мол биология тема Биочипы. Молек.Био. 8.1 Намазов. Метод биочипирования. Биочипы. Использование днкбиочипов
 Скачать 45.07 Kb.
|
|
Южно-Казахстанская медицинская академия  Кафедра(Билогии и Биохимии)Реферат Тема: Метод биочипирования. Биочипы. Использование ДНК-биочипов Выполнил:Намазов К Р Группа:B-ЖМОБ-13-22 Принял(а):Нысанбаева Г Н 2022г План: Введение 2 Основная часть 2.1Как устроен биочип 2.2 Подложки и гидрогель для микрочипов Заключение Литература Введение Основная задача современной персонифицированной медицины — выявлять риски возникновения заболевания у конкретного человека. Это поможет предупреждать болезни заранее и назначать адекватное лечение. Можно детально исследовать весь организм человека, чтобы понять, что именно в нем поражено, однако это дорогостоящий процесс, который занимает много времени. Именно поэтому учеными были разработаны биочипы, которые выявляют в одном анализе сотни и тысячи биомаркеров — соединений, свидетельствующих о наличии какого-либо расстройства или подверженности заболеванию. Идея разработки биочипов появилась в конце 1980-х годов и принадлежала нескольким группам ученых, в том числе из СССР, Югославии и Великобритании. В Советском Союзе директор Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской академии наук академик Андрей Дарьевич Мирзабеков предложил идею биочипов как альтернативу сложному на тот момент методу расшифровки последовательностей ДНК. Мирзабеков постулировал возможность размещения коротких фрагментов ДНК — зондов на плоской поверхности микроматриц в трехмерных полусферических ячейках гидрогеля. Ячейки с зондами размещались на подложках в строго упорядоченном виде. Поскольку локализация зондов в ячейках известна заранее, взаимодействие зондов с анализируемыми молекулами ДНК позволяло установить структуру протяженных участков ДНК. Таким образом, была впервые в мире предложена и обоснована теория секвенирования на ДНК-биочипах. 2 Основная часть 2.1Как устроен биочип? Биологический микрочип — это матрица ячеек, каждая из которых содержит специфичный зонд (молекула ДНК, белок, гликан, низкомолекулярный лиганд и так далее), распознающий свою мишень в анализируемом образце, например в капле крови. Предварительно обработанные и помеченные флуоресцентным красителем молекулы анализируемого образца, введенного в камеру биочипа, способны проникать внутрь ячеек и взаимодействовать со специфичными зондами. При облучении светом определенной длины волны поверхности биочипа ячейки, в которых произошло специфичное взаимодействие, флуоресцируют. Эту флуоресценцию можно зарегистрировать с помощью специального анализатора-микроскопа. Затем рассчитать интенсивность сигналов в каждой ячейке и, зная алгоритм обработки сигналов, установить наличие в исследуемом образце специфичной мишени — микроорганизма, вируса, мутации, хромосомной перестройки, онкомаркера, аллергена и так далее. Этот процесс позволяет оперативно выбирать адекватную стратегию лечения пациента. Матрица ячеек биочипа изготавливается посредством переноса капель смеси зондов и гидрогеля объемом 0,1 нанолитра из колодцев микропланшета на пластиковую подложку. Это делается с помощью сверхтонких металлических стержней механического робота. Такие капли могут перемещаться и сливаться на гидрофобной поверхности подложки, поэтому их очень важно зафиксировать через реакцию фотополимеризации с образованием ковалентных связей как между каплей и подложкой с активными группами подложки, так и между молекулами зонда и мономерами гидрогеля. Для этого подложки облучают светом с определенной длиной волны при строгих условиях: температура, влажность, время облучения, наличие инертного газа, вытесняющего молекулы кислорода. Таким образом, под действием ультрафиолетового излучения происходит совместная полимеризация молекулярных зондов (фрагментов ДНК, белков и так далее) с основными компонентами гидрогеля. В ходе реакции молекулярные зонды ковалентно присоединяются к растущим полимерным цепям и равномерно распределяются по всему объему геля, тем самым происходит иммобилизация зондов. 2.2Подложки и гидрогель для микрочиповМатрицу ячеек биочипов формируют на стекле, покрытом мономолекулярным слоем вещества, содержащего активные химические группы, взаимодействующие с наносимыми зондами. Технология гидрогелевых биочипов ИМБ РАН использует подложки из пластика, что существенно упрощает и удешевляет изготовление матриц. Российскими инженерами созданы пресс-формы для производства подложек и реакционных камер биочипа методом литья под давлением, что обеспечивает нашу технологическую независимость в данной области. Ключевым аспектом отечественной технологии биочипов является использование специального гидрогеля, в который помещают молекулярные зонды. Емкость иммобилизации зондов в гидрогелевых ячейках биочипа возрастает на несколько порядков. Это позволяет регистрировать сигналы в элементах чипа, в 10–100 раз превышающие таковые при иммобилизации на плоских стеклянных матрицах, и, соответственно, создавать и применять недорогие анализаторы биочипов. Трехмерная ячейка гидрогеля обеспечивает гораздо большую специфичность взаимодействия между анализируемой молекулой и зондом. Это помогает детектировать клинически значимые маркеры с очень высокой специфичностью, выдавая результат в формате «да — нет». Специализация биочиповИстория биочипов начиналась с анализа последовательностей ДНК. Одновременно проводимые в каждой ячейке реакции взаимодействия анализируемых молекул ДНК с иммобилизованными ДНК-зондами обеспечивают параллельную идентификацию множества геномных мишеней. Это позволяет использовать ДНК-биочипы в качестве эффективного молекулярного инструмента выявления клинически значимых маркеров возбудителей и причин социально значимых заболеваний, мониторинга пищевых продуктов, растительного сырья, возможных агро- и природных биоценозов. Биочипы могут также одновременно содержать ячейки с иммобилизованными белками или олигосахаридами. Причем в каждой отдельной ячейке может быть иммобилизован как индивидуальный молекулярный зонд, так и их комбинации в зависимости от целей эксперимента. Взаимодействие между различными классами молекул может происходить по типу «рецептор — лиганд», «антиген — антитело», «фермент — субстрат» и так далее. Находящийся в ячейке иммобилизованный лиганд белковой или небелковой природы при взаимодействии с образцом, содержащим анализируемые соединения, образует специфический комплекс. На этой стадии происходит разделение анализируемых соединений из смеси по их способности к специфическому связыванию с иммобилизованными лигандами. Это позволяет выполнять одновременный анализ нескольких биологических объектов на одном биочипе, реализуя принцип мультиплексного иммуноанализа, основанный на проведении множества реакций взаимодействия «антиген — антитело». Такой тест необходим для исследований в области протеомики, для диагностики всех типов заболеваний, которые характеризуются изменением большого числа показателей в сыворотке крови пациента. Персонифицированная медицина подразумевает всестороннее обследование пациента, то есть анализ его биологических жидкостей по максимальному спектру параметров. Определение ДНК-мутаций и соматических мутацийВажным направлением приложения технологии гидрогелевых биочипов явился анализ мутаций и полиморфизмов ДНК человека, ассоциированных с различными заболеваниями, для определения стратегии лечения и выбора терапии. Так, для обнаружения в клетках крови генетических изменений, приводящих к возникновению лейкоза, и для идентификации хромосомных перестроек, ассоциированных с определенными типами острых и хронических лейкозов (наиболее распространенных детских онкологических заболеваний), была разработана тест-система «ЛК-БИОЧИП». Эта тест-система обладает высокой прогностической ценностью и применялась в Национальном научно-практическом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева в Москве. Там анализировали образцы, поступавшие из 18 региональных гематологических центров РФ. Другая тест-система — «ПФ-БИОЧИП», созданная для определения ДНК-маркеров, коррелирующих с предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистых патологий при беременности, используется в НИИ акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта в Санкт-Петербурге. Разрабатываются варианты тест-систем на основе биочипов для определения чувствительности злокачественных клеток к противоопухолевой терапии. Для индивидуального подбора препаратов, действующих на молекулярные мишени в опухолевых клетках меланомы, создан биочип, позволяющий определять в генах BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11, MAP2K1 и MAP2K2 мутации, при которых показано (или, наоборот, бесполезно) применение таких препаратов таргетной терапии, как траметиниб (ингибитор протеинкиназ MEK½ или MAP2K½), иматиниб (ингибитор белка KIT) и вемурафениб (ингибитор протеинкиназы BRAF). Такой подход позволяет эффективно выявлять клинически значимые соматические мутации и сделать выбор в пользу определенного таргетного препарата у 70% больных меланомой. Биочипы, выявляющие возникновение аллергииУченые из Германии создали тест-систему «АЛЛЕРГО-БИОЧИП» для проведения параллельного анализа панелей специфических иммуноглобулинов классов E и G4 (sIgE и sIgG4) к аллергенам следующих классов: пыльцевые (деревья и кустарники), пыльцевые (сорные травы и цветы), пыльцевые (травы и злаки), аллергены домашней пыли и животных, эпидермальные, яды насекомых, клещевые, пищевые, грибковые. Такой биочип быстро и эффективно выявляет причины возникновения аллергии. Было проведено эпидемиологическое исследование, включавшее 800 пациентов ДГКБ имени Филатова в возрасте от 0 до 16 лет и 50 здоровых доноров как модельной популяции детей средней полосы России, на предмет оценки частот встречаемости различных причин аллергии в зависимости от возраста. Было обнаружено, что среди вдыхаемых аллергенов наиболее часто вызывают сенсибилизацию пыльца березы и эпителий кошки, в то время как среди пищевых аллергенов sIgE-ответ чаще всего вызван аллергенами яйца и молока. Продукцию sIgG4 в основном вызывают пищевые аллергены, в особенности яичный белок. С возрастом доля пациентов с повышенным уровнем sIgE к ингаляционным аллергенам увеличивается, в то время как для большинства пищевых аллергенов характерно снижение доли сенсибилизированных пациентов, за исключением аллергенов моркови, яблока и персика. Перспективы развития технологии биочиповПроведение мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах позволяет охватить практически все области медицинской диагностики. Перспективным направлением развития белковых биочипов видится исследование маркеров воспалительных реакций для дифференциальной диагностики ревматологических, эндокринных заболеваний и других нарушений в работе иммунной системы. В настоящее время более двух тысяч пациентов ДГКБ имени Филатова обследованы с использованием аллергобиочипов. Применительно к педиатрии, помимо выраженного экономического эффекта, обусловленного форматом «один образец — один анализ на чипе», такой подход дает возможность использовать всего 100 мкл сыворотки крови для выявления аллергена, вызывающего у ребенка выраженную реакцию. При обследовании детей раннего возраста использование такого небольшого количества образца — это существенное преимущество. Еще одно многообещающее направление — расширение биочипа для анализа предиктивных маркеров онкологических заболеваний. Ожидается, что развитие нового подхода на основе комплексного анализа комбинаций биомаркеров — сигнатур — позволит решить эту непростую задачу. Из-за стремительного развития технологий полимеразной цепной реакции и платформ секвенирования следующего поколения ДНК-биочипы столкнулись с серьезной конкуренцией. Сегодня они занимают промежуточную нишу в области методик анализа нуклеиновых кислот, подпираемую разнообразными тестами на основе полимеразной цепной реакции, и испытывают все большее давление со стороны высокопроизводительных технологий секвенирования. В случае технологии ИМБ РАН иммобилизация любых типов биомолекул в гидрогеле и возможность проведения в нем разнообразных биохимических реакций открывает перспективы в создании биосенсоров нового поколения. Гидрогелевые элементы станут платформой для иммобилизации ферментов — геномных редакторов — нуклеаз совместно с направляющими и детектирующими молекулами ДНК или РНК. Это позволит создать высокочувствительные биосенсоры, применение которых будет возможно в полевых условиях. Такие комплексные автономные системы на платформе гидрогелевых биочипов позволят получать результаты быстрее, информативнее и точнее, чем сейчас, и будут играть ключевую роль в персонализированной медицине будущего. Заключение Биологические чипы – эффективная технология 21 века, позволяющая быстро и вкомпактном формате анализировать сотни или тысячи образцов одновременно. С помощью биочипов можно быстро и надежно идентифицировать важные внутри-клеточные процессы, анализировать генетическую информацию и обнаруживать биологически значимые молекулы. Литература Кульбаева, Б. Ж. Информационные макромолекулы, Белки и нуклеиновые кислоты. Структура и функции [Электронный ресурс] : учеб.пособие; ЮКГФА. - Электрон.текстовые дан. ( 17,7 Мб). - Шымкент : Б. и., 2011. - 135 с. эл. опт.диск (CD-ROM). Lodich, H. Molecularcell [Электронный ресурс]: научное издание / H. Lodich. - Электрон.текстовые дан. (10,4 Мб). - Б. м. : Б. и., 2003 Генетика. Учебник для ВУЗов/Под ред. Академика РАМН В.И. Иванова – М.: ИКЦ «Академкнига», 2011-638с.: ил. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Н. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов,3-е изд-е, Москва: Наука, 2016, 660с Альбертс Б. ,Брей Д., ХопкинК.Основы молекулярной биологии клетки. Учебное издание. 2-е изд., испр., пер. с англ. 768ст. 2018г. Муминов Т. Основы молекулярной биологии:курс лекций.-Алматы: Эффект, 2007 |