лекция ТМС_071015. Массспектрометрия
 Скачать 82 Kb.
|
|
Масс-спектрометрия — это физико-химический метод определения химической структуры и состава образца путем ионизации молекул с образованием заряженных молекул или их фрагментов с последующим измерением отношения их массы к заряду (m/z) Масс-спектрометрия обладает высочайшими специфичностью и точностью, может определить структурные компоненты в концентрации 10-15,10-18, 10-21 грамма Тандемный масс-спектрометр представляет собой два масс-спектрометра последовательно соединенных через специальную «камеру соударений». Принцип работы ТМС состоит в последовательных реакциях. На первом этапе под действием высокой температуры и подаваемого газа азота происходит образование положительно заряженных ионов, затем электростатическое движение переносит эти ионы в анализатор масс первого масс-спектрометра, в нем идет разделение (отбраковка) материнских ионов по массе и заряду, отправка ионов искомой массы в камеру соударений, наполненную аргоном, фрагментация данных ионов на дочерние ионы, детекция спектра масс дочерних ионов, подсчет количества ионов определяемых веществ по отношению массы к заряду. Вся эта процедура управляется специальным программным обеспечением для неонатального скрининга методом ТМС. Таким образом ТМС-система включает дозатор (податчик) проб, ионизатор проб, анализатор масс веществ, детектор ионов. Кроме того работа ТМС-анализатора обеспечивается следующими приборами. Это менеджер проб для подачи образцов, Насос для создания вакуума сам тандемный масс-спектрометр, Генератор азота, Емкость с аргоном, Диагностические наборы, Программное обеспечение Технология тандемной масс-спектрометрии при неонатальном скрининге включает следующие этапы
Основными областями применения масс-спектрометрии в медицине и биологии является неонатальный скрининг; токсикология, фармацевтика; контроль наркотических средств, допинговый контроль; судебная медицина; генная инженерия и биохимия, протеомика, клиническая химия. В настоящее время во многих странах мира проводится массовый неонатальный скрининг новорожденных, в первую очередь на фенилкетонурию. В странах Европы и США неонатальный скрининг включает диагностику от 5 до 45 форм наследственных болезней обмена С 2006 года в России массовый обязательный скрининг включает 5 заболеваний – это галактоземия, муковисцидоз, адрено-генитальный синдром, фенилкетонурия, врожденный гипотиреоз. Современные технологии, подобные ТМС позволяют проводить скрининг на многие формы наследственных болезней обмена (НБО) Данные по неонатальному скринингу в разных странах мира В США – при неонатальном скрининге определяют 45 заболеваний ( из них с помощью ТМС – 40 заболеваний) В Германии –14 заболеваний, в Великобритании – 5 заболеваний ( с помощью ТМС только — Фенилкетонурию и недостаточность среднецепочечной АЦИЛ-КоА ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ (MCAD) Во Франции как и в России выявляют только 5 заболеваний (без использования ТМС) В Индии вообще нет общегосударственной программы неонатального скрининга - ( его проводят проводят только в отдельных штатах страны) Как уже говорилось выше, в России утвержденный законодательно неонатальный скрининг включает 5 заболеваний (ТМС-скрининг проводят только в Екатеринбурге, Москве, Санкт-Петербурге) В тоже время внедрение применениеТМС позволит количественно определять большое количество метаболитов, являющихся маркерами наследственных болезней обмена (НБО) и большее количество заболеваний. ТМС применяется для диагностики трех основных групп НБО (нарушений обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального β-окисления жирных кислот). Но надо понимать, что ТМС является только первым этапом диагностики НБО и требует проведения подтверждающей диагностики. ТМС должна использовать в комплексе с такими методами подтверждающей диагностики как ДНК-диагностика , исследование органических кислот мочи и т.д. В настоящее время в нашей лаборатории установлено два тандемных-масс-спектрометра. В своей работе мы используем импортные коммерческие наборы реагентов для неонатального скрининга производства компании PerkinElmer (США) Набор рассчитан на 960 определений , включает внутренние стандарты и контрольные образцы. Набор позволяет определять сукцинилацетон, 11 аминокислот, свободный карнитин и 31 ацилкарнитин и более 60 нарушений метаболизма. Концентрация каждого аналита определяется относительно концентрации соответствующего внутреннего стандарта, помеченного стабильными изотопами углерода и водорода. Измерение каждого аналита производится в режиме мониторинга множественных реакций в течение установленного времени. Кратко расскажу что такое ацикарнитины и сукцинилацетон. Ацилкарнитины - это производные L-карнитина, природного вещества, родственного витаминам группы В. Карнитин синтезируется в организме, также его называют витаминоподобным веществом. Карнитин связывается с токсическими жирными кислотами образует ацилкарнитины - эфиры карнитина и жирных кислот, которые обладают способностью проникать внутрь митохондрий. Сами жирные кислоты различают по длине углеродной цепи. Существуют короткоцепочечные, среднецепочечные и длинноцепочечные жирные кислоты. Отсюда и ацилкарнитины делятся на короткоцепочечные (C2,C3,C4,C5,C5:1) среднецепочечные (C6-C12)и длинноцепочечные (C14-C18). Нарущения обмена органических кислот и окисления жирных кислот сопровождаются изменениями концентрации тех или иных ацилкарнитинов. При истощении общего эндогенного свободного карнитина вследствие связывания его с жирными или органическими кислотами происходит снижение его концентрации в крови и увеличение концентрации тех или иных ацилкарнитинов. Это позволяет проводить диагностику наследственных болезней обмена. Сукцинилацетон является дикетоном (кетоном с двумя карбонильными группами СО в составе). Это высокотоксичное и канцерогенное вещество, продукт распада производных тирозина фумарилацетоацетата и малеилацетоацетата. Как уже говорилось выше ТМС позволяет выявлять 3 группы наследственных заболеваний обмена веществ Нарушения метаболизма аминокислот или аминоацидопатии. При аминоацидопатиях отсутствуют или имеют пониженную активность ферменты, необходимые для обмена некоторых аминокислот. В результате этого организма ребенка повышается концентрация аминокислот и альтернативных метаболитов (например, сукцинилацетона). Такое превышение может иметь вредное влияние на здоровье ребенка и даже привести к летальному исхлдую Здесь в первую очередь имеет значение увеличения концентрации тех или иных аминокислот и сукцинилацетона Главным образом исследуются следующие аминоацидопатии, сопровождающиеся увеличением концентрации: лейцина, изолейцина и валина при лейцинозе или болезни кленового сиропа (1:185 000). Своеобразный запах мочи больных, в которой обнаруживается присутствие аминокислот с разветвлённой цепью, напоминает запах кленового сиропа При отсутствии лечения при болезни кленового сиропа появляется затороможенность, постепенно переходящая в кому, задержка в развитии, судороги. При Фенилкетонурии (1:8000) отмечается увеличение концентрации фенилаланина. При этом заболевании не происходит превращение фенилаланина в тирозин. При отсутствии лечения фенилкетонурия ведет к умственной отсталости и мышечной ригидности. Увеличение аминокислот тирозина, метионина, пролина и кетона сукцинилацетона наблюдается при тирозинемии 1 типа (1:100 000). Это заболевание связанно с врожденным дефицитом фермента фумарилацетогидролазы. Недостаточность этого фермента приводит к накоплению в организме тирозина и его производных и тяжелым клиническим проявлениям. Тирозинемия 1 типа сопровождается острой печеночной недостаточностью или хроническим циррозом и злокачественной гепатомой. Поражение печени связано с токсическим и канцерогенным влиянием сукцинилацетона и фумарилацетоацетата и малеилацетоацетата. Увеличение количества глицина характерно для гиперглицинемии (1:55 000) А увеличение уровня цитрулина при Цитрулинемии (1:250 0000). При цитруллинемии наблюдаются судороги, анорексия, рвота, заторможенность, за которой может последовать кома с летальным исходом. Следующая группа заболеваний, выявляемых методом ТМС это нарушения метаболизма органических кислот или органические ацидурии При органических ацидуриях нарушаются пути метаболизма органических кислот, вследствие чего происходит накопление этих кислот в крови и моче, что изменяет кислотно-щелочной баланс организма. Появляющиеся в результате этого изменения или переход к промежуточным метаболическим путям могут вызвать появление многочисленных клинических симптомов, включая метаболический ацидоз, кетоз, гипераммониемию, отсутствие прибавки в весе, сепсис и кому. Основными методами подтверждающей диагностики органических ацидурий являются биохимические. В биологических жидкостях (моча и кровь) определяют повышенную концентрацию органических кислот и ацилкарнитинов. Органические кислоты определяют методом хроматомассспектрометрии, ацилкарнитины - методом тандемной масс-спектрометрии. Для диагностики органических ацидурий важно знать содержание свободного карнитина C0 и ацилкарнитинов начиная с C2 по C16, а также аминокислот глицина, лейцина, цитруллина и содержание сукцинилацетона. Главным образом исследуются следующие органические ацидурии. Глютаровая ацидурия 1 типа (1:30 000) При данном заболевании повышаются концентрации глутаровой, 3-ОН-глутаровой кислот и глутарилкарнитина С5DC в десятки раз посравнению с нормой и повышение уровня ацилкарнитинов С10, С12,С14, С16, С18, С4, С6, С8 Пропионовая ацидемия (1:50 000) сопровождается повышением уровня ацилкарнитина С3 Метилмалоновая ацидурия (1:48 000) повышение С3 Изовалериановая ацидурия (1:50 000) повышение С5 Еще одна группа заболеваний, выявляемых методом ТМС это нарушения митохондриального β-окисления жирных кислот При нарушениях окисления жирных кислот фермены, необходимые для расщепления жирных кислот, отсутствуют или проявляют пониженную активность. Расщепление или окисление жирных кислот необходимо для выработки энергии при низком уровне глюкозы. Без этого источника энергии у больных детей могут развиваться рекуррентные заболевания, связанные с низким уровнем сахара в крови. В случае голодания, причиной которого зачастую являются такие заболевания, как воспаление среднего уха или грипп, может возникнуть метаболический кризис. У людей, пораженных болезнью, наблюдаются такие симптомы, как рвота, диарея, заторможенность, пароксизмы или кома. Невозможность диагностировать нарушения окисления жирных кислот может привести к образованию избыточного жира в печени, сердце и почках. Образование такого жира может вызвать появление самых разных симптомов, от печеночной недостаточности, энцефалопатии, осложнений на сердце и глаза до проблем общего развития мышц. Многие из этих клинических симптомов могут привести к летальному исходу. Большое число смертей вследствие нарушений окисления жирных кислот было неверно диагностировано как синдром внезапной смерти младенца (SIDS) или синдром Рейе Для диагностики нарушений обмена жирных кислот следует знать содержание и соотношение всех определяемых ацилкарнитинов Для основных нарушении окисления жирных кислот характерны следующие изменения по данным ТМС. Для дефицита Ас-CoA (ацил-КоА) дегидрогеназы средних цепей (MCAD) характерно повышение ацилкарнитинов C6, С8,С10,C10:1; Для дефицита Ас-CoA дегидрогеназы коротких цепей (SCAD) характерно повышение уровня C4; Дефицит Ас-CoA дегидрогеназы очень длинных цепей (VLCAD) сопровождается повышением концентрации C14 С14:1, C12, C16:1 ацилкарнитинов и резким снижением общего свободного карнитина C0. Дефицит карнитинтрансферазы пальмитиновой кислоты тип I (CPT I) сопровождается повышением общего свободного карнитина C0 и снижением C16, C18:1, C18:2. Дефицит карнитинтрансферазы пальмитиновой кислоты тип II (CPT II) имеет снижение C0 и повышение концентрации C16, C18:1, C18:2. Следует помнить, что повышение уровня одних и тех же ацилкарнитинов может наблюдаться при нескольких нарушениях метаболизма. Например, увеличение концентрации пропионилкарнитина (C3) характерно для пропионовой ацидурии, метилмалоновой ацидурии, недостаточности витамина В12, недостаточности кобаламина C, D или F. Для точной постановки диагноза требуется проведение подтверждающей диагностики, сопоставление клинических и лабораторных данных. Далее я бы хотел коснуться проблем клинической и лабораторной диагностики наследственных болезней обмена. Для клинической диагностики эти проблемы выражаются в 1. Отсутствии отличительных клинических признаков данных заболеваний 2.Неспецифичности симптомов заболевания в раннем неонатальном периоде 3. Маскировке под другие заболевания (эпилепсия, нейроинфекция, перинатальная патология) 4. Относительно малой распространенности данных заболеваний 5. Точная диагностика возможна только с помощью современных лабораторных методов Проблемы лабораторной диагностики наследственных болезней обмена методом ТМС выражаются в следующем
По нашему мнению перспективы использования ТМС и развития лабораторной службы в области диагностики редких наследственных болезней обмена выществ выглядят так Диагностика наследственных болезней обмена на клиническом уровне затруднена и требует проведения таких сложных тестов как ТМС Более широкое использование ТМС позволит анализировать большое число метаболитов и выявлять большее число наследственных болезней обмена Использование селективного скрининга методом ТМС по определенным показаниям принесет наибольшую эффективность Использование ТМС сделает возможным лабораторное мониторирование проводимой терапии и течения болезни Актуальна разработка и внедрение единых алгоритмов диагностики НБО Необходимо дальнейшее развитие материально-технической базы подтверждающей диагностики результатов ТМС Необходимо создание единого учебно-методического центра для подготовки и повышения квалификации специалистов для диагностики и лечения НБО |