повреждений ДНК - процесс метаболический. Она осуществляется ферментами, постоянно присутствующими в клетке. Эти ферменты участвуют как в нормальных физиологических реакциях, так и в патологических реакциях. Механизмы репарации ДНК одинаковы при действии различных повреждающих факторов, в т.ч. и ионизирующего излучения, Так как пострадиационная репарация ферментативный процесс, то интенсивность и скорость восстановления, и следовательно способность к выживанию, зависят от физиологического состояния клетки. Как и все синтетические процессы в клетке, репарация протекает с затратой энергии молекул АТФ. Показано, что обработка клеток фторидом натрия (разобщитель дыхания), снижает скорость восстановления клеток от лучевого поражения. Интенсивность восстановления клеток снижается и с уменьшением температуры. При температурах 2-5 °С репарационные процессы в клетках многих организмов прекращаются. Таким образом, радиочувствительность клетки, летальный исход ее облучения, определяются совокупностью многих факторов и процессов. Реализация тех или иных процессов зависит от ряда условий, в которых находится клетка, в первую очередь от стадии клеточного цикла. Самыми радиочувствительными являются делящиеся клетки, т.е. клетки находящиеся на стадии митоза. Максимальной устойчивостью (выживаемостью) характеризуются клетки в интерфазе. Устойчивость клеток к облучению в конце S-фазы, для большинства типов клеток, на один порядок выше, чем клеток в митозе. На рисунке 3 показана радиочувствительность клеток китайского хомячка, находящихся на разных стадиях клеточного цикла. Нет конца! Доделать! Рис.3. Зависимость выживаемости облученных клеток китайского хомячка при облучении их на разных фазах клеточного цикла. Вопросы и контрольные задания. От каких факторов зависит радиочувствительность клеток? Приведите примеры «физиологических» эффектов, возникающих при облучении в клетке. Объясните смысл выражения « задержка клеточного деления - универсальный радиобиологический эффект» Какие способы Вы можете предложить для определения количества погибших клеток при облучении: а) бактериальных клеток б) дрожжевых клеток в) клеток печени животных Кривые выживания клеток, построенные на основе экспериментальных данных, не совпадают с теоретически ожидаемыми кривыми выживания. Почему? Предложите схему эксперимента для определения «быстрого» и «медленного» восстановления облученных клеток бактерий. Способность клеток к восстановлению после облучения связано, в первую очередь, с репарацией молекул нуклеиновых кислот. Почему? Для определения радиоустойчивости дрожжевых клеток провели следующий эксперимент. Клетки одного клона высеяли в 3 чашки Петри и инкубировали при разных условиях освещенности в течение 2 суток. Первую чашку инкубировали в темноте, вторую освещали светом от лампы накаливания, третью чашку инкубировали на солнечном свету. Затем все чашки облучили рентегеновским излучением при мощности дозы 50 Гр/мин в течение 3 мин и определили выживаемость клеток в каждой чашке. Будет ли количество выживших клеток одинаковым в различных чашках? Ответ обоснуйте. От каких внешних и внутренних факторов зависит интенсивность репарационных процессов в облученной клетке? Лекция 8а. Действие ионизирующих излучений на живые организмы. Радиочувствительность живых организмов. Понятие “критического” органа. Радиационные синдромы. Кроветворный синдром. Клеточные обновления при поражениях красного костного мозга. Желудочно-кишечный и церебральный синдромы. Биологическая эффективность ионизирующих излучений чрезвычайно высока. По эффективности воздействия на живые системы ионизирующая радиация превосходит все виды физических воздействий, в т.ч. все известные виды излучений. На Земле нет ни одного организма, которого нельзя было бы убить действием ионизирующего излучения, и нет какой-либо биологической функции, которая не подавлялась бы в результате действия радиации. В то же время, результаты многочисленных экспериментов показывают, что различные организмы обладают неодинаковой устойчивостью (чувствительностью) к действию ионизирующих излучений. Наиболее интегральными показателями для выражения радиочувствительности живых организмов является поглощенная или эквивалентная дозы ионизирующего излучения, при которой погибает 100 % или 50 % особей облученной популяции. Соответственно, эти дозы получили название летальной (LD100) или полулетальной ( LD50 ) дозы. Оценку выживаемости облученных организмов проводят через промежуток времени после облучения, соотносимый со временем жизни этих организмов. При определении радиустойчивости живых объектов необходимо также учитывать и время, необходимое для проявления патологических симптомов радиационного облучения. Так, при определении радиочувствительности млекопитающих, подсчет выживших особей производят через 30 суток после облучения. За это время у выживших животных заканчивается острый период лучевой болезни, и они начинают выздоравливать. В этом случае, в символ для обозначения летальной и полулетальной доз ставят индекс, выражающий количество суток после облучения, например, LD100/30. Для определения выживаемости микроорганизмов подбирают такой временной интервал, который необходим для образования колоний клеток определенного размера. О выживаемости вирусов после облучения судят по их способности размножаться в клетках. Исследования радиоустойчивости представителей различных видов живых организмов позволили выявить следующую закономерность: чем выше в эволюционном отношении вид, тем выше радиочувствительность особей - представителей этого вида. В таблице 1 приведены значения поглощенной дозы рентгеновского излучения, приводящих к гибели представителей различных филогенетических групп живых организмов. Как видно, наиболее устойчивы к действию ионизирующих излучений одноклеточные организмы. Радиоустойчивость млекопитающих животных в сотни и тысячи раз меньше, чем устойчивость одноклеточных. Таблица 1. Интервалы летальных доз рентгеновского излучения для живых организмов - представителей различных филогенетических групп
|